BMP/Smad信号通路与先天性马蹄内翻足模型大鼠足踝部的软骨发育

doi:10.12307/2024.328

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (16): 2500-2504.doi: 10.12307/2024.328

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BMP/Smad信号通路与先天性马蹄内翻足模型大鼠足踝部的软骨发育

常宇1，李慧1，张天水1，王春雨1，于丽1，武子媚2，李玟2，王正东3

沈阳医学院，1基础医学院，2研究生院，3解剖学教研室，辽宁省沈阳市 110034

收稿日期:2023-04-01 接受日期:2023-05-25 出版日期:2024-06-08 发布日期:2023-07-29
通讯作者: 王正东，博士，教授，沈阳医学院解剖学教研室，辽宁省沈阳市 110034
作者简介:常宇，女，2001年生，辽宁省丹东市人，汉族，2019级在读本科生。
基金资助:
辽宁省大学生创新创业训练计划(S202110164003)，项目负责人：常宇

Bone morphogenetic protein/Smad signaling pathway involved in chondrodysplasia in the ankle of a rat congenital clubfoot model

Chang Yu1, Li Hui1, Zhang Tianshui1, Wang Chunyu1, Yu Li1, Wu Zimei2, Li Wen2, Wang Zhengdong3

1Basic Medical School, 2Postgraduate School, 3Department of Anatomy, Shenyang Medical College, Shenyang 110034, Liaoning Province, China

Received:2023-04-01 Accepted:2023-05-25 Online:2024-06-08 Published:2023-07-29
Contact: Wang Zhengdong, MD, Professor, Department of Anatomy, Shenyang Medical College, Shenyang 110034, Liaoning Province, China
About author:Chang Yu, Basic Medical School, Shenyang Medical College, Shenyang 110034, Liaoning Province, China
Supported by:
Liaoning College Student Innovation and Entrepreneurship Training Program, No. S202110164003 (to CY)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins，BMP)：一种存在于骨基质中的酸性糖蛋白，属于转化生长因子超家族，作用于未分化且具有成骨潜能的间充质细胞表面，可以促进骨功能细胞分泌骨胶原、骨基质、细胞因子和酶类，启动骨形成过程。
先天性马蹄内翻足：是常见的先天性足畸形。由足下垂、内翻、内收3个主要畸形综合而成。以后足马蹄，内翻、内旋，前足内收、内翻、高弓为主要表现的畸形疾病。男性发病较多，可为单侧发病，也可双侧，病因尚不清楚。

背景：先天性马蹄内翻足主要表现为骨本身异常及软骨发育异常，BMP/Smad信号通路可以指导胚胎期骨和软骨的发育，但其在马蹄内翻足病因领域发挥的作用尚无动物实验证实。

目的：探讨BMP/Smad信号通路参与调控先天性马蹄内翻足模型大鼠足踝部软骨发育异常的机制。
方法：将生长状况相同的孕10 d的SD大鼠随机分为实验组和对照组。实验组采用135 mg/kg维甲酸灌胃制作马蹄内翻足模型，对照组采用等量植物油灌胃；孕21 d后剖腹取出胎鼠，实验组孕鼠产下胎鼠41只中出现马蹄足畸形27 只，畸型率65.9%；对照组获得胎鼠36 只，均未出现畸形。分离胎鼠足踝部组织进行苏木精-伊红染色，并采用Western blot、RT-qPCR、免疫组化检测BMP/Smad信号通路核心蛋白Smad5、P-Smad5、通路下游蛋白SP7以及Sox9的表达水平。

结果与结论：①与对照组相比，苏木精-伊红染色可见实验组大鼠足踝部组织中软骨基质增多，骨间缝隙增大；②免疫组化显示实验组Smad5与SP7表达水平下降，而Sox9基因表达增高；③RT-qPCR结果显示实验组大鼠足踝部组织中Smad5、SP7的mRNA表达水平下降，Sox9 mRNA表达水平升高；④Western blot结果显示实验组大鼠足踝部软骨组织中P-Smad5/Smad5及SP7表达降低，Sox9表达升高；⑤结果说明，先天性马蹄内翻足模型大鼠足踝部软骨异常的发生与BMP/Smad信号通路传导障碍有关。

https://orcid.org/0009-0000-7835-3605(常宇)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 先天性马蹄内翻足, BMP/Smad信号通路, Smad5, P-Smad5, SP7

