阿仑膦酸钠治疗骨质疏松模型大鼠机制的串联质量标签蛋白质组学分析

doi:10.12307/2024.355

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (16): 2505-2511.doi: 10.12307/2024.355

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阿仑膦酸钠治疗骨质疏松模型大鼠机制的串联质量标签蛋白质组学分析

黄惠敏1，2，谢冰颖1，2，黄景文2，3，黄小彬2，3，谢丽华2，3，李生强2，3，葛继荣2，3

1福建中医药大学，福建省福州市 350003；2福建省中医药科学院基础研究所，福建省福州市 350003；3福建省中西医结合防治骨质疏松重点实验室(福建省中医药科学院，福建中医药大学附属康复医院)，福建省福州市 350003

收稿日期:2023-04-25 接受日期:2023-06-19 出版日期:2024-06-08 发布日期:2023-07-29
通讯作者: 李生强，博士，研究员，福建省中医药科学院基础研究所，福建省福州市 350003；福建省中西医结合防治骨质疏松重点实验室(福建省中医药科学院，福建中医药大学附属康复医院)，福建省福州市 350003
作者简介:黄惠敏，女，1995年生，广西壮族自治区贵港市人，壮族，福建中医药大学在读硕士，主要从事中医药防治骨质疏松的研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(81774350)，项目负责人：李生强；福建省自然科学基金项目(2021J01915)，项目负责人：李生强；福建省中医药科研项目计划(2021zylc42)，项目负责人：李生强

Protective mechanism of alendronate granule in a rat osteoporosis model based on TMT proteomic analysis

Huang Huimin1, 2, Xie Bingying1, 2, Huang Jingwen2, 3, Huang Xiaobin2, 3, Xie Lihua2, 3, Li Shengqiang2, 3, Ge Jirong2, 3

1Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350003, Fujian Province, China; 2Institute of Basic Research, Fujian Academy of Chinese Medicine Science, Fuzhou 350003, Fujian Province, China; 3Key Laboratory of Combined Traditional Chinese and Western Medicine for Prevention and Treatment of Osteoporosis (Fujian Academy of Chinese Medicine Science, Rehabilitation Hospital Affiliated to Fujian University of Traditional Chinese Medicine), Fuzhou 350003, Fujian Province, China

Received:2023-04-25 Accepted:2023-06-19 Online:2024-06-08 Published:2023-07-29
Contact: Li Shengqiang, MD, Researcher, Institute of Basic Research, Fujian Academy of Chinese Medicine Science, Fuzhou 350003, Fujian Province, China; Key Laboratory of Combined Traditional Chinese and Western Medicine for Prevention and Treatment of Osteoporosis (Fujian Academy of Chinese Medicine Science, Rehabilitation Hospital Affiliated to Fujian University of Traditional Chinese Medicine), Fuzhou 350003, Fujian Province, China
About author:Huang Huimin, Master candidate, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350003, Fujian Province, China; Institute of Basic Research, Fujian Academy of Chinese Medicine Science, Fuzhou 350003, Fujian Province, China
Supported by:
National Natural Science Foundation of China, No. 81774350 (to LSQ); Natural Science Foundation of Fujian Province, No. 2021J01915 (to LSQ); Chinese Medicine Research Project Plan of Fujian Province, No. 2021zylc42 (to LSQ)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

串联质量标签蛋白质组学：又名TMT蛋白组学，TMT (Tandem mass tag)是由Thermo Fisher Scientific公司研发的一种多肽体外等重同位素标记的相对与绝对定量技术，采用6，10及16种同位素的标签，通过特异性标记多肽的氨基基团，经高分辨质谱仪串联分析，可同时比较多达16种样品之间的蛋白质表达量，是定量蛋白质组学中的高通量筛选技术。
阿仑膦酸钠：是治疗骨质疏松症应用历史最长的药物之一，可通过多种作用机制治疗骨质疏松症。抑制破骨过程、维持骨结构、改善矿化程度、增加皮质厚度和骨密度从而提高骨强度，减轻和预防骨质疏松，有效降低椎体、髋骨和其他部位的骨折危险。

