鹿仲健骨汤治疗股骨头坏死模型大鼠：肠道菌群及血清激素变化

doi:10.12307/2024.550

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (35): 5598-5605.doi: 10.12307/2024.550

• 组织构建实验造模 experimental modeling in tissue construction • 上一篇下一篇

鹿仲健骨汤治疗股骨头坏死模型大鼠：肠道菌群及血清激素变化

景田园 1，王平2，王仪2，胡亚楠3，刘善新2，孙国栋4，杜海涛2

1山东现代学院药学院，山东省济南市 250104；2山东省中医药研究院，山东省济南市 250014；3济南生物医药产业研究院，山东省济南市250000；4山东第一医科大学第三附属医院，山东省济南市 250031

收稿日期:2023-08-23 接受日期:2023-10-30 出版日期:2024-12-18 发布日期:2024-03-15
通讯作者: 王平，博士，研究员，山东省中医药研究院，山东省济南市 250014 杜海涛，硕士，研究实习员，山东省中医药研究院，山东省济南市 250014
作者简介:景田园，女，1997年生，山东省济南市人，汉族，硕士，主要从事药理学研究。
基金资助:
山东省重点研发计划(科技示范工程)(2021SFGC1205)，项目负责人：王平；山东省自然科学基金(ZR2020MH386)，项目负责人：王平；中央引导地方科技发展专项基金(YDZX2021117)，项目负责人：王平；济南市“新高校20条”资助项目(202228121)，项目负责人：王平；山东省中央引导地方科技发展资金项目(YDZX20203700002055)，项目负责人：王平

Luzhongjiangu decoction for the treatment of femoral head necrosis in rats: changes in intestinal flora and serum hormones

Jing Tianyuan1, Wang Ping2, Wang Yi2, Hu Yanan3, Liu Shanxin2, Sun Guodong4, Du Haitao2

1Shandong Xiandai University, Jinan 250104, Shandong Province, China; 2Shandong Academy of Chinese Medicine, Jinan 250014, Shandong Province, China; 3Jinan Biopharmaceutical Industry Research Institute, Jinan 250000, Shandong Province, China; 4The Third Affiliated Hospital of Shandong first Medical University, Jinan 250031, Shandong Province, China

Received:2023-08-23 Accepted:2023-10-30 Online:2024-12-18 Published:2024-03-15
Contact: Wang Ping, MD, Researcher, Shandong Academy of Chinese Medicine, Jinan 250014, Shandong Province, China Du Haitao, Master, Research assistant, Shandong Academy of Chinese Medicine, Jinan 250014, Shandong Province, China
About author:Jing Tianyuan, Master, Shandong Xiandai University, Jinan 250104, Shandong Province, China
Supported by:
Shandong Province Key Research & Development Program (Science and Technology Demonstration Project), No. 2021SFGC1205 (to WEP); Natural Science Foundation of Shandong Province, No. ZR2020MH386 (to WP); Special Fund for Centralized Guidance of Local Scientific and Technological Development, No. YDZX2021117 (to WP); "20 New Colleges and Universities" of Jinan City, No. 202228121 (to WP); Centralized Guidance of Local Scientific and Technological Development Fund of Shandong Province, No. YDZX20203700002055 (to WP)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

鹿仲健骨汤：是根据中医理论组建的验方，可补益肝肾、调畅气机、活血通络，对股骨头坏死具有一定疗效，但其成分复杂，在分子层面对骨骼疾病的具体作用机制尚未明晰。
股骨头坏死：指多类型因素导致股骨头部位血供不足、微循环障碍以及骨细胞代谢失衡后所造成的股骨内微结构破坏和功能障碍，最终导致塌陷的难治性骨科疾病，是青壮年残疾常见的原因。

背景：股骨头坏死是一种常见的致残性疾病，主要表现为微循环障碍、骨细胞代谢紊乱。鹿仲健骨汤由山东省中医药研究院研制而成，在临床以汤剂形式使用，对股骨头坏死具有良好疗效，然而其作用机制尚未明确。

目的：基于16S rDNA技术研究鹿仲健骨汤对股骨头坏死模型大鼠肠道菌群的影响，探究其治疗股骨头坏死的作用机制。
方法：采用维甲酸灌胃的方式建立Wistar大鼠股骨头坏死模型，通过股骨头部位骨形态计量学、骨组织病理学和血清激素水平评价鹿仲健骨汤的治疗作用，采用16S rDNA测序技术对空白对照组、模型组及鹿仲健骨汤中剂量组大鼠肠道菌群进行分析，构建相应文库并进行OTU聚类以及微生物群落多样性、丰度等分析，明确肠道菌群的组成及各组间的菌群种类、多样性变化。