Abstract: BACKGROUND: Congenital clubfoot mainly manifests as abnormal bone itself and abnormal cartilage development. The bone morphogenetic protein (BMP)/drosophila mothers against decapentaplegic protein (Smad) signaling pathway can direct the development of bone and cartilage during embryonic period, but its role in the field of clubfoot etiology has not been confirmed in animal experiments.
OBJECTIVE: To explore the mechanism by which the BMP/Smad signaling pathway is involved in the regulation of foot and ankle chondroplasia in a rat congenital clubfoot model.
METHODS: Sprague-Dawley rats at 10 days of gestation with the same growth condition were randomly divided into experimental and control groups. The experimental group was intragastrically given 135 mg/kg retinoic acid to make the clubfoot model, while the control group was given the same amount of vegetable oil. The fetal rats were taken out after 21 days of gestation by cesarean section. In the experimental group, the 27 of 41 fetal rats had clubfoot, with a deformity rate of 65.9%; in the control group, no clubfoot was observed in all the 36 fetuses. The ankles tissues of the rats were collected for hematoxylin-eosin staining. Western blot assay, RT-qPCR and immunohistochemistry were performed to detect the expression levels of Smad5 and P-Smad5, the core proteins of the BMP/Smad signaling pathway, as well as SP7 and Sox9, the downstream proteins of the BMP/Smad signaling pathway.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the control group, hematoxylin-eosin staining showed that the cartilage matrix in the foot and ankle tissues increased and the gap between the bones increased in the experimental group. Immunohistochemical findings showed that the expression levels of Smad5 and SP7 decreased in the experimental group, while the mRNA expression of Sox9 increased. RT-qPCR results showed that the mRNA expression of Smad5 and SP7 decreased, while the mRNA expression of Sox9 increased in the foot and ankle tissues of rats in the experimental group. Western blot results showed that P-Smad5/Smad5 expression and SP7 expression were decreased and Sox9 expression was increased in the ankle of rats in the experimental group. To conclude, the occurrence of cartilage abnormalities in the foot and ankle of the rat model of congenital clubfoot is associated with impaired transmission of the BMP/Smad signaling pathway.

Key words: congenital clubfoot, BMP/Smad signaling pathway, Smad5, P-Smad5, SP7

中图分类号:

常宇, 李慧, 张天水, 王春雨, 于丽, 武子媚, 李玟, 王正东. BMP/Smad信号通路与先天性马蹄内翻足模型大鼠足踝部的软骨发育[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(16): 2500-2504.

Chang Yu, Li Hui, Zhang Tianshui, Wang Chunyu, Yu Li, Wu Zimei, Li Wen, Wang Zhengdong. Bone morphogenetic protein/Smad signaling pathway involved in chondrodysplasia in the ankle of a rat congenital clubfoot model[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(16): 2500-2504.

图/表（结果） 4

2.1 苏木精-伊红染色见图1。与正常对照组相比，实验组大鼠足踝部组织软骨基质增多，软组织中胶原纤维成分明显增多，软组织出现明显的挛缩现象，骨与骨之间的间隙增大。该病理变化不仅证明模型建立成功，也表明先天性马蹄内翻足发生发展过程中，足踝部软骨组织会持续进行性发生病理变化。

2.2 免疫组化结果免疫组化检测软骨骨化相关因子的表达情况，见图2。Smad5与SP7阳性颗粒主要分布于大鼠足踝部软骨组织中，Sox9阳性颗粒则密集分布于软骨及软组织中。与对照组相比，实验组软组织中黄褐色阳性颗粒减少，实验组大鼠足踝部软骨组织中的Smad5和SP7表达明显低于对照组(P < 0.001，P < 0.05)，Sox9表达明显高于对照组(P < 0.001)。这说明在大鼠先天性马蹄内翻足的进展过程中，软骨及软组织的发生，尤其与Sox9相关因子的表达受疾病进展的调节。

2.3 RT-qPCR结果检测了Smad5、SP7以及Sox9在mRNA水平的表达情况，见图3。结果显示，与对照组相比，实验组大鼠足踝部软骨组织中Smad5和SP7 mRNA表达水平下降(均P < 0.001)，Sox9 mRNA表达水平增高(P < 0.01)。进一步表明先天马蹄内翻足模型大鼠软骨发育异常可能与BMP/Smad信号通路传导受阻有一定相关性。

