右归丸治疗腰椎间盘突出症：网络药理学分析活性成分及潜在治疗靶点

doi:10.12307/2024.543

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (27): 4346-4352.doi: 10.12307/2024.543

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右归丸治疗腰椎间盘突出症：网络药理学分析活性成分及潜在治疗靶点

杨敬言1，马涉1，黄仁俊1，杨骁侠2，汤笑尘2，于栋2

1北京中医药大学第三临床医学院，北京市 100029；2北京中医药大学第三附属医院，北京市 100029

收稿日期:2023-09-16 接受日期:2023-11-01 出版日期:2024-09-28 发布日期:2024-01-27
通讯作者: 于栋，博士，主任医师，硕士生导师，北京中医药大学第三附属医院脊柱科，北京市 100029
作者简介:杨敬言，男，1999年生，山西省太原市人，汉族，北京中医药大学在读硕士，主要从事中医骨伤科学方面的研究。
基金资助:
北京中医药大学第三附属医院2022年度院内培育项目(BZYSY-2022-PYMS-18)，项目负责人：于栋

Yougui Pill in the treatment of lumbar disc herniation: network pharmacological analysis of active ingredients and potential targets

Yang Jingyan1, Ma She1, Huang Renjun1, Yang Xiaoxia2, Tang Xiaochen2, Yu Dong2

1The Third Clinical School of Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China; 2The Third Clinical Hospital of Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China

Received:2023-09-16 Accepted:2023-11-01 Online:2024-09-28 Published:2024-01-27
Contact: Yu Dong, MD, Chief physician, Master supervisor, The Third Clinical Hospital of Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China
About author:Yang Jingyan, Master candidate, The Third Clinical School of Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China
Supported by:
The 2022 In-hospital Cultivation Project of the Third Affiliated Hospital of Beijing University of Chinese Medicine, No. BZYSY-2022-PYMS-18 (to YD)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

网络药理学：是一种通过分析药物结构及规律，联合疾病基因共同构建药物-成分-靶点-疾病网络，探究药物活性成分、潜在作用靶点，筛选调节信号通路，可提高药物的治疗效果、降低毒副作用的研究方法。

分子对接实验：是通过确定药物分子和靶分子间的相互作用来辅助药物设计的研究方法，有助于提示中草药的药理作用机制，如抗炎、抗氧化等分子机制，为中草药的药效预测与设计提供依据。

背景：右归丸具有温肾助阳、益精填髓的作用，临床多用于治疗肾阳虚证的腰椎间盘突出症且具有较好的疗效。
目的：采用网络药理学、分子对接技术并结合动物实验探讨右归丸治疗腰椎间盘突出症的潜在靶点及作用机制。
方法：①网络药理学分析：通过TCMSP等数据库获取经过筛选后的右归丸有效成分与作用基因靶点，在GeneCards等数据库中收集与腰椎间盘突出症相关的基因，取二者交集进行拓扑结构分析，得到主要活性成分及核心治疗靶点。使用R软件对核心治疗靶点进行GO功能及KEGG通路富集分析。②分子对接：运用Autodock和Pymol软件进行中药活性成分与核心治疗靶点分子结合能预测。③动物实验：将18只SD大鼠随机分为对照组、退变组与退变+右归丸组，每组6只。取退变组与退变+右归丸组大鼠，采用纤维穿刺法制备椎间盘退行性变模型，造模后2周，退变+右归丸组大鼠给予右归丸汤剂(1次/d)灌胃，连续给药2周。给药结束后，采用ELISA法检测血清中肿瘤坏死因子α质量浓度，苏木精-伊红染色后观察椎间盘纤维环及髓核细胞的形态学改变。