结果与结论：①鹿仲健骨汤可以显著提高骨钙素、骨桥蛋白等成骨相关因子的表达，缓解骨小梁的破坏，增加骨密度，对股骨头坏死具有显著的治疗作用，鹿仲健骨汤中剂量组效果最为显著；②肠道菌群测序结果显示，鹿仲健骨汤在一定程度上改善了股骨头坏死大鼠菌群紊乱，共筛选出杆菌门、脱硫弧菌门、脱硫孤菌属、异杆菌属、双歧杆菌属等差异菌落；能上调双歧杆菌等有益菌丰度，下调脱硫弧菌等有害菌丰度，改善肠道菌群结构；③通过功能预测分析发现鹿仲健骨汤治疗股骨头坏死可能主要影响氨基酸代谢、能量代谢等；④相关性分析显示，鹿仲健骨汤中剂量组的差异菌双歧杆菌属(Bifidobacterium)、肠单胞球菌(Intestinimonas)与维生素D3、雌二醇、降钙素呈正相关，与前列腺素E2呈负相关；模型组的差异菌大肠杆菌-志贺氏菌(Escherichia-Shigella)、脱硫孤菌属(Desulfovibrio)、格鲁比卡氏菌属(Globicatella)、链球菌属(Streptococcus)与前列腺素E2呈正相关，与维生素D3、雌二醇、降钙素呈负相关。结果表明：鹿仲健骨汤可能通过调节肠道菌群结构，上调有益菌丰度，影响维生素D3、雌二醇、降钙素及前列腺素E2激素分泌，起到治疗股骨头坏死的作用。

https://orcid.org/0000-0002-7921-6634(景田园)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 鹿仲健骨汤, 股骨头坏死, 16S rDNA, 肠道菌群, 激素, 维生素D3, 雌二醇, 降钙素

Abstract: BACKGROUND: Osteonecrosis of the femoral head is a common and disabling disease, which is mainly characterized by microcirculation disorders and bone cell metabolism disorders. Luzhongjiangu decoction was developed by Shandong Academy of Chinese Medicine and used in the form of soup in the clinic, which has good efficacy in the treatment of osteonecrosis of the femoral head. However, its mechanism of action has not been clarified.
OBJECTIVE: To study the effect mechanism of Luzhongjiangu decoction on intestinal flora in rats with osteonecrosis of the femoral head based on 16S rDNA sequencing technique.
METHODS: The model of osteonecrosis of the femoral head was established in Wistar rats by intragastric administration of retinoic acid. The therapeutic effect of Luzhongjiangu decoction was evaluated by serum hormone, bone histopathology and serum hormone levels. 16s rDNA sequencing technique was used to detect the intestinal flora of rats in the blank control group, model group and middle-dose Luzhongjiangu decoction group. The corresponding library was constructed and OTU clustering and microbial community diversity and abundance analysis were carried out to determine the composition of intestinal flora and the changes of species and diversity among groups.
RESULTS AND CONCLUSION: Luzhongjiangu decoction could significantly increase the expression of osteocalcin, osteopontin and other osteogenic related factors, alleviate the destruction of bone trabeculae, increase bone mineral density, and had a significant therapeutic effect on osteonecrosis of the femoral head, of which the middle dose group showed the most significant effect. The results of intestinal flora sequencing showed that Luzhongjiangu decoction improved the flora disorder of rats with osteonecrosis of the femoral head to some extent, and screened out different colonies such as Bacillus, Desulfurizans, Desulfurization, Isobacteria, Bifidobacterium and so on; it could up-regulate the abundance of beneficial bacteria such as Bifidobacterium, down-regulate the abundance of harmful bacteria such as Desulfovibrio, and improve the structure of intestinal flora. Functional prediction analysis indicated that Luzhongjiangu decoction could mainly affect amino acid metabolism and energy metabolism. Correlation analysis showed that the differential bacteria of Bifidobacterium and Intestinimonas in the middle dose group of Luzhongjiangu decoction were positively correlated with vitamin D3, estradiol and calcitonin, and negatively correlated with prostaglandin E2. In the model group, Escherichia-Shigella, Desulfovibrio, Globicatella and Streptococcus were positively correlated with prostaglandin E2 and negatively correlated with vitamin D3, estradiol and calcitonin. To conclude, Luzhongjiangu decoction may play a role in the treatment of osteonecrosis of the femoral head by regulating the structure of intestinal flora, up-regulating the abundance of beneficial bacteria and affecting the secretion of vitamin D3, estradiol, calcitonin and prostaglandin E2.