2.4 Western blot结果为了进一步验证先天马蹄内翻足模型大鼠软骨发育异常与BMP/Smad信号通路的相关性，检测了Smad5、P-Smad5-S465、SP7以及Sox9在蛋白水平的表达情况，见图4。结果显示，与对照组相比，实验组大鼠足踝部软骨组织中SP7表达降低(P < 0.001)，P-Smad5-S465/Smad5表达降低(P < 0.001)，Sox9表达增高(P < 0.05)。根据BMP/Smad通路的传导特点可见先天性马蹄内翻足模型大鼠足踝部软骨发育异常与BMP/Smad信号通路表达相关。

参考文献

[1] DIBELLO D, TORELLI L, DI CARLO V, et al. Incidence of Congenital Clubfoot: Preliminary Data from Italian CeDAP Registry. Int J Environ Res Public Health. 2022;19(9):5406.
[2] CADY R, HENNESSEY TA, SCHWEND RM. Diagnosis and Treatment of Idiopathic Congenital Clubfoot. Pediatrics. 2022;149(2):e2021055555.
[3] BINA S, PACEY V, BARNES EH, et al. Interventions for congenital talipes equinovarus (clubfoot). Cochrane Database Syst Rev. 2020;5(5):CD008602.
[4] BASIT S, KHOSHHAL KI. Genetics of clubfoot; recent progress and future perspectives. Eur J Med Genet. 2018;61(2):107-113.
[5] MUSTARI MN, FARUK M, BAUSAT A, et al. Congenital talipes equinovarus: A literature review. Ann Med Surg (Lond). 2022;81:104394.
[6] BIANCO AM, RAGUSA G, DI CARLO V, et al.What Is the Exact Contribution of PITX1 and TBX4 Genes in Clubfoot Development? An Italian Study. Genes (Basel). 2022;13(11):1958.
[7] CAI G, YANG X, CHEN T, et al. Integrated bioinformatics analysis of potential pathway biomarkers using abnormal proteins in clubfoot. PeerJ. 2020;8:e8422.
[8] LI J, WANG Z, FENG D, et al. Evaluation of genetic susceptibility of common variants in SOX9 in patients with congenital talipes equinovarus in the Han Chinese population.J Orthop Surg Res. 2020;15(1):276.
[9] LADEMANNF, WEIDNER H, TSOURDI E, et al.Disruption of BMP Signaling Prevents Hyperthyroidism-Induced Bone Loss in Male Mice. J Bone Miner Res. 2020;35(10):2058-2069.
[10] TODD GM, GAO Z, HYVÖNEN M, et al. Secreted BMP antagonists and their role in cancer and bone metastases. Bone. 2020;(137):115455.
[11] LIM J, TU X, CHOI K, et al. BMP-Smad4 signaling is required for precartilaginous mesenchymal condensation independent of Sox9 in the mouse. Dev Biol. 2015;400(1):132-138.
[12] KIM DK, BANDARA G, CHO YE, et al. Mastocytosis-derived extracellular vesicles deliver miR-23a and miR-30a into pre-osteoblasts and prevent osteoblastogenesis and bone formation. Nat Commun. 2021;12(1):2527.
[13] LU Y, MA ZX, DENG R, et al. The SIRT1 activator SRT2104 promotes BMP9-induced osteogenic and angiogenic differentiation in mesenchymal stem cells. Mech Ageing Dev. 2022;207:111724.
[14] ZHANG Q, CAO L, ZOU S, et al. Human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cell-Derived Extracellular Vesicles Carrying MicroRNA-181c-5p Promote BMP2-Induced Repair of Cartilage Injury through Inhibition of SMAD7 Expression. Stem Cells Int. 2022;2022:1157498.
[15] ZENG Y, DU C, XIAO P, et al. Sox9-Increased miR-322-5p Facilitates BMP2-Induced Chondrogenic Differentiation by Targeting Smad7 in Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells Int. 2021;2021:9778207.
[16] XIAO P, ZHU Z, DU C, et al. Silencing Smad7 potentiates BMP2-induced chondrogenic differentiation and inhibits endochondral ossification in human synovial-derived mesenchymal stromal cells. Stem Cell Res Ther. 2021;12(1):132.
[17] 王正东,颜南,王效杰,等.Sox9基因在马蹄内翻足大鼠模型足踝软骨组织表达的实验研究[J].沈阳医学院学报,2012,14(4):199-201.
[18] BASIT S, KHOSHHAL KI. Genetics of clubfoot; recent progress and future perspectives.Eur J Med Genet. 2018;61(2):107-113.
[19] CANAVESE F, DIMEGLIO A. Clinical examination and classification systems of congenital clubfoot: a narrative review. Ann Transl Med. 2021;9(13):1097.