背景：目前关于阿仑膦酸钠治疗骨质疏松症的作用机制及作用靶点，仍需深入研究。

目的：探究阿仑膦酸钠调节骨质疏松模型大鼠骨代谢的作用机制，并进行差异表达蛋白生物信息学分析。
方法：雌性SD大鼠随机分为模型组、阿仑膦酸钠组、假手术组，每组12只，前两组均采用去卵巢法建立骨质疏松症模型，造模4周后阿仑膦酸钠组大鼠予阿仑膦酸钠灌胃；另外两组予等体积生理盐水。连续灌胃12周后测定胫骨骨密度，采用串联质量标签联合液相色谱-串联质谱法联用技术对大鼠腰椎进行蛋白质组学分析，筛选出差异表达蛋白，并进行基因本体、京都基因和基因组百科全书通路及蛋白相互作用网络分析。

结果与结论：①筛选出阿仑膦酸钠组与模型组组间上调/下调差异表达蛋白分别为32个/51个；②基因本体富集分析结果显示，差异表达蛋白主要参与结合、催化活性等分子功能以及细胞过程、代谢过程等生物过程；③京都基因和基因组百科全书富集分析结果显示，阿仑膦酸钠组/模型组组间差异表达蛋白功能主要参与泛酸和辅酶A的生物合成过程；④蛋白相互作用分析结果表明，阿仑膦酸钠组/模型组组间共同差异表达蛋白中Hspa1l、Enpp3、Unc45a、Myh9、Cant1位于蛋白互作网络节点并与骨代谢密切相关；⑤结果显示，阿仑膦酸钠可能通过调控差异表达蛋白及泛酸和辅酶A生物合成过程来调节骨质疏松模型大鼠的骨代谢。

https://orcid.org/0009-0009-3804-0159(黄惠敏)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 阿仑膦酸钠, 串联质量标签技术, 骨质疏松, 蛋白质组学, 蛋白互作, 差异表达蛋白, 骨代谢

Abstract: BACKGROUND: The mechanisms and targets of alendronate in the treatment of osteoporosis still need to be investigated in depth.
OBJECTIVE: To investigate the mechanism by which alendronate regulates bone metabolism in rats with osteoporosis and to perform a bioinformatics analysis of differentially expressed proteins.
METHODS: Female Sprague-Dawley rats were randomly divided into three groups (n=12 per group): model group, alendronate group and sham-operated group. Animal models of osteoporosis were prepared using ovariectomy in the model and alendronate groups. At 4 weeks after modeling, rats in the alendronate group were gavaged with alendronate; the other two groups were given the equal volume of normal saline. After 12 weeks of continuous gavage, the bone mineral density of the tibia was measured and the lumbar spine of the rats was taken for proteomic analysis using Tandem mass tag-liquid chromatography-tandem mass spectrometry technique to identify differentially expressed proteins for gene ontology, Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes pathway and protein-protein interaction analysis.
RESULTS AND CONCLUSION: There were 32 up-regulated proteins and 51 down-regulated proteins identified between the alendronate group and model group. Gene ontology enrichment analysis showed that the differentially expressed proteins were mainly involved in molecular functions, such as binding and catalytic activity, and in biological processes, such as cellular process and metabolic process. Kyoto Encylopedia of Genes and Genomes enrichment analysis showed that the differentially expressed proteins in the alendronate group and model group were mainly involved in the biosynthesis of pantothenate and coenzyme A. Protein-protein interaction analysis indicated that among the differentially expressed proteins in the alendronate group and model group, Hspa1l, Enpp3, Unc45a, Myh9 and Cant1 were located at the nodes of the protein-protein interaction network and were closely related to bone metabolism. Overall, these findings indicate that alendronate may regulate bone metabolism in the rat model of osteoporosis by regulating the expression of differentially expressed proteins and biosynthesis of pantothenate and coenzyme A.

Key words: alendronate, Tandem mass tag technology, osteoporosis, proteomics, protein-protein interaction, differentially expressed protein, bone metabolism

中图分类号:

黄惠敏, 谢冰颖, 黄景文, 黄小彬, 谢丽华, 李生强, 葛继荣. 阿仑膦酸钠治疗骨质疏松模型大鼠机制的串联质量标签蛋白质组学分析[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(16): 2505-2511.