Key words: Luzhongjiangu decoction, osteonecrosis of the femoral head, 16S rDNA, intestinal flora, hormone, vitamin D3, estradiol, calcitonin

中图分类号:

景田园, 王平, 王仪, 胡亚楠, 刘善新, 孙国栋, 杜海涛. 鹿仲健骨汤治疗股骨头坏死模型大鼠：肠道菌群及血清激素变化[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(35): 5598-5605.

Jing Tianyuan, Wang Ping, Wang Yi, Hu Yanan, Liu Shanxin, Sun Guodong, Du Haitao. Luzhongjiangu decoction for the treatment of femoral head necrosis in rats: changes in intestinal flora and serum hormones[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(35): 5598-5605.

图/表（结果） 14

2.1 实验动物数量分析初始每组各10只大鼠，在造模过程中出现部分大鼠死亡。选取造模成功的 6 只ONFH模型大鼠和空白对照组、鹿仲健骨汤低、中、高剂量组各6 只大鼠用于实验和分析。
2.2 苏木精-伊红染色结果如图1所示，空白对照组股骨头表面光滑，骨小梁致密、排布均匀；与空白对照组相比，模型组股骨头部位出现明显的骨坏死现象，股骨头表面粗糙，成骨细胞的细胞核收缩，骨小梁稀疏；与模型组相比，鹿仲健骨汤低、中、高剂量组无明显坏死组织，骨组织稀疏度得到改善。

2.3 免疫组化染色结果如图2，3所示，与空白对照组相比，模型组骨钙素、骨桥蛋白、RUNX2蛋白表达显著降低(P < 0.01)；与模型组相比，鹿仲健骨汤低、中、高剂量组骨钙素、骨桥蛋白、RUNX2蛋白表达显著升高，鹿仲健骨汤中剂量组骨钙素、骨桥蛋白、RUNX2蛋白表达最为显著(P < 0.01)。

2.4 各组大鼠血清中激素水平与空白对照组相比，模型组大鼠血清雌二醇、维生素D3及降钙素水平显著降低，前列腺素E2水平显著升高；与模型组相比，鹿仲健骨汤各剂量组雌二醇、维生素D3、降钙素及前列腺素E2水平均出现不同程度的回调，其中鹿仲健骨汤中剂量组回调作用最为显著，见图4。

2.5 鹿仲健骨汤对ONFH模型大鼠肠道菌群的影响
2.5.1 对大鼠肠道菌群α多样性的影响用Chao1和Shannon指数考察各组大鼠菌群α多样性，见图5。结果显示空白对照组与模型组大鼠菌群多样性并未出现显著性改变，鹿仲健骨汤干预后菌群呈增加趋势。

2.5.2 对大鼠肠道菌群β多样性的影响从图6中可以看出空白对照组与模型组明显分离，说明ONFH模型大鼠菌群组成发生改变。鹿仲健骨汤组与空白对照组样本相近，与模型组分离明显，说明鹿仲健骨汤对ONFH大鼠肠道菌群组成调节作用显著。

2.5.3 门水平菌群组成分析如图7所示，各组大鼠的肠道菌群相对丰度发生了改变，在门水平上，各组的优势菌门均为厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidota)、放线菌门(Actinobacteriota)、变形菌门(Proteobacteria)等，其中厚壁菌门丰度最高。如图8所示，与空白对照组相比，模型组大鼠中杆菌门(Patescibacteria)丰度显著上调(P < 0.05)，脱硫弧菌门(Desulfobacterota)丰度显著下调(P < 0.05)；与模型组相比，鹿仲健骨汤中剂量组髌骨细菌门(Patescibacteria)丰度显著降低(P < 0.05)，脱硫弧菌门(Desulfobacterota)丰度显著升高(P < 0.05)。说明ONFH模型大鼠肠道菌群在门水平上出现紊乱，给予鹿仲健骨汤治疗后在一定程度上得到改善。