结果与结论：①筛选出右归丸有90种活性成分和64种靶点，且主要活性成分为槲皮素、山奈酚、β-胡萝卜素、大豆黄素，4′-O-甲基尼亚萨酚。右归丸治疗腰椎间盘突出症的核心靶点为白细胞介素6、肿瘤坏死因子α、AKT1、白细胞介素1B、血管内皮生长因子A。富集分析发现，交集基因可能通过白细胞介素17、肿瘤坏死因子、MAPK、PI3K-AKT等信号通路改善椎间盘退变。②分子对接实验验证了右归丸中的槲皮素、山奈酚、β-胡萝卜素等与核心靶点有较强的结合能力。③动物实验结果显示，退变组大鼠血清肿瘤坏死因子α质量浓度高于对照组(P < 0.05)，退变+右归丸组大鼠血清肿瘤坏死因子α质量浓度低于退变组(P < 0.05)；苏木精-伊红染色显示，退变组大鼠椎间盘纤维环、髓核结构遭到破坏，髓核细胞数量减少；退变+右归丸组大鼠椎间盘纤维环可见重建趋势，髓核细胞数量较退变组增加。④结果表明，右归丸可能通过槲皮素、山奈酚、β-胡萝卜素等主要活性成分作用于肿瘤坏死因子α等核心靶点改善椎间盘退变，进而治疗腰椎间盘突出症。

https://orcid.org/0009-0004-4123-2841(杨敬言)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 右归丸, 腰椎间盘突出症, 网络药理学, 分子对接, 信号通路, 炎症因子, 潜在靶点, 纤维环穿刺

Abstract: BACKGROUND: Yougui Pill is a famous formula of the Chinese traditional medicine, which has good efficacy for lumbar disc herniation due to kidney yang insufficiency.
OBJECTIVE: To investigate the potential targets and mechanism of action of Yougui Pill in the treatment of lumbar disc herniation by using network pharmacology and molecular docking technology, and verified by animal experiments.
METHODS: (1) Network pharmacological analysis: We obtained the active ingredients and targets of Yougui Pill from TCMSP and other databases, collected genes related to lumbar disc herniation from GeneCards database, and took the intersection of the two for the topological analysis to derive the main active ingredients and core therapeutic targets. Gene ontology function analysis and Kyoto encyclopedia of genes and genomes pathway enrichment analysis were performed using R software. (2) Molecular docking: Autodock and Pymol software were utilized for the prediction of molecular binding energy of TCM active ingredients to core therapeutic targets. (3) Animal experiments: Eighteen Sprague-Dawley rats were randomly divided into a control group, a degeneration group and a Yougui Pill group, with 6 rats in each group. A rat model of intervertebral disc degeneration was prepared by fiber puncture method in the degeneration and Yougui Pill groups. At 2 weeks after modeling, Yougui Pill was given by gavage in the Yougui Pill group, once a day for 2 consecutive weeks. The level of tumor necrosis factor-α in serum was detected by the ELISA method, and morphological changes of the annulus fibrosus and nucleus pulposus cells were observed using hematoxylin-eosin staining.
RESULTS AND CONCLUSION: There were 90 active ingredients and 64 targets, and the main active ingredients were found to be quercetin, kaempferol, β-carotene, soybean flavonoid, and 4'-O-methylnyasol. The core targets of Yougui Pill for the treatment of lumbar disc herniation were interleukin 6, tumor necrosis factor-α, AKT1, interleukin 1B, and vascular endothelial growth factor A. Enrichment analysis revealed that the intersecting genes might be expressed through the interleukin-17 signaling pathway, tumor necrosis factor signaling pathway, MAPK signaling pathway, PI3K-AKT signaling pathway, and other signaling pathways to improve intervertebral disc degeneration. The molecular docking test verified that quercetin, kaempferol, and β-carotene had strong binding ability to the core targets. Animal experiments showed that the level of serum tumor necrosis factor α in the degeneration group was higher than that in the control group (P < 0.05), and the level of serum tumor necrosis factor α in the Yougui Pill group was lower than that in the degeneration group (P < 0.05). Hematoxylin-eosin staining showed that the fibrous annulus of the intervertebral discs and the structure of the nucleus pulposus in the degeneration group were destroyed, and the number of nucleus pulposus cells was reduced; there was a tendency to reconstructing the fibrous annulus of the intervertebral discs in the Yougui Pill group, and the number of nucleus pulposus cells increased compared with the degeneration group. To conclude, Yougui Pill may treat lumbar disc herniation by improving disc degeneration through the effects of quercetin, kaempferol, beta-carotene and other key active ingredients on core targets such as tumor necrosis factor.