[20] HEMO Y, GIGI R, WIENTROUB S. Delayed ossification and abnormal development of tarsal bones in idiopathic clubfoot: should it affect bracing protocol when using the Ponseti method? J Child Orthop. 2019;13(3):265-270.
[21] HASEEB A, KC R, ANGELOZZI M, et al. SOX9 keeps growth plates and articular cartilage healthy by inhibiting chondrocyte dedifferentiation/osteoblastic redifferentiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 2021;118(8):e2019152118.
[22] SONG H, PARK KH. Regulation and function of SOX9 during cartilage development and regeneration. Semin Cancer Biol. 2020;67(Pt 1):12-23.
[23] SHI C, ZHENG W, WANG J. lncRNA-CRNDE regulates BMSC chondrogenic differentiation and promotes cartilage repair in osteoarthritis through SIRT1/SOX9. Mol Cell Biochem. 2021;476(4):1881-1890.
[24] LEFEBVRE V, ANGELOZZI M, HASEEB A. SOX9 in cartilage development and disease. Curr Opin Cell Biol. 2019;61:39-47.
[25] JIAO F, TANG W, WANG J, et al. Icariin promotes the repair of bone marrow mesenchymal stem cells in rabbit knee cartilage defects via the BMP/Smad pathway. Ann Transl Med. 2022;10(12):691.
[26] LOH HY, NORMAN BP, LAI KS, et al. Post-Transcriptional Regulatory Crosstalk between MicroRNAs and Canonical TGF-β/BMP Signalling Cascades on Osteoblast Lineage: A Comprehensive Review. Int J Mol Sci. 2023;24(7):6423.
[27] LUO C, XU W, TANG X, et al. Canonical Wnt signaling works downstream of iron overload to prevent ferroptosis from damaging osteoblast differentiation. Free Radic Biol Med. 2022;188:337-350.
[28] XUE Y, HU S, CHEN C, et al. Myokine Irisin promotes osteogenesis by activating BMP/SMAD signaling via αV integrin and regulates bone mass in mice. Int J Biol Sci. 2022;18(2):572-584.
[29] ZOU ML, CHEN ZH, TENG YY, et al. The Smad Dependent TGF-β and BMP Signaling Pathway in Bone Remodeling and Therapies. Front Mol Biosci. 2021;8:593310.
[30] KUSHIOKA J, KAITO T, OKADA R, et al. A novel negative regulatory mechanism of Smurf2 in BMP/Smad signaling in bone. Bone Res. 2020;8(1):41.
[31] LU Z, DU L, LIU R, et al. MiR-378 and BMP-Smad can influence the proliferation of sheep myoblast. Gene. 2018;674:143-150.
[32] SETIAWAN AM, KAMARUDIN TA, ABD GHAFAR N. The role of BMP4 in adipose-derived stem cell differentiation: A minireview. Front Cell Dev Biol. 2022;10:1045103.
[33] LADEMANNF, WEIDNER H, TSOURDI E,et al.Disruption of BMP Signaling Prevents Hyperthyroidism-Induced Bone Loss in Male Mice. J Bone Miner Res. 2020;35(10):2058-2069.
[34] THIELEN NGM, VAN DER KRAAN PM, VAN CAAM APM. TGFβ/BMP Signaling Pathway in Cartilage Homeostasis. Cells. 2019;8(9):969.
[35] WU M,CHEN G,LI YP. TGF-β and BMP signaling in osteoblast, skeletal development, and bone formation, homeostasis and disease. Bone Res. 2016;26(4):16-19.
[36] LIU DD, ZHANG CY, LIU Y,et al. RUNX2 Regulates Osteoblast Differentiation via the BMP4 Signaling Pathway. J Dent Res. 2022;101(10):1227-1237.
[37] KOMORI T. Molecular Mechanism of Runx2-Dependent Bone Development. Mol Cells. 2020;43(2):168-175.
[38] LIANG N, ZHANG Q, HE B. Depth Vision-Based Assessment of Bone Marrow Mesenchymal Stem Cell Differentiation Capacity in Patients with Congenital Scoliosis. J Healthc Eng. 2022;2022:4890008.
[39] NAVEN MA, ZEEF LAH, LI S, et al. Development of human cartilage circadian rhythm in a stem cell-chondrogenesis model. Theranostics. 2022;12(8):3963-3976.
[40] 赵翔.Pitx1和维甲酸通路在马蹄内翻足相关机制的研究并临床观察[D].上海:上海交通大学,2019.