2.5.4 属水平菌群组成分析由图8可以看出，在属水平上，各组的优势菌门均为毛螺菌科NK4A136属(Lachnospiraceae NK4A136 group)、未分类的厚壁菌(Firmicutes unclassified)、未分类的梭菌属(Clostridiales_unclassified)、未分类的普拉梭菌(Muribaculaceae unclassified)、未分类的梭菌UCG-014菌(Clostridia UCG-014 unclassified)、瘤胃球菌(Ruminococcus)、产粪甾醇真杆菌(Eubacterium coprostanoligenes group unclassified)。
为进一步探究鹿仲健骨汤对ONFH大鼠肠道菌群的影响，对属水平菌群进行细致分析。通过LEfSe分析发现，在属水平上，希拉真杆菌群(Eubacterium siraeum group)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、肠单胞菌属(Intestinimonas)、UCG-005、罗斯氏菌(Rothia)等具有显著差异。与空白对照组相比，模型组UCG-005菌群的LDA分值最大，说明其对空白对照组和模型组之间的差异影响更大，可能是ONFH的标志菌属，而与模型组相比，鹿仲健骨汤组双歧杆菌属(Bifidobacterium)的LDA分值最大，可能是鹿仲健骨汤治疗ONFH的主要菌群，见图9，10。

与空白对照组相比，模型组UCG-005、脱硫孤菌属(Desulfovibrio)、异杆菌属(Allobaculum)、Clostridium sensu stricto 1、多尔氏菌属(Dorea)及链球菌属(Streptococcus)的相对丰度显著上调，希拉真杆菌群、糖假丝酵母菌(Candidatus Saccharimonas)、UCG-010 unclassified、肠单胞菌属及双歧杆菌属的相对丰度显著下调。给予鹿仲健骨汤干预后，对以上菌群的相对丰度有不同程度的回调作用，差异均有显著性意义(P < 0.05)，见图11。

2.6 PICRUSt2功能预测使用PICRUSt软件对模型组及鹿仲健骨汤组富集的KEGG通路进行功能注释，各组之间无显著差异，见图12，13，主要涉及：四环素的生物合成、不饱和脂肪酸的生物合成、黄酮类化合物的生物合成、丙氨酸、MAPK信号通路、β-丙氨酸代谢、苯乙烯的降解、天冬氨酸和谷氨酸代谢、脂肪酸生物合成、泛酸与辅酶A的生物合成、硫代谢、细菌毒素、生物素代谢、异喹啉生物碱的生物合成、初级胆汁酸的生物合成等。

2.7 血清激素水平与差异菌群的相关性分析为进一步探讨肠道菌群与代谢差异物的相关性，采用Spearman相关系数，将雌二醇、维生素D3、前列腺素E2及降钙素与LDA分析的14个差异菌进行相关性分析，见图14。鹿仲健骨汤中剂量组的差异菌双歧杆菌属(Bifidobacterium)、肠单胞球菌(Intestinimonas)与维生素D3、雌二醇、降钙素呈正相关，与前列腺素E2呈负相关。模型组的差异菌大肠杆菌-志贺氏菌(Escherichia-Shigella)、脱硫孤菌属(Desulfovibrio)、格鲁比卡氏菌属(Globicatella)、链球菌属(Streptococcus)与前列腺素E2呈正相关，与维生素D3、雌二醇、降钙素呈负相关。