Key words: Yougui Pill, lumbar disc herniation, network pharmacology, molecular docking, signaling pathway, inflammatory factor, potential target, annulus fibrosus puncture

中图分类号:

杨敬言, 马涉, 黄仁俊, 杨骁侠, 汤笑尘, 于栋. 右归丸治疗腰椎间盘突出症：网络药理学分析活性成分及潜在治疗靶点[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(27): 4346-4352.

Yang Jingyan, Ma She, Huang Renjun, Yang Xiaoxia, Tang Xiaochen, Yu Dong. Yougui Pill in the treatment of lumbar disc herniation: network pharmacological analysis of active ingredients and potential targets[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(27): 4346-4352.

图/表（结果） 8

2.1 右归丸有效成分及作用靶点信息收集通过TCMSP、TCMID平台检索符合标准的右归丸有效活性成分，剔除重复值后共138个。其中，当归有效成分6个，作用靶点52个；杜仲有效成分33个，作用靶点217个；附子有效成分8个，作用靶点33个；枸杞子有效成分50个，作用靶点200个；鹿角胶有效成分2个，作用靶点14个；肉桂有效成分12个，作用靶点67个；山药有效成分14个，作用靶点71个；山茱萸有效成分37个，作用靶点91个；熟地黄有效成分11个，作用靶点45个；菟丝子有效成分12个，作用靶点200个。将所获得的活性成分导入Uniprot数据库进行基因标准化，去除重复值共得到作用靶点基因308个。
2.2 腰椎间盘突出症靶点的收集通过GenCards数据库共获得发病相关靶点585个，OMIM数据库获得发病相关靶点51个，剔除重复值后共收集得到腰椎间盘突出症潜在靶基因630个。
2.3 中药-疾病交集基因韦恩图通过计算得到右归丸与腰椎间盘突出症的交集靶点共64个，右归丸可能通过这64个交集基因治疗腰椎间盘突出症，使用R包对结果绘图可视化，见图2。

2.4 中药活性成分-交集靶点网络分析将64个交集靶点所对应的中药活性成分，运用Cytoscape 3.7.0软件构建中药-活性成分-靶基因网络，见图3，网络中共有包含90个活性成分，64个作用靶点。在该网络图中，节点代表药物活性成分、交集靶点；边代表药物活性成分与交集靶点之间的作用关系；与每一节点相连的其他节点数目即该节点的度值(degree)，节点的度值越大其在网络图中越重要。这一步可明确右归丸治疗腰椎间盘突出症的重要活性成分。经过和核心靶基因对比筛选，获得degree值排名前5的核心中药活性成分信息及对应靶点数目，见表1。

2.5 PPI网络分析将得到交集基因信息导入在线数据库STRING，筛选minimum required interaction大于0.4的节点，去除无关联的单个节点，获得的剩余节点及关系导入Cytoscape 3.7.0软件绘制PPI网络，见图4。得到的网络图由64个节点和1 251条边组成；进一步按degree值进行筛选，根据“中药活性成分-交集靶点网络”网络与PPI网络中的关键作用靶点相互映射，推测右归丸的有效成分可能通过白细胞介素6(degree值59)、肿瘤坏死因子α(degree值58)、AKT1(degree值58)、白细胞介素1B(degree值58)、血管内皮生长因子A(degree值56)这5个核心靶点发挥改善腰椎间盘突出症的作用。