Huang Huimin, Xie Bingying, Huang Jingwen, Huang Xiaobin, Xie Lihua, Li Shengqiang, Ge Jirong. Protective mechanism of alendronate granule in a rat osteoporosis model based on TMT proteomic analysis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(16): 2505-2511.

图/表（结果） 8

2.1 实验动物数量分析 36只雌性大鼠应要求随机被分为3组(n=12)，过程中未出现脱失情况，并全部参与后续所有分析。
2.2 骨密度结果比较结果显示，模型组大鼠骨密度较之假手术组显著降低(P < 0.05)；阿仑膦酸钠组骨密度较之模型组显著升高(P < 0.05)；阿仑膦酸钠组骨密度较之假手术组差异无显著性意义(P > 0.05)，见表1。

2.3 蛋白质鉴定与差异表达蛋白质筛选 3组中共鉴定出蛋白质3 614个。采用上述标准进行比较后结果显示，模型组与假手术组相比较，有76个表达上调的蛋白质位点，49个表达下调的蛋白质位点，共125个差异表达蛋白；阿仑膦酸钠组与模型组相比较，表达上调的蛋白质位点32个，表达下调的蛋白质位点51个，共83个差异表达蛋白。见图1。

2.4 差异表达蛋白质基因本体功能富集分析
2.4.1 造模后差异表达蛋白质基因本体功能富集分析对模型组/假手术组原始数据进行基因本体基因功能注释及富集分析后发现，差异表达蛋白主要参与的细胞组分包含细胞、细胞部分、细胞器、细胞器部分等；主要参与的分子功能包含结合、催化活性、外切酶活性等；主要参与的生物过程包括细胞过程、代谢过程、生物调节等。见图2。

2.4.2 经阿仑膦酸钠治疗后差异表达蛋白质基因本体功能富集分析对阿仑膦酸钠组/模型组原始数据进行基因本体基因功能注释及富集分析后发现，差异表达蛋白主要参与的细胞组分包括细胞、细胞部分、细胞器、蛋白质复合体等；主要参与的分子功能包括结合、催化活性、结构分子活性等；主要参与的生物过程包括细胞过程、代谢过程、生物调节等，见图3。

2.5 差异表达蛋白质KEGG通路富集分析
2.5.1 造模后差异表达蛋白质KEGG通路富集分析模型组/假手术组原始数据经分析后发现，总共有14条通路富集到KEGG pathway。其中1型糖尿病代谢、RNA降解、嘌呤和叶绿素代谢、抗原加工和呈递、补体和凝血级联反应等重要通路的富集程度显著性逐步递减，见图4。

2.5.2 经阿仑膦酸钠治疗后差异表达蛋白质KEGG通路富集分析阿仑膦酸钠组/模型组原始数据经分析后发现，富集到KEGG pathway仅有1条，如图5所示，即泛酸和辅酶A生物合成这一条通路。

2.6 共同差异表达蛋白统计模型组/假手术组差异表达蛋白在阿仑膦酸钠组中表达情况的统计结果如下：共有31个蛋白质位点在模型组中表达上调，却在阿仑膦酸钠组中表达下调；有3个蛋白质位点在模型组中表达下调，却在阿仑膦酸钠组中表达上调，因此阿仑膦酸钠组共纠正了34个在模型组中表达异常的蛋白质，见表2。

2.7 共同差异表达蛋白PPI分析经STRING蛋白互作网络分析后，发现共有Hspa1l、Enpp3、Unc45a、Myh9、Cant1等5个共同差异蛋白位于功能网络节点，其余蛋白均处于网络边缘，见图6。图中可见Hspa1l、Unc45a、Myh9之间存在相互作用， Enpp3与Cant1之间存在相互作用。