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引言

股骨头坏死(osteonecrosis of the femoral head，ONFH)是一种常见的致残性疾病，通常疾病进展迅速，大多数受影响的股骨头将在几年内塌陷，不仅带来严重的髋部疼痛，还极大地影响患者的预后[1-2]。目前该疾病逐渐年轻化，给患者和社会造成了沉重的负担，因此亟需研发治疗ONFH的有效药物[3-4]。ONFH的发生发展不是一个单一的过程，传统中医认为其主要病因为骨内淤血、经络阻塞。中药复方治疗非创伤性ONFH具有独特的优势，可有效活血通络、补益肝肾、镇痛、护骨以及改善患者的生活质量[5-7]。鹿仲健骨汤由山东省中医药研究院研制而成，在临床以汤剂形式使用，对ONFH疗效良好，到目前为止尚未见不良反应报告，但其作用机制尚未明确。激素是调节机体正常活动的重要物质，直接或间接地促进或减慢体内原有的代谢过程。研究表明激素参与钙磷代谢及骨代谢过程[8-11]。作者认为调节激素水平或是改善ONFH的重要机制。
肠道菌群在很大程度上决定了宿主的整体健康，诸多疾病的发生都与其结构及代谢的改变有关。目前肠道菌群与骨代谢之间的联系成为研究的热点。肠道微生物群可以作为骨骼发育的一个调节器，有助于调节骨体积与结构的变化[12]。侯伟[13]研究发现激素性ONFH患者存在肠道菌群稳态失调，毛旋菌科、韦荣球菌科、粪球菌科、瘤胃球菌科、梭杆菌门、伯克氏菌属可能是系统性红斑狼疮患者发生激素性ONFH的标志菌群。肠道菌群失调通过影响宿主肠道屏障功能和代谢稳态直接或间接参与ONFH的发生。同时，有研究证实肠道菌群代谢物和肠道细胞分泌的促激素能够入血对靶细胞进行调节，进而影响骨代谢[14]。
该研究建立ONFH模型，通过骨组织病理学、成骨相关蛋白表达、激素水平评价鹿仲健骨汤对ONFH的治疗作用，进一步利用16S rDNA测序技术构建相应文库，应用OTU聚类以及微生物群落多样性、丰度等分析肠道菌群的组成及各组间的菌群种类、多样性变化，并对激素与差异菌进行相关性分析，探究鹿仲健骨汤治疗ONFH的作用机制。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用 LSD 检验。
1.2 时间及地点实验于2022年5月至2023年1月在山东省中医药研究院SPF级实验动物中心完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 8周龄SPF级Wistar大鼠50只，雌性，体质量180-220 g，购自济南朋悦实验动物繁育有限公司，动物合格证号：SCXK [鲁] 20190003，于山东省中医药研究院实验动物中心适应性饲养1周后进行实验，实验所有操作遵循 3R 原则，并得到山东省中医药研究院动物实验伦理学委员会审批，审批号：SDZYY20201201002。
1.3.2 主要试剂鹿仲健骨汤由山东省中医药研究院制备(生产批号：20220925)，药方组成：鹿角胶15 g、独活8 g、桑寄生6 g、防风6 g、川芎6 g、当归6 g、熟地8 g、续断8 g、杜仲8 g、牛膝8 g、炒王不留12 g、大血藤5 g、炙甘草6 g。维甲酸(山东良福制药有限公司，批号200813)；40 g/L多聚甲醛通用性组织固定液(Biosharp，批号22105339)；10% EDTA脱钙液、苏木精-伊红染色套装(武汉赛维尔生物科技有限公司，批号CR2109090、G1003)；骨钙素抗体、骨桥蛋白抗体、RUNX2抗体(武汉赛维尔生物科技有限公司，批号GB11233、GB11500、GB13264)；雌二醇、前列腺素E2、维生素D3、降钙素试剂盒(上海爱萌优宁生物技术有限公司，货号LV20525M、LV20567M、LV20728M、LV20914M)；Pusion Hot start flex 2X Master Mix (上海仪涛生物仪器有限公司，批号M0536L)；DL2000 DNA Maker (宝日医生物技术有限公司，批号3427A)；Qubit dsDNA HS Assay Kit (美国 Thermo Fisher Scientific 公司，批号Q32854)；Biowest Agarose G-10 (上海微科生物技术有限公司，批号111860)；NovaSeq 6000 SP Reagent Kit (美国Illumina公司，批号20028402)。