引言

先天性马蹄内翻足(congenital talipes equinovarus，CEV)是小儿临床上常见的骨骼畸形，其发病率为0.1%-0.2%[1]。先天性马蹄内翻足的主要临床症状表现为单侧或双侧踝关节跖屈、足跟内翻及前足内收，双侧发病多于单侧发病，男性发病明显多于女性，男女发病比例约为2∶1[2]。鉴于先天性马蹄内翻足患儿年龄较小，肌肉及脏腑发育不全的特点，非手术矫正疗法被医学界广泛推崇，但非手术疗法的实施往往伴随着高复发率，这是一个亟待解决的难题[3-4]。先天性马蹄内翻足是由多种因素共同引起的，包括遗传因素与环境因素，其中遗传因素可影响骨骼、肌肉、血管的发育情况，从而导致先天性马蹄内翻足的发生。目前在基因遗传方面，特别是软骨骨化情况涉及到多条通路机制，已证实是先天性马蹄内翻足发生的重要病因之一[5-7]。
Sox9(SRY-related high group gene 9)作为软骨细胞中关键的转录因子，就曾被指出为马蹄内翻足的易感基因[8]。骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins，BMP)是一种具有诱导骨形成能力的因子，它可以作为生长因子引导间充质干细胞向骨祖细胞转化进一步刺激成骨细胞的生成[9]。此外，BMP能与细胞膜受体结合，激活Smad(drosophila mothers against decapentaplegic)，促进Smad1，Smad5，Smad8等转化因子磷酸化，形成复合物进入细胞核促进SP7等成骨基因表达[10]。Smad5作为BMP/Smad信号通路的主要受体蛋白在软骨形成中发挥作用。研究表明，Smad5主要表达于小鼠的前肢与后肢，当Smad5信号缺乏时会导致软骨发育不
良[11]。另一研究表明，当肢体间充质中Smad5信号表达缺失会导致主要表现为四肢的萎缩与畸形的骨骼缺陷[12]。Smad7是BMP下游的重要软骨抑制因子，它能通过阻断Smad1，5，8通路抑制BMP诱导的软骨骨化，同时，Smad7基因的敲除可以抑制小鼠生长板中软骨细胞的成熟，并影响BMP下游的Runx2、SP7的表达，这表明Smad7不仅能够抑制软骨骨化，同时在软骨内成骨过程中也起到重要诱导作用[13-14]。另外，在Smad7和Sox9协同BMP促进软骨化的研究中发现Sox9与Smad7具有高度相关性，即Sox9通过调节Smad7表达影响BMP信号通路传导进而增强软骨化，并阻碍软骨内成骨[15-16]。
课题前期发现Sox9基因在大鼠先天性马蹄内翻足踝部软骨发育异常的过程中发挥一定作用，而BMP/Smad信号通路的传导与Sox9的表达有密切相关性[17]。因此，推测BMP/Smad信号通路的传导参与调控先天性马蹄内翻足的发生。此次研究首先通过观察Sox9在先天性马蹄内翻足大鼠足踝部软骨组织中的表达情况，然后比较Smad5，p-Smad5，SP7在正常大鼠与先天性马蹄内翻足大鼠足踝部软骨组织中的表达差异，进而探讨BMP/Smad信号通路与先天性马蹄内翻足足踝部软骨发育的关系。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。
1.2 时间及地点实验于2020年6月至2021年12月在沈阳医学院公共卫生学院中心实验室及沈阳医学院基础医学实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物取8 周龄SPF级SD大鼠，雌鼠10 只，雄鼠6 只，体质量200-300 g，购于辽宁长生生物技术股份有限公司，动物生产许可证SCXK(辽)2015-0001。全部动物饲养于沈阳医学院动物实验中心，动物房室温(24±2) ℃，相对湿度(55±5)%，12 h/12 h明暗循环照明条件。该实验经沈阳医学院动物伦理委员会审批，批准号：SYYXY2021040702，并按照《辽宁省实验动物管理规定》执行。
1.3.2 试剂及仪器苏木精-伊红染色试剂、Western blot试剂盒和免疫组化试剂盒均购自北京鼎国昌盛生物技术责任有限公司，RT-qPCR试剂盒(Vazyme)、兔抗鼠抗体Smad5、phospho-Smad5-S465、GAPDH、Sox9(AB clonal)；SP7(ABcam)；维甲酸(Sigma公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 建模与取材分别将5 只雌鼠与3 只雄鼠合笼，第2 天通过阴道栓检查是否怀孕。将孕10 d的大鼠随机分为对照组3 只和实验组7 只，给予实验组大鼠135 mg/kg维甲酸灌胃处理，对照组采用同等体积植物油灌胃。孕21 d使用2%戊巴比妥钠(3 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠后剖宫取出胎鼠，实验组孕鼠产下胎鼠41 只，其中出现马蹄足畸形27 只，畸型率65.9%。对照组获得胎鼠36 只，均未出现畸形。部分胎鼠立即脱颈椎处死并放于-80 ℃冰箱，用于Western blot蛋白检测和RT-qPCR mRNA检测。选取部分典型马蹄足胎鼠和正常胎鼠下肢踝部组织于40 g/L多聚甲醛中固定，放于4 ℃冰箱中用于苏木精-伊红染色和免疫组化染色。
1.4.2 苏木精-伊红染色取实验组和对照组40 g/L多聚甲醛固定的足踝部组织标本；梯度浓度蔗糖溶液浸泡进行组织脱水；OCT包埋胶包埋后切成10 μm薄片，移至载玻片；固定，苏木精-伊红染色；吸去玻片水分，无水乙醇脱水：中性树胶封固，分别于光学显微镜下观察后记录组织形态学变化。
1.4.3 免疫组化染色检测取实验组和对照组40 g/L多聚甲醛固定的足踝部组织标本；梯度浓度蔗糖溶液浸泡进行组织脱水；OCT包埋胶包埋后制作冰冻切片；用柠檬酸钠盐缓冲液处理切片后，PBS洗涤进行抗原修复；取制好的切片滴加内源性过氧化酶阻断剂1滴，室温孵育10 min后洗涤，再加入非特异性阻断剂1滴孵育10 min；滴加一抗(Smad5 1∶200，SP7 1∶200，Sox9 1∶200)恒温箱37 ℃孵育1 h，4 ℃过夜；滴加生物素标记二抗，室温孵育30 min；滴加链霉素抗生素蛋白-过氧化物酶室温孵育10 min；滴加DAB置于室温5 min后再用流水冲洗5 min去除未反应的DAB；苏木素复染并使用1%盐酸-乙醇溶液浸泡三四秒，PBS冲洗返蓝，脱水封固；以空白对照组为阴性对照在100 倍视野中随机选取4 个视野进行免疫组化数据分析，Image-Pro Plus6.0软件进行平均灰度值分析SP7、Smad5、Sox9的表达情况。