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引言

骨质疏松症是一种由多种原因导致骨骼疼痛、脊柱变形、严重时发生骨质疏松性骨折等临床表现的全身代谢性骨病，该病主要是由于骨质吸收增多，随之出现骨量减少、骨强度下降、骨脆性增加等情况[1]，其中在50-69岁年龄段中，绝经后骨质疏松症的患病率比例较大[2]。现有临床常用药中，尽管已有针对不同类型骨质疏松症的西药可供选择，但许多药物在用药过程中具体作用机制仍有许多未能被明确的地方。为了解决这一问题，各位研究者试图将蛋白质组学技术与现有生物信息学理论相结合，这项技术由WILKINS等[3]首次提出并不断发展，如今不仅能够做到更精准更灵敏地筛选出差异蛋白，同时为后续其他药物具体机制及作用靶点的探索提供新思路。
阿仑膦酸钠作为一种治疗绝经后骨质疏松症的临床常用药，属于双膦酸盐类的骨吸收抑制剂，疗效稳定，其原理是通过抑制甲羟戊酸途径中的法尼基焦磷酸合酶以破坏三磷酸鸟苷结合蛋白质异戊烯化，致使破骨细胞功能障碍和细胞凋亡[4]。研究表明，一定浓度的阿仑膦酸钠可促进骨质疏松症模型大鼠成骨细胞增殖分化，提高骨密度，调节骨代谢水平，缓解骨骼疼痛症状[5-6]；长期使用阿仑膦酸钠可增强骨折去卵巢模型大鼠股骨的力学性能，但会抑制编织骨向板层骨的重塑[7]。尽管如此，该药具体可通过哪些途径调节骨代谢、提高骨密度，仍需补充。故而此次研究使用串联质量标签(Tandem mass tag，TMT)联合液相色谱-串联质谱法(Liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)技术，经过蛋白质提取及肽段酶解、TMT标记及肽段分级、LC-MS/MS数据采集、蛋白质鉴定和定量分析等实验步骤，对阿仑膦酸钠治疗骨质疏松模型大鼠的腰椎进行分析，筛选出差异表达蛋白，借助生物信息学方法分析差异表达蛋白功能及信号通路，为说明其调节骨质疏松模型大鼠骨代谢的作用机制，以及发现其治疗骨质疏松症中可能的作用靶点提供研究依据。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验，多组间均数比较，首先选用单因素方差分析后再两两比较；按照倍数变化> 1.2倍且P < 0.05(上调> 1.2倍或者下调< 0.83)的条件筛选差异表达蛋白，符合条件后再进行后续分析。
1.2 时间及地点实验于2018年9月至2019年9月分别在福建省中医药科学院比较医学中心以及福建省中医药科学院基础研究所实验室内完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 36只3月龄清洁级SD雌性大鼠，体质量180-200 g，购买于上海斯莱克实验动物有限责任公司，实验动物生产许可证号：SCXK(沪)2007-0005，合格证编号：2007000530078；于福建省中医药科学院比较医学实验中心中饲养大鼠直至6月龄，实验许可证号：SYXK (闽)2009-000。各组大鼠均在20-22 ℃温度、适宜湿度与光照环境中进行饲养。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规，且得到福建省中医药科学院动物实验伦理委员会批准。
1.3.2 实验药物、试剂及仪器阿仑膦酸钠(杭州默沙东制药有限公司，国药准字H20010515)； SDT裂解液、TMT标记试剂盒(美国Thermo Fisher公司)；BCA定量试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)； Q-Exactive质谱仪(美国Thermo Fisher公司)；Easy nLC色谱系统(美国Thermo Scientific)；Discovery W双能X射线骨密度仪(变异系数1.0CV%，精度0.25%，美国Hologic公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 大鼠模型制备及干预 36只6月龄大鼠依照随机数字表法随机分为3组，即阿仑膦酸钠组、模型组及假手术组，每组12只。参照文献[8]所示去双侧卵巢术建立骨质疏松症大鼠模型；假手术组切除等体积卵巢旁脂肪组织[9]。造模完成4周后，据实验动物等效剂量系数折算法计算得出大鼠灌胃量：阿仑膦酸钠组大鼠予阿仑膦酸钠6.25 mg/kg灌胃，1次/周；模型组、假手术组大鼠予同等体积生理盐水，1次/周；连续灌胃3个月。