1.3.3 实验仪器 JB-P5型包埋机、冻台(武汉俊杰电子有限公司)；染色机(DIAPATH)；组织摊片机(浙江省金华市科迪仪器设备有限公司)；病理切片机(上海徕卡仪器有限公司)；X-30R型全能高速冷冻离心机(美国Allegra公司)；A200基因扩增仪(杭州朗基科学仪器有限公司)；EPS300电泳仪(上海天能生命科学有限公司)；凝胶成像仪(上海天能生命科学有限公司)；NovaSeq 6000测序仪(美国Illumina公司)；Agilent 2100生物分析仪(安捷伦科技有限公司)；Qubit荧光计(美国 Thermo Fisher Scientific公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 鹿仲健骨汤制备及剂量设计取鹿仲健骨汤成分中独活、桑寄生、防风、川芎、当归、熟地、续断、杜仲、牛膝、炒王不留、大血藤、炙甘草12味中药饮片，加10倍量水浸泡30 min后，煎煮1 h，过滤；再加8倍量水煎煮45 min，过滤，合并2次滤液，浓缩至1 g/mL，取处方量的鹿角胶粉末烊化加入，4 ℃保存。鹿仲健骨汤成人临床用量为1.46 g/(kg•d)，按照人与大鼠之间等效剂量系数换算，将鹿仲健骨汤临床剂量等效换算成大鼠用药剂量设定为中剂量，其草药制备质量浓度应为0.61 g/mL，低剂量为中剂量的1/2(0.305 g/mL)，高剂量为中剂量的2倍(1.22 g/mL)。
1.4.2 实验动物造模与干预方法 50只雌性Wistar大鼠采用随机单位组设计分组法随机分为空白对照组、模型组、鹿仲健骨汤低剂量组、鹿仲健骨汤中剂量组、鹿仲健骨汤高剂量组，每组10 只。ONFH模型构建参考文献[15]方法，除空白对照组外，其余各组给予70 mg/kg的维甲酸灌胃，1次/d，连续8周，空白对照组灌胃等量生理盐水。8周后在维持造模的同时，鹿仲健骨汤低、中、高剂量组按照0.305，0.61，
1.22 g/mL的剂量灌胃给药，空白对照组、模型组给予等体积生理盐水灌胃，1次/d，持续4周。
1.4.3 苏木精-伊红染色观察股骨头病理学变化最后一次灌胃半小时后取材，收集各组股骨头标本，10% EDTA脱钙液脱钙30 d；石蜡包埋，切片，45 ℃恒温箱中烘干，二甲苯脱蜡，梯度乙醇复水，苏木精染液染色，伊红染液染色，快速梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封固，显微镜下观察股骨头骨组织病理组织学形态的变化。
1.4.4 免疫组化检测成骨能力标志物的抗原成分定位情况取各组待测股骨头蜡块，切片，厚度为5 μm，45 ℃恒温箱中烘干，二甲苯脱蜡，梯度乙醇复水，过氧化氢孵育以消除内源性过氧化物酶的活性，柠檬酸钠抗原修复，5% BSA封闭，一抗(骨钙素、骨桥蛋白、RUNX2抗体)、二抗孵育，AB液孵育，加0.5%二氨基联苯胺反应，苏木精复染，水洗，快速梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封固，显微镜下观察股骨头内成骨能力标志物抗原成分的定位(ABC法)；以胞质染色呈棕褐色为阳性细胞，Image Pro Plus 6.0 软件统计分析。
1.4.5 ELISA试剂盒检测血清中激素水平变化参照文献[16]方法，最后一次灌胃半小时后，麻醉状态下腹主动脉取血，静置2 h，于 4 ℃、3 500 r/min离心10 min，取上层血清，按试剂盒说明书步骤检测雌二醇、维生素D3、前列腺素E2及降钙素水平。
1.4.6 肠道菌群样本采集与处理按照文献[17]取样方法，取出大鼠结肠内容物，存放于无菌处理的离心管中，液氮速冻，-80 ℃保存，用于菌群检测。采用Qubit dsDNA HS Assay Kit试剂盒对样本的基因组DNA进行提取，并进行PCR扩增。PCR产物经纯化、定量和均一化后进行文库构建，构建好的文库经过Qubit和Q-PCR定量，文库合格后，使用NovaSeq 6000 进行上机测序。
1.4.7 生物信息学分析运用Qiime2平台(https://qiime2.org/)中的DADA2方法对序列进行去噪、聚类，通过qiime dada2 denoise-paired调用DADA2进行长度过滤和去噪，获得扩增子序列变体(ASVs)。基于得到的ASV(feature)特征序列和ASV(feature)丰度表格进行α多样性分析和β多样性分析。采用SILVA (Release 138，https://www.arbsilva.de/documentation/release138/)数据库进行序列注释分类，LEfSe分析寻找生物标志物，PICRUSt 2.0软件进行菌群功能代谢预测，寻找差异代谢通路。
1.5 主要观察指标 ①股骨头组织苏木精-伊红染色结果；②股骨头组织骨钙素、骨桥蛋白、RUNX2蛋白表达；③血清激素水平；④肠道菌群的α多样性分析；⑤肠道菌群的β多样性分析；⑥肠道菌群的门水平菌群组成分析；⑦肠道菌群的属水平菌群组成分析；⑧肠道菌群PICRUSt2功能预测；⑨血清激素水平与差异菌群的相关性分析。
1.6 统计学分析采用SPSS 24.0软件进行统计处理，实验数据以x±s表示，采用单因素方差分析进行多组间比较，血清激素水平与差异菌群进行Spearman相关性分析，P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经通过山东省中医药研究院生物统计学专家审核。