1.4.4 RT-qPCR检测提取2 组胎鼠踝部样本中总RNA，反转录后进行Real-Time PCR 扩增，引物序列见表 1，以GAPDH为内参，每份样品做 3 个复孔，取平均 Ct 值进行计算。依据各组Ct值，应用公式 2-ΔΔCt法计算实验组与对照组之间Smad5、SP7、Sox9 mRNA的相对表达差异。

1.4.5 Western blot检测取实验组和对照组胎鼠足踝部标本；称质量，加裂解液并研磨，离心后取上清于冰中待用。取适量上清液稀释10 倍BCA试剂盒测量蛋白稀释后浓度，根据稀释浓度计算原浓度后按照每复孔6 μL体积计算每个复孔蛋白、RSB及PBS需要量，按照比例混合后稍微离心并将蛋白加热到100 ℃灭活；根据蛋白分子量制胶；以GAPDH为内参电泳2 h分离蛋白；用PBST洗胶后转膜1 h；将获得的载有目的蛋白的PVDF置于5%脱脂奶粉中封闭2 h；在封闭后的PVDF膜上根据蛋白分子量分割得到所需目的蛋白条带；将所得条带分别对应加入一抗杂交液Smad5(1∶1 000)、P-Smad5-S465(1∶1 000)、SP7(1∶1 000)、Sox9(1∶1 000)、GAPDH(1∶2 000)杂交2 h后放于4 ℃冰箱过夜；洗涤一抗后的蛋白条带分别加入二抗Smad5(1∶2 000)、P-Smad5-S465(1∶2 000)、SP7(1∶2 000)、Sox9(1∶2 000)、GAPDH(1∶2 000)室温杂交1 h；ECL的A，B两种试剂按照1∶1混合配置发光液，使发光液均匀浸润洗涤后的PVDF膜发光。通过Image J对条带进行扫描处理量化得到SP7、Smad5、P-Smad5-S465、Sox9相对蛋白表达量后进行分析。
1.5 主要观察指标 ①大鼠足踝部软骨组织病理变化；②软骨骨化相关因子的表达；③踝部组织Smad5、SP7以及Sox9在mRNA水平的表达；④踝部组织Smad5、P-Smad5-S465、SP7以及Sox9的蛋白表达。
1.6 统计学分析所有统计分析均使用GraphPad Prism 8软件进行，结果以x±s表示，进行t检验，差异显著水平为P < 0.05。文章的统计学方法已通过沈阳医学院统计学专家审核。