1.4.2 取材灌胃3个月后，各组大鼠取材前禁食12 h并称质量，用2%戊巴比妥钠40 mg/kg进行腹腔注射麻醉处死，取左侧胫骨用于骨密度检测；第1，2腰椎分离后放入液氮中备用：提取大鼠腰椎蛋白，随后将各组中每4只大鼠腰椎蛋白混合成1个样品，即各组分为3份蛋白混样用于检测。
1.4.3 大鼠胫骨骨密度检测严格按照双能X射线骨密度仪使用说明书对各组大鼠左侧胫骨进行骨密度检测。
1.4.4 腰椎总蛋白制备于腰椎蛋白样品中加入适量SDT裂解液，经沸水浴后离心取上清液并提取蛋白质。用BCA法进行蛋白质定量后置于-80 ℃保存。
1.4.5 TMT标记及肽段分级将适量蛋白质自各样品中提取出，并按照一定比例对其进行胰蛋白酶酶解，肽段定量(A280)。按照TMT标记试剂盒说明书进行肽段标记，后用乙腈与0.1%三氟乙酸进行柱平衡并混合，接着进行上样、脱盐处理、梯度洗脱、真空干燥。冻干样品使用0.1%甲酸进行复溶，最后测定肽段浓度。
1.4.6 LC-MS/MS分析参照课题组前期文献[10]，使用高效液相色谱系统Easy nLC与Q-Exactive质谱仪对各分级样品分别进行色谱分离及质谱分析。
1.4.7 蛋白质鉴定与定量分析使用Mascot 2.2与Proteome Discoverer 1.4软件对原始数据进行查库鉴定及定量分析。蛋白数据库为：UNIPROT_Rattus_norvegicus_36107_20190524；采用根据唯一肽段定量值的中位数的蛋白质定量方法。后续操作均参考课题组前期文献进行设置。
1.5 主要观察指标 ①差异表达蛋白；②基因本体(http://www.blast2go.com/)功能富集分析；③KEGG(http://www.kegg.jp/)信号通路分析；④蛋白质相互作用网络分析(Protein-protein interaction，PPI，STRING数据库，http://string-db.org/)。
1.6 统计学分析与生物信息学分析统计结果以x±s表示，数据由SPSS 22.0软件进行统计分析。在数据服从正态分布情况下，多组间均数比较，首先选用单因素方差分析后再两两比较；P < 0.05则差异有显著性意义。按照倍数变化> 1.2倍且P < 0.05(上调> 1.2倍或者下调< 0.83)的条件进行筛选差异表达蛋白，符合条件后再进行后续相关分析。文章统计学方法已经福建中医药大学统计学专家审核。