2.6 分子对接实验结果分子对接结果显示，槲皮素、山奈酚、β-胡萝卜素、大豆黄素、4′-O-甲基尼亚萨酚5个活性成分与核心靶点白细胞介素6、肿瘤坏死因子α、AKT1、白细胞介素1B、血管内皮生长因子A均存在结合位点，其对应的最低结合能均小于-5.5 kJ/mol，见表2。其中槲皮素与山奈酚对各个核心靶点之间的结合亲和力较好，提示这个活性成分在右归丸治疗腰椎间盘突出症中起着较为重要的作用。通过Pymol将6个结合较好的对接结果进行可视化，见图5。

2.7 动物实验验证结果许多实验证实肿瘤坏死因子α是腰椎间盘突出症发生机制中重要的致炎因子，并且是神经根损伤过程中最重要的细胞因子，临床上可以借助外周血肿瘤坏死因子α水平检测作为椎间盘突出症病情变化、临床治疗以及预后判断的一种方法。故此次实验选取预测degree值排名第二的核心靶点肿瘤坏死因子α为代表进行初步验证[18]。实验结果显示，对照组、退变组、退变+右归丸组大鼠血清肿瘤坏死因子α质量浓度分别为(12.38±3.05)，(52.65±1.51)，(34.97±3.20) ng/L，组间两两比较差异有显著性意义(P < 0.05)。
苏木精-伊红染色显示，对照组大鼠椎间盘纤维环完整，排列整齐，髓核圆形且饱满，髓核细胞丰富，髓核组织和纤维环的边界清晰；退变组大鼠椎间盘纤维环、髓核结构遭到破坏，可见大量圆形的软骨细胞增生，髓核组织和纤维环界限不清，排列紊乱；退变+右归丸组大鼠椎间盘纤维环可见重建趋势，排列稍紊乱，胶原纤维断裂或波浪状排列，正常髓核细胞数量较退变组增多，见图6。这些实验结果表明，在右归丸干预下大鼠椎间盘退行性变模型中的肿瘤坏死因子α含量降低、炎症反应被抑制，退行性变得到改善，右归丸在动物体内对椎间盘退变具有保护作用。

2.8 靶基因功能分析通过对交集基因进行GO富集分析发现，在生物过程中(BP)，主要涉及脂多糖反应(response to lipopolusaccharide)、化学应激反应(cellular response to chemical stress)、细胞来源分子反应(response to molecule of bacterial origin)、氧化应激反应(response to oxidative stress)等；在细胞组分(CC)中，主要涉及细胞膜筏(membrane raft)、细胞膜微区(membrane microdomain)、胶原容器(collagen-containing extracellular matrix)等；在分子功能(MF)中，主要涉及蛋白结合(protein binding)、酶结合(enzyme binding)、锌离子结合(zinc ion binding)、细胞因子活性(cytokine activity)、蛋白激酶结合(protein kinase binding)，见图7。KEGG功能富集分析结果显示右归丸治疗腰椎间盘突出症主要涉及白细胞介素17、肿瘤坏死因子、PI3K-AKT等信号通路。