讨论

ONFH病程后期发展到股骨头塌陷则只能进行人工髋关节置换治疗，严重降低了患者的生活质量，为社会经济带来了巨大压力，如何预防和干预ONFH的发生是目前研究的热点和难点。中医药具有辨证论治、标本兼治、疗效显著的特点，中药复方在治疗非创伤性ONFH方面具有独特的优势。该研究探讨鹿仲健骨汤在ONFH治疗中的作用及潜在机制。RUNX2是决定成骨细胞谱系的关键转录因子，参与指导成骨细胞分化，它能够诱导终末成骨细胞分化所必需的骨钙素、骨桥蛋白的表达[18]。骨钙素在成骨细胞中特异性表达，是骨骼中最丰富的非胶原蛋白，骨钙素出现在成骨细胞分化的末期，可以与Ca2+结合以调节钙离子稳态和骨骼矿化[19]。骨桥蛋白是骨基质中较丰富的非胶原蛋白之一[20]。骨钙素、骨桥蛋白的表达增加表明骨生成的加速。该研究利用骨组织病理学、成骨相关蛋白表达、血清激素水平等对鹿仲健骨汤的治疗效果进行初步评价，实验结果显示鹿仲健骨汤能提高骨钙素、骨桥蛋白、RUNX2等成骨相关因子的表达，缓解骨小梁的破坏，增加骨密度，对ONFH具有显著的治疗作用，其中鹿仲健骨汤中剂量组效果最为显著。
激素是调节机体正常活动的重要物质，直接或间接地促进或减慢体内原有的代谢过程，是钙磷代谢及骨代谢过程的重要参与者。前列腺素E2是骨改建过程中最重要的脂质介质之一[21]，研究发现低浓度的前列腺素E2可促进成骨细胞增殖，促进小鼠颅骨骨形成，而高浓度前列腺素E2则使破骨细胞超微结构变化并促进骨吸收[22]。雌激素是维持正常骨骼骨量和骨结构的必需激素，骨组织是雌激素作用的重要靶组织，研究表明雌激素主要通过与雌激素受体α作用发挥骨代谢调节作用。雌激素可抑制氧化应激反应[23]，促进成骨细胞增殖，抑制成骨细胞凋亡，延长成骨细胞生存时间[24]，促进胶原合成，促进骨形成蛋白合成，提高骨矿化；成骨细胞与免疫细胞分泌的细胞因子[25]，通过抑制破骨细胞活性，诱导破骨细胞凋亡，维持骨密度，保护骨组织[26]。此外，雌激素可以提高1α羟化酶的活性，使1，25( OH)2D3的合成增加，对降钙素的分泌也具有促进作用。降钙素是一种重要的参与钙磷代谢调节的多肽类激素[26]，能够抑制小肠对钙离子的吸收，降低体内血钙浓度，使血中游离钙沉积于骨组织中，还可直接作用于人成骨细胞，刺激成骨细胞增殖和分化[27]。
此外，降钙素对许多骨代谢疾病所引起的骨痛症状也具有良好的缓解作用[28]。维生素D3是自然存在的类固醇激素，1，25(OH)2D3直接作用于骨的矿物质代谢，促进骨基质形成及类骨质矿化[29]。该研究发现，模型组血清雌二醇、维生素D3及降钙素水平显著降低，前列腺素E2水平显著升高，鹿仲健骨汤各剂量组都具有不同程度的回调作用，因此，作者认为鹿仲健骨汤能够通过调节激素水平，从而起到促进成骨细胞增殖、抑制破骨细胞活性的作用，缓解ONFH症状。
肠道菌群是人体内重要的生态系统，其微生态发生紊乱时可导致机体免疫系统及内分泌系统失衡，从而导致多种疾病的发生。近年来，肠道菌群对人体健康有多维度、动态、复杂、广泛的作用，成为研究的热点[30]。有研究证实肠道菌群与骨质疏松症的发生发展有关，益生菌可通过降低炎性因子的表达、调节肠道通透性、促进钙吸收等多种途径来改善骨质代谢[31-32]。该研究通过探索空白对照组、模型组与鹿仲健骨汤组大鼠肠道菌群间的差异，发现ONFH造模后大鼠肠道菌群丰度发生改变。在属水平，模型组大鼠肠道菌群中糖假丝酵母菌属(Candidatus Saccharimonas)、UCG-010 unclassified、肠单胞菌属(Intestinimonas)及双歧杆菌属(Bifidobacterium)等有益菌属丰度明显降低，而脱硫孤菌属(Desulfovibrio)、异杆菌属(Allobaculum)、难辨梭竣菌属(Clostridium sensu stricto 1)、多尔氏菌属(Dorea)及链球菌属(Streptococcus)等有害菌的丰度明显增加。其中，双歧杆菌属是人体内常见的有益菌属，参与维生素、胆汁酸、三酰甘油等脂肪酸的代谢，能够提高机体免疫力，减少肠道局部的炎性刺激[33-35]。最新研究发现双歧杆菌可减少代谢性炎症的发生，减缓骨质疏松的进程[36]。