讨论

3.1 既往研究的贡献及不足骨质疏松症作为一种全身代谢性疾病，随着世界人口老龄化程度的逐步加深，现已成为急需解决的重大健康问题之一[11]。现如今临床上多从抑制骨吸收、促进骨形成、其他机制药物及中药方剂这4方面选择治疗骨质疏松症的药物，阿仑膦酸钠作为具有较广抗骨折谱药物，从1995年首次获得FDA批准用于治疗绝经后骨质疏松症至今，疗效显著。并且阿仑膦酸钠还能够明显改善骨质疏松性压缩性骨折经皮椎体后凸成形术后患者的骨代谢情况，促进骨愈合[12]。如果能为临床应用提供更全面的实验依据作为参考，就能从更多方面阐释该药治疗骨质疏松症的作用机制。阿仑膦酸钠的药效主要是通过抑制破骨细胞活性从而实现对骨吸收的抑制作用，临床上该药不仅能够显著改善患者骨代谢及骨密度情况[13]，提高患者骨密度以及降低骨转换指标水平[14-15]；对糖皮质激素性骨质疏松症同样有效[16]，叶子丰等[17]发现在去卵巢模型大鼠骨髓间充质干细胞-破骨前体细胞共培养体系中，阿仑膦酸钠能调节骨髓间充质干细胞，来抑制破骨细胞的形成；在成骨细胞-破骨细胞共培养体系中，阿仑膦酸钠不仅抑制破骨细胞的生成，对破骨细胞中活化T细胞核因子1、c-Fos、核因子κB受体活化因子配体、骨保护素相关基因的表达也会起到负性调节作用[18]。并且还能调控核因子κB 和丝裂原活化蛋白激酶信号通路来改善大鼠骨质疏松症发展[19]。陈赛楠等[20]发现，阿仑膦酸钠在骨重建偶联中具有双向传导功能的 EphB4/ephrinB2的信号通路中，同样能起到调节作用，可同时调控成骨细胞与破骨细胞的功能。再者，其对成骨细胞的增殖分化也有一定的促进作用，可上调BMP-2/Smads/Runx2/Osterix/IFN-β/STAT1通路多个相关基因表达，来促进成骨细胞分化[21-22]。近年来，蛋白组学技术的使用为药物作用机制探索上提供了新的选择，这为新的作用靶点及信号通路的发现贡献了新思路。尽管既往研究中阿仑膦酸钠治疗骨质疏松症的作用机制在不断补充，但关于该药新的作用靶点方面仍有许多值得探索的地方。
3.2 研究的意义近年来蛋白组学逐渐成为多个领域的研究热点。利用该项技术与生物信息学组合分析，从蛋白质组学角度探索阿仑膦酸钠治疗绝经后骨质疏松症新的作用靶点及信号通路，为临床上提供更多研究依据。
在此次研究中，阿仑膦酸钠组大鼠骨密度较模型组显著升高；经差异表达蛋白基因本体富集分析后可知，此次实验中阿仑膦酸钠组/模型组差异蛋白主要参与细胞过程、代谢过程、生物调节等生物过程；经差异表达蛋白KEGG通路分析后可知，阿仑膦酸钠组/模型组差异蛋白主要富集于泛酸和辅酶A生物合成这一信号通路。而且HOU等[23]研究发现，泛酸和辅酶A生物合成、丙氨酸、天冬氨酸以及谷氨酸代谢等对于斑马鱼骨量的改善有促进作用，这与此次实验的结果相一致。从共同差异表达蛋白统计结果来看，模型组的Tmem120a[24-25]、Hspa1l、Enpp3、Unc45a、Myh9、Cant1等34个异常表达蛋白在阿仑膦酸钠组中得到纠正，佐证了阿仑膦酸钠的治疗作用。结合上述骨质疏松症病理特点以及此次研究结果分析筛选出与骨质疏松症有关的Tle1、Myh9、Enpp3、Tspan14、Aldh3b1、Hspa1l、Cant1、Ryr1 8个共同差异表达蛋白与重要通路进行分析。
Tle1作为哺乳动物的转导样增强器分裂家族蛋白成员，是可以不直接与DNA结合就能抑制目标基因表达的转录抑制因子。研究发现其包含的WD40重复结构域可与大量转录调节基因相互作用，所以能够抑制Wnt/Notch/BMP/TGF-β等信号通路的传导，这些通路在骨质疏松症中均有密切的关系。有研究发现，Tle1与转录因子结合会抵消转录因子/β-catenin的转录活性，抑制Wnt靶点[26]；Tles可通过触发抑制性表观遗传修饰和抑制HES1靶基因表达来调节Notch效应[27]；再者Tle1在有丝分裂期间可与Runx2相结合来调节核糖体RNA基因，从而调节细胞生长和蛋白质合成[28]。而此次研究结果显示，阿仑膦酸钠组中Tle1相较于模型组中表达下调，由此推测，阿仑膦酸钠可能通过抑制Tle1表达从而提高骨量，但其中具体机制仍需要进一步研究。Myh9作为一种肌球蛋白，有研究发现其可能参与了糖皮质激素对骨祖细胞的抑制功能，该蛋白表达水平的变化可能在应对糖皮质激素性骨质疏松症上有重要意义[29]。