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引言

腰椎间盘突出症是临床常见的脊柱疾病，主要病理表现为椎间盘突出、脱出等，临床主要症状为腰痛及下肢的放射痛等[1-2]。椎间盘退行性变是腰椎间盘突出症的关键病理学基础，病理实质为椎间盘水分减少、纤维环和髓弹性减退[3]、吸收与分散压力的功能下降，伴随着炎性细胞的浸润，在外力作用下纤维环破裂、髓核突出，刺激或压迫神经，从而发展为腰椎间盘突出症[4]。腰椎间盘突出症的发病呈普遍化、年轻化的趋势，并且发病率在逐年升高，严重影响患者的生活质量[5]。
在中医理论中腰椎间盘突出症的症状多归属“腰痹”等范畴，病机与肝、脾、肾有关，常见证型为肾阳虚[6-7]。《素问•脉要精微论》云：“腰者，肾之府，转摇不能，肾将惫矣”，右归丸为明代温补学派张仲景的经典名方，当代众多医家运用该方及加减化裁治疗腰椎间盘突出症取得了良好的临床效果[8-10]。但目前右归丸治疗腰椎间盘突出症的相关核心成分与核心靶点仍待筛选，治疗作用机制有待探讨。网络药理学通过构建多层次网络系统揭示药物与疾病靶点之间的关系，从现代药理学的角度观察药物对疾病的干预和影响[11]。这种整体性、系统性的研究策略符合中医学的整体观念，为现代医学解读中医学提供了一条新途径[12]。
为探讨右归丸的作用机制，此次研究运用网络药理学方法对右归丸中各单味药的有效成分和治疗靶点进行收集与筛选，检索腰椎间盘突出症发病有关联的疾病靶点，分析并预测右归丸治疗腰椎间盘突出症的潜在核心作用靶点与核心成分，分析相关的作用通路并进行分子对接研究与动物实验验证，为后续研究提供参考。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计运用网络药理学收集右归丸在腰椎间盘突出症治疗中的靶点，结合网络拓扑结构分析得出的活性成分与核心治疗靶点，通过GO富集分析与KEGG预测核心靶点的治疗机制，进而进行分子对接试验与动物实验的验证。
1.2 时间及地点实验于2023年3-7月在北京中医药大学基础实验室完成。
1.3 资料
1.3.1 生物信息数据库及分析工具 TCMSP数据库(https://tcmsp-e.com)，TCMID数据库(https://bidd.group/TCMID)，Uniprot数据库(https://www.uniprot.org/)，GeneCards数据库(https://www.genecards.org)，OMIM数据库(https://www.genecards.org)，STRING数据库(https://www.genecards.org)，Pubchem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)。Cytoscape 3.7.0软件[13]，Cytoscape 3.9.1软件，Wordoffice软件，AutoDocktools 1.5.7软件，SPSS 25.0统计软件。
1.3.2 实验动物 56-62 d龄健康雄性SD大鼠20只，SPF级，体质量180-220 g，购买于斯贝福生物技术有限公司，适应性饲养1周后进行实验。实验动物均受人道对待，符合美国国立卫生院颁布的《实验动物管理和使用指南》。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。实验方案经北京中医药大学实验动物伦理分委员会批准，批准号：BUCM-1-2023010501-0003。
1.3.3 实验药品与试剂右归丸药物组成：熟地黄24 g，鹿角胶、山药、杜仲、菟丝子各12 g，山茱萸、当归、枸杞子各 9 g，附子、肉桂各6 g，购自北京中医药大学第三附属医院药剂科，煎煮并制成质量浓度为2 g/mL的右归丸药液，于4 ℃冰箱保存；头孢呋辛钠(山东润泽制药有限公司)；大鼠肿瘤坏死因子α ELISA试剂盒(上海江莱生物科技有限公司)；无水乙醇、二甲苯、中性树胶(国药集团化学试剂有限公司)；PBS(北京基谱生物科技有限公司)。