讨论

先天性马蹄内翻足作为一种严重危害儿童健康的先天性畸形，其病因及发病机制有较多解释学说，包括骨骼发育不良、神经肌肉病变、软组织挛缩、血管异常以及软骨发育异常等[18]。在骨骼形态方面主要表现为跗骨畸形，即跟骨、距骨和舟骨的位置关系异常。另外有研究表明，跗骨的骨化中心发育迟缓也是导致胚胎期马蹄内翻足发生的一个重要原因[19-20]。与报道相类似，此次研究通过苏木精-伊红染色发现，在先天性马蹄内翻足大鼠足踝部出现骨骼发育不良、软骨细胞减少、软组织挛缩等病理性改变。
在先天性马蹄内翻足发生发展的过程中，软骨特异性分子Sox9表达异常参与介导软骨细胞数量减少，分化程度较低，胞外蛋白多糖含量减少，最终导致足踝部软组织挛缩[21]。此外Sox9在骨骼的发育中亦发挥关键作用，Sox9有效地与DNA中的单个或双个HMG-box位点结合，从而激活其靶基因，如Ⅱ型胶原A1和Acan(聚集聚糖)，这些基因对关节软骨发育具有阶段特异性特征，是软骨细胞中的关键转录因子，对软骨细胞的增殖至关重要[22-23]。而Sox9的成软骨活性不仅取决于蛋白质的完整性，还取决于翻译后修饰，其中Sox9的S64和S181位点的磷酸化已被证明与软骨发育异常有关，其机制主要通过体外增加Sox9转录活性，并通过PKA(cAMP依赖的蛋白激酶)依赖的方式延迟PTHrP信号下游软骨细胞的成熟[24]。此次研究发现无论是在mRNA水平还是蛋白质水平，马蹄内翻足大鼠足踝部组织的Sox9都出现升高趋势。
BMP在骨代谢中发挥重要作用。BMP/Smad通路是由BMP信号途径和靶细胞基因共同组成的一个完整信号通路，在间充质干细胞的成骨细胞分化中起着重要作用[25]。成骨细胞是骨形成的主要功能细胞，是维持骨形成和骨吸收动态平衡的关键因素[26]。BMP属于转化生长因子超家族，是诱导成骨细胞分化的主要信号蛋白之一，可引导间充质干细胞向骨祖细胞转化[27]。在胚胎发育过程中，BMP信号通路的基因突变会导致遗传性发育性骨病，而BMP信号通路的失调往往与骨质疏松症或骨关节炎有关[28]。Smad蛋白在BMP/Smad传导中发挥关键作用，其中Smad1/5/8作为BMP的关键下游结合因子介导BMP信号传导[29-30]。另外有研究表明，其在软骨、血管、肌肉和纤维结缔组织的形成和维持中也发挥着重要作用[31]。典型BMP信号传导是在BMP配体结合到由Ⅰ型和Ⅱ型BMP跨膜丝氨酸/苏氨酸激酶受体(BMPR)组成的异四聚体受体复合物后启动的[32]。随后，活性BMP Ⅱ型受体通过磷酸化激活BMPⅠ型受体，而BMPRⅠ型磷酸化受体可激活R-Smad 1，5和8，与辅助受体co-Smad4形成三聚体，并易位到细胞核，R-Smad/Co-Smad复合物通过结合BMP靶基因启动子区域的BMP响应元件并招募转录因子和共激活因子来诱导靶基因的转录[33]。
丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)独立于Smad蛋白，可通过BMPRⅠ型介导的磷酸化激活。另外成骨细胞中的BMP信号也被证明通过磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)通路发挥作用[34-35]。RUNX2与SP7是BMP/Smad信号通路下游的蛋白，SP7在软骨分化成熟和骨形成过程中发挥重要作用，SP7位于RUNX2下游，它们之间相互调节，从而协调成骨细胞与软骨细胞的相互转化[36-37]。成骨分化与软骨形成障碍常出现于骨关节炎、成骨不全以及胚胎期四肢畸形病变中，另有研究表明，Sox9与BMP信号通路在软骨的发育和软骨内骨化中存在高度相关性，骨形态蛋白激活BMP/Smad信号通路并调节成骨基因转录，从而发挥成骨作用[38-39]。