肠单胞菌是丁酸盐的重要生产者[37]，丁酸盐是肠道菌群产生的一种关键代谢物，能通过加强肠上皮细胞之间的紧密连接、增强黏液层以及促进抗菌肽的产生来增强肠道屏障，防止有害物质进入其他组织及血循环[38-40]。脱硫孤菌属是条件致病菌，能够产生内毒素，诱导炎症的发生，这类病菌的增长可能是推动过度免疫反应的重要因素[41-42]。异杆菌属(Allobaculum)菌种会加剧小鼠结肠炎的发生，并引起抗原特异性的黏膜和全身性抗体反应[43]。难辨梭竣菌属(Clostridium sensu stricto 1)与血清中白细胞介素4、结肠中5-羟色胺、肿瘤坏死因子α和干扰素γ等炎性因子呈正相关，难辨梭竣菌属丰度增加，会导致肠道炎症反应加重[44]。由此推测，ONFH的发生与潜在有益菌丰度的降低及有害菌丰度的增加有关，可能是通过促进肠道炎症反应，调节Treg、Th17等免疫细胞，从而调控破骨细胞分化导致的。与模型组相比，给予鹿仲健骨汤治疗后可显著回调ONFH模型中不同菌群的失调现象，所以推测鹿仲健骨汤可能通过上调双歧杆菌属等有益菌群丰度、下调脱硫弧菌等有害菌的丰度，恢复肠道菌群稳态，发挥治疗ONFH的作用。通过PICRUSt功能预测分析发现，3组大鼠肠道菌群的功能无明显差别，主要包括氨基酸代谢(精氨酸和脯氨酸代谢、丙氨酸、β-丙氨酸代谢、天冬氨酸和谷氨酸代谢)、能量代谢，结合前期的血清代谢组学研究发现，鹿仲健骨汤治疗ONFH的作用可能与氨基酸代谢有密切关系。
肠道菌群作为人体新的“器官”，已被证实与内分泌系统密切相关，内分泌系统可通过影响体内激素的分泌水平和活性来调节骨稳态。PLOTTEL等[45]证明肠道菌群中存在具有雌激素基因组的细菌，它们能通过加速雌激素的解离促进雌激素的再吸收。NAKAMURA等[46]证实雌激素通过与雌激素受体结合，诱导破骨细胞中Fas/FasL通路的激活，直接促进破骨细胞凋亡，抑制骨吸收。钙是骨骼的主要矿物质，钙平衡是影响骨骼稳态的重要因素。在小肠细菌过度生长综合征患者中不仅出现营养缺乏的症状，同时出现骨吸收增强、骨密度降低等骨代谢紊乱，这可能与肠道菌群过增殖导致的营养消耗有关[35]。研究发现健康人服用罗伊氏乳杆菌可以使血清中1，25(OH)2D3含量提高，促进钙吸收[47]。同时，RODRIGUES等[48]证明双歧杆菌可以产生短链脂肪酸，降低肠道pH值，促进矿物质的溶解和钙离子向细胞的转运，进而调节骨密度。研究也证实了肠道菌群可以通过发酵增加短链脂肪酸的浓度，影响肠道pH值及肠壁通透性，增加钙吸收[49]。为了探讨肠道菌群与雌二醇、维生素D3、前列腺素E2及降钙素是否有相关性，该研究对差异菌与雌二醇等激素进行相关分析。结果表明，给予鹿仲健骨汤后双歧杆菌属、肠单胞球菌与维生素D3、雌二醇、降钙素呈正相关，与前列腺素E2呈负相关，而模型组的差异菌大肠杆菌-志贺氏菌(Escherichia-Shigella)、脱硫孤菌属(Desulfovibrio)、格鲁比卡氏菌属(Globicatella)及链球菌属(Streptococcus)与之相反。由此可以推测鹿仲健骨汤可能通过上调双歧杆菌属、肠单胞球菌，促进维生素D3、雌二醇、降钙素的产生，促进骨生成，抑制骨吸收，进一步发挥治疗ONFH的作用。
综上，该研究进一步揭示了鹿仲健骨汤治疗ONFH的作用机制，证实鹿仲健骨汤能上调双歧杆菌属、肠单胞菌属等有益菌种丰度，下调异杆菌属、梭竣菌属等有害菌种丰度，促进维生素D3、雌二醇、降钙素的产生，恢复骨形成/骨吸收平衡，起到治疗ONFH的作用。研究结果充分体现了中药的多靶点、多途径作用特色，为ONFH的防治提供了新的见解。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

鹿仲健骨汤治疗股骨头坏死模型大鼠：肠道菌群及血清激素变化

Luzhongjiangu decoction for the treatment of femoral head necrosis in rats: changes in intestinal flora and serum hormones

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