1.3.4 主要仪器 BioTek-ELx800酶标仪；Thermo3111恒温箱；全自动脱水机、冰冻切片机、石蜡包埋机、病理取材机、烘烤漂片机(沈阳誉德电子仪器有限公司)；石蜡切片机(美国莱卡)；载玻片、盖玻片(江苏世泰实验器材有限公司)；温控遥床(其林贝尔)；组化笔(Vectort)；倒置荧光显微镜(日本尼康)；全景扫描仪(3D HISTECH)。
1.4 方法
1.4.1 右归丸主要成分和药物靶点的筛选利用TCMSP数据库和TCMID数据库收集右归丸中各味中药相关的活性成分，以口服生物利用度≥20%和类药性≥0.1为筛选标准[14]，收集得到活性成分的靶点后通过Uniprot数据库进行蛋白靶点标志的转化与规范，去除重复靶点后得到右归丸靶点数据集。
1.4.2 腰椎间盘突出症发病基因的收集和靶基因的收集登录GeneCards数据库和OMIM数据库，以“lumbar disc herniation”为关键词，检索筛选出疾病相关基因，通过Uniprot数据库进行确认并转换后删除重复靶点，整理成腰椎间盘突出症疾病靶点数据库。
1.4.3 中药活性成分-交集靶点网络构建将各单味中药活性成分相关靶点与疾病相关靶点取交集，通过韦恩图将其可视化，并利用Cytoscape 3.9.1软件绘制中药活性成分-交集靶点网络图。
1.4.4 PPI网络的构建和核心靶点的筛选将交集基因导入STRING数据库，筛选排除最小相关分数大于0.4的节点后将剩余节点及相互作用关系导入Cytoscape 3.9.1软件绘制PPI网络图，计算每个节点的degree值筛选得出核心靶点。
1.4.5 靶点基因生物信息富集分析采用R软件，以P < 0.05、q < 0.05为条件，对筛选出来的核心靶点进行GO(Gene Ontology)功能和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路富集分析。
1.4.6 分子对接实验将各单味中药活性成分输入Pubchem数据库获取相关的结构文件，与从Uniprot数据库下载核心靶点的结构文件结合，使用Autodock对接蛋白质分子与配体，计算分子对接的结合能并通过Pymol对对接结果可视化。
1.4.7 动物实验验证采用随机数字表法将20只SD大鼠分为对照组6只、模型组14只。对照组大鼠不做任何处理，常规饲养。
大鼠腰椎间盘退行性变模型的制备：取模型组大鼠，采用纤维环穿刺法制作腰椎间盘退行性变模型[15-16]。大鼠术前禁食水12 h，称体质量，腹腔注射3%戊巴比妥钠(30 mg/kg)进行麻醉，待麻醉起效后剃除选取的节段脊柱区毛发进行备皮，清洁处理后使大鼠呈仰卧位并进行四肢固定，消毒后铺洞巾，再于相应节段腹部的前正中线右侧旁开0.5 cm处作一纵行切口，暴露腹后壁，保护好肠管及下腔静脉，将脏器移至体外备皮消毒区，从脊柱附着点上缓慢剥离腰大肌，暴露L4/5、L5/6椎间盘(髂嵴平对L5/6椎间盘或L6椎体)，在确定环状纤维后使用注射器挑破纤维环，见图1。穿刺成功后，检查脏器无出血、无破溃及腹膜完整后，将脏器安置回腹腔并消毒，在伤口处涂抹适量头孢呋辛钠以预防感染，将肌肉、筋膜和皮肤等创口逐层关闭。术后大鼠单笼饲养，连续3 d肌内注射青霉素以防感染，每只大鼠4×104 U/d。待大鼠苏醒后定期观察步态及进食饮水情况，密切关注有无尿粪潴留、下肢活动不利及障碍、切口感染等。造模2周后随机选取2只大鼠，取椎间盘组织进行苏木精-伊红染色，光学镜下观察髓核细胞减少、纤维软骨部分消失并且被周围组织取代、纤维环出现裂隙且排列紊乱，表示造模成功[17]。