Enpp3属于外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶(Recombinant Ectonucleotide Pyrophosphatase/Phosphodiesterase，ENPP)家族成员，能够调节嘌呤能信号传导，其中Enpp1可通过水解ATP产生并释放无机焦磷酸盐，这在骨矿化的调节中起到重要作用[30]。而 Enpp3作为Enpp1同一家族成员，同样可以对ATP进行水解，并且较之其他核苷三磷酸更喜欢ATP。在细胞表面上的ATP受体即嘌呤能受体，其在骨代谢方面也有着重要的作用[31]。Tspan14是4次跨膜蛋白家族的成员，可与解整合素金属蛋白酶10相互作用，且TspanC8亚组(TspanC8s)可作为解整合素金属蛋白酶10调节因子，不同的TspanC8/解整合素金属蛋白酶10复合物具有不同的底物特异性，这也是解整合素金属蛋白酶10起到“分子剪刀”作用从而切割不同膜蛋白底物的原因。其中Tspan14不仅在大多数细胞类型中的表达与解整合素金属蛋白酶10相似，还会优先切割并激活Notch，从而促进Notch信号传导[32]。且有学者发现，解整合素金属蛋白酶10在激素性股骨头坏死患者来源骨髓间充质干细胞中过表达，会增强激素性股骨头坏死患者来源骨髓间充质干细胞的增殖活性以及成骨分化能力，其机制可能与激活Notch信号通路有关[33]。Aldh3b1作为与细胞内活性氧有关的乙醛脱氢酶家族成员，在功能上可通过醛类代谢减少氧化应激。有研究证明骨质疏松症与氧化应激之间有密切关系[34]。氧化应激对于破骨细胞产生的双峰效应，能够适度应激促进破骨细胞形成，而严重的氧化应激会抑制破骨细胞吸收并限制其寿命。而且Hspa1l上调线粒体自噬并延长人间充质干细胞的存活，与其在氧化应激条件下表达水平的升高有关[35-36]。Ryr1作为骨骼肌中主要的Ca2+通道，其对于钙通量的调控均能起到正向或逆向的作用[37-38]，而人体内Ca2+水平维持得好坏与否，与是否引发骨质疏松症有着十分重要的关系。Cant1作为腺苷三磷酸双膦酸酶家族成员，可作为钙依赖性核苷酸酶发挥作用，将二磷酸尿苷水解为一磷酸尿苷和磷酸盐，并且在生长板软骨里糖胺聚糖的合成以及软骨细胞的分化中发挥着重要作用[39]。另外，课题组前期研究发现在骨疏康治疗骨质疏松症过程中，Cant1参与了嘌呤代谢，经治疗后表达水平明显下调，这与此次实验结果相一致。
由通路结果分析可知，阿仑膦酸钠治疗骨质疏松症与泛酸和辅酶A的生物合成这一信号通路有关。泛酸作为酶促乙酰化作用的辅助因子，其辅酶形式即辅酶A。有研究发现，虾青素在积极诱导骨髓间充质干细胞成骨分化过程中，同时对于泛酸与辅酶A的生物合成、苯丙氨酸代谢、络氨酸代谢等均会起到调控作用，而这也表明该过程与脂肪酸的生物合成有着密切的关系[40]。不仅如此，在骨质疏松性骨关节炎的治疗方面，MA等[41]发现，二仙汤能够通过糖酵解/糖异生、泛酸的辅酶A生物合成等代谢途径，调节胱氨酸、鹅脱氧胆酸盐及松二糖等代谢物的表达，影响软骨相关标志物的基因表达，从而保护软骨，缓解骨质疏松症，改善骨骼与关节结构及关节环境。
以上，此次研究是使用TMT蛋白质组学技术及生物信息学分析方法对经阿仑膦酸钠治疗后的骨质疏松症模型大鼠腰椎蛋白质进行分析，筛选出并分析共同差异表达蛋白，研究结果表明，阿仑膦酸钠调节骨质疏松症模型大鼠骨代谢过程，可能是通过调控上述差异表达蛋白以及泛酸和辅酶A生物合成信号通路来实现。此次研究为阿仑膦酸钠治疗绝经后骨质疏松症提供了新的研究思路及作用靶点，对于开发新的骨质疏松症靶点药物以及临床治疗上有重要意义。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

阿仑膦酸钠治疗骨质疏松模型大鼠机制的串联质量标签蛋白质组学分析

Protective mechanism of alendronate granule in a rat osteoporosis model based on TMT proteomic analysis

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