造模后分组与处理：造模2周后，将造模成功的12只大鼠再随机分为退变组、退变+右归丸组，每组6只。退变+右归丸组大鼠予右归丸汤剂灌胃(10 mg/kg)，1次/d，连续给药2周。

取材：给药结束后以脊椎脱臼法处死所有大鼠，收集腹主动脉血10 mL，采用ELISA法检测血清中肿瘤坏死因子α质量浓度；取出对应节段椎间盘标本，投入40 g/L多聚甲醛中固定，入梯队乙醇脱水处理，再进行无水乙醇二甲苯中透明处理，随后进行浸蜡包埋、切片、烘烤、脱蜡、脱二甲苯、洗去乙醇、苏木精染色、氨水溶液返蓝、伊红染液染色等步骤，最后中性树胶封固，取景拍照。
1.5 主要观察指标右归丸有效成分与腰椎间盘突出症相关基因的筛选，验证右归丸抑制腰椎间盘退变大鼠的炎症反应，对动物腰椎退行性变的改善效果。
1.6 统计学分析运用EXCEL建立数据库，将数据整理后录入。运用IBM SPSS 26.0软件进行统计学分析，计量资料采取x±s表示，根据数据方差齐性和和正态分布情况，比较运用t检验、重复测量方差分析。以P < 0.05为差异有显著性意义。该文统计学方法已经北京中医药大学生物统计学专家审核。

讨论

祖国医学并无专门“腰椎间盘突出症”的病名，但其症状可归于“痹症”“腰痛”等病名的范畴，其临床表现在《医学心悟》中有述 “腰痛拘急，牵引腿足”，《灵枢 •经脉》有论“项如拔，脊痛，腰似折，髀不可以曲，胭如结，踹如裂，是为踝厥 ”，说明在中医药发展史上对该疾病的记载是较为全面的。临床普遍认为腰椎间盘突出症的发病机制是随着年龄的增长、伴随日久的活动使得脊柱处于过度负荷状态，椎间盘内部结构承受着增加的总体压力与相对不均匀的受力，导致纤维环受到自内向外的压力而变得脆弱[19]，在外力刺激下日久而突出压迫神经，引起相关症状。而右归丸治疗肾阳虚证类疾病的临床应用广泛，当代医家应用该组方药治疗肾阳虚为主的腰椎间盘突出症疗效确切[20]。
通过网络药理学分析显示，右归丸组方中杜仲、枸杞子及菟丝子所含的5种主要活性成分槲皮素、山奈酚、β–胡萝卜素、大豆黄素、4′-O-甲基尼亚萨酚，在腰椎间盘突出症治疗中发挥作用的潜在为核心靶点为白细胞介素6、肿瘤坏死因子α、AKT1、白细胞介素1B、血管内皮生长因子A。槲皮素是一种植物类黄酮，也是一种天然的抗氧化剂，可通过抑制氧化应激、纤维化、炎症反应、细胞凋亡以及改变有丝分裂周期等来保护动物机体受到的损伤、逆转或延缓疾病的发生[21-22]。相关研究表示，槲皮素能通过p65核因子κB、p38 MAPK、Nrf2-ARE、MAPKs和肿瘤坏死因子信号通路来对动物病理上受到的炎症损伤与应激反应进行正向调节，以减少细胞凋亡来实现保护作用[23]。山奈酚是一种能够通过调节促炎酶活性和炎症相关基因表达、抑制转录因子、黏附分子及基质金属蛋白酶等途径来进行抗炎镇痛的黄酮类化合物，在风湿性关节炎治疗中，山奈酚可抑制肿瘤坏死因子α、白细胞介素1、白细胞介素6等炎性因子的合成与释放[24]；在炎症性肠病治疗中，山奈酚的抗氧化性可以减少白细胞的活性，从而减轻炎症反应[25]。山奈酚作为新型抗炎药物的分子机制仍待研究。β–胡萝卜素是类胡萝卜素中的一种，具有维生素原A和强抗氧化剂的双重活性，对于多种疾病有着良好的保护作用[26]。4′-O-甲基尼亚萨酚是一种多由鸢尾分离出来的化合物，是鸢尾提取物的重要组成部分[27]。以往的生物学研究表明，以4′-O-甲基尼亚萨酚为主要成分的提取物具有抗炎[28]、抗菌[29]、抗病毒[30]、抗氧化等作用[31]，在一定程度上能有效预防和治疗糖尿病、抗酒精对人体造成的伤害[32]，有研究表明该提取物有很强的抗炎效果[33]。大豆黄素为异黄酮类中药单体，有研究认为其可能通过抑制下丘脑-垂体-肾上腺轴功能来改善抑郁行为，并且对相关应激模型有缓解和保护作用[34]。依据GO分析结果，右归丸中关键化合物成分主要是通过基因表达的正调控、细胞增殖的负调控、信号传导、炎症反应调控参与细胞外间隙、细胞核、细胞质等细胞组分，从而对蛋白结合、酶结合、锌离子结合、细胞因子活性、蛋白激酶结合等分子功能产生影响来发挥治疗腰椎间盘突出症的功效。
此次富集分析发现，交集基因可能通过白细胞介素17、肿瘤坏死因子、MAPK、PI3K-AKT等信号通路改善椎间盘退变。分子对接实验验证了槲皮素、山奈酚、β–胡萝卜素等与核心靶点有较强的结合能力。经过PPI作用网络分析得出核心靶点为白细胞介素6、肿瘤坏死因子α、AKT1、白细胞介素1B、血管内皮生长因子A。AKT1是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，它通过一系列下游底物参与了包括细胞生长、血管生成、胰岛素信号传导、代谢等生物学过程。相关研究表明，在参与椎间盘退变的过程中AKT1与其他亚型在其中具有协同作用，并且与急性而非慢性炎症及吞噬作用有关，在腰椎间盘突出症的发病机制中作用确切[35]。血管内皮生长因子A是一种糖基化的有丝分裂原，专门作用于内皮细胞且具有介导血管通透性增加、诱导血管生成、抑制细胞凋亡等作用。有研究通过压迫椎体终板的血管芽来验证椎间盘退变时血管内皮生长因子A的表达[36]，结果表明血管内皮生长因子A及其受体的下调与椎间盘的压缩负荷呈正相关，是动态负荷的机制之一。白细胞介素6、肿瘤坏死因子α、白细胞介素1B的水平变化是椎间盘相关疾病的核心因素，这些细胞因子促进细胞外基质降解、趋化因子产生和椎间盘细胞表型的变化，由此产生的分解代谢和合成代谢反应的不平衡导致椎间盘组织的退化以及椎间盘突出和神经根疼痛，从退化椎间盘释放趋化因子促进免疫细胞的浸润和活化，进一步放大炎症级联反应[37]。其中肿瘤坏死因子α是一种在各项研究中广泛存在的炎性因子，其在腰椎间盘突出症的患者中起着主要的炎性作用，同时其表达水平也与腰椎间盘突出症造成的疼痛有显著性关联[38]，它可直接侵入神经根阻滞产生神经根疼痛效应，从而继续加剧炎症因子的释放，从而被认为是腰椎间盘突出症的客观疗效指标[39]。龙骁[40]发现退变的椎间盘软骨板中肿瘤坏死因子α含量明显高于正常组，表明肿瘤坏死因子α在椎间盘的退变中有着重要作用，是造成腰椎间盘突出症的主要原因。王亮等[41]的研究表明随着腰椎间盘突出的程度加重，肿瘤坏死因子α的含量也逐渐升高，更是表明肿瘤坏死因子α与腰椎间盘的退变有着重要联系。此次动物实验显示，退变+右归丸组大鼠椎间盘中排列失序的纤维环可见重建趋势，髓核细胞数量增多，表明右归丸在腰椎间盘突出症的治疗中可以修复破损的纤维环、重整髓核组织和纤维环的序列、加快髓核细胞再生；同时通过抑制肿瘤坏死因子α因子的表达来缓解炎症，进而初步证明右归丸通过下调肿瘤坏死因子α的表达启动以肿瘤坏死因子为主的信号通路，有效改善大鼠椎间盘退行性变的退变趋势，重建纤维环，促进髓核细胞增殖。
综上，此次研究结合网络药理学分析、分子对接实验和动物实验验证的方法，初步探讨了右归丸治疗腰椎间盘突出症可能的机制，发现与抗炎镇痛、组织修复等作用密切相关，验证了右归丸对行纤维环穿刺建立的椎间盘退行性变模型的抗炎及改善椎间盘退变作用。上述结果说明，右归丸在腰椎间盘突出症的治疗中主要通过抗炎及促进组织修复发挥切实的治疗作用，这为进一步开展腰椎间盘突出症的活性成分验证及更多潜在治疗靶点研究提供了重要参考。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

右归丸治疗腰椎间盘突出症：网络药理学分析活性成分及潜在治疗靶点

Yougui Pill in the treatment of lumbar disc herniation: network pharmacological analysis of active ingredients and potential targets

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