在此次研究中先天性马蹄内翻足大鼠足踝部组织中BMP/Smad信号通路传导异常，表现为SP7表达降低，P-Smad5/Smad5比值也降低。鉴于BMP/Smad信号通路通过磷酸化下游蛋白Smad1，5和8进行信号传导，作者认为P-Smad5与Smad5比值降低是BMP/Smad信号通路传导受阻的主要体现，而SP7表达的降低也进一步验证了马蹄内翻足大鼠足踝部软骨发育不良与BMP/Smad通路传导受阻密切相关。这些结果均证实了马蹄内翻足模型大鼠足踝部软骨发育异常与BMP/Smad信号通路传导受阻有高度相关性。
此次研究的先天性马蹄内翻足大鼠模型是应用135 mg/kg维甲酸灌胃获得的，这种方法所获得的先天性马蹄内翻足胎鼠具有胚胎毒性及合并畸形率低的优点，目前被国内外学者普遍接受。但由于维甲酸具有一定的胚胎毒性，所以获得的实验胎鼠除具有马蹄足畸形外，部分还伴有一定的眼部畸形、尾部畸形、脊柱裂、肛门闭锁以及少数死胎、吸收胎等合并畸形的情况，这对先天性马蹄内翻足模型的制作产生了极大的影响[40]。人类患儿先天性马蹄内翻足畸形的病因包括神经、血管、肌肉，环境因素和遗传因素等，其多数仅表现为足踝部的畸形而不会出现其他的合并畸形。因此作者所应用的模型制作方法虽然与临床病例有一定的相似性但也有较多的不足。在接下来的实验中，将根据此种造模方式的局限性，探究更有针对性引发马蹄内翻病变的造模方式，使得实验更有科学性及严谨性。
综上所述，BMP/Smad信号通路受阻是导致先天性马蹄内翻足模型大鼠足踝部软骨发育异常的相关因素。BMP/Smad信号通路在马蹄内翻足模型大鼠中表现出传导受阻的现象，其受体蛋白Smad5与下游蛋白SP7的异常表达可能是导致大鼠胚胎期后肢软骨发育不全、软组织挛缩的原因之一。这为马蹄内翻足进展过程中软骨发育异常的原因探究了新的思路。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

BMP/Smad信号通路与先天性马蹄内翻足模型大鼠足踝部的软骨发育

Bone morphogenetic protein/Smad signaling pathway involved in chondrodysplasia in the ankle of a rat congenital clubfoot model

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[1]	李浩亮, 李东方. 大黄素抑制miR-338-3p表达促进骨质疏松性骨折大鼠的愈合[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(32): 5155-5161.
[2]	邱诗阳，付希佳，白晓雪，杨军. miR-155通过抑制SMAD5调控成骨细胞骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(4): 538-544.
[3]	余水生，程里，许新忠，柯友群，荆珏华. 趋磁细菌磁小体靶向输送pHSP70-shPLK1/阿霉素复合物治疗骨肉瘤[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(18): 2906-2912.
[4]	郭盖，卜淑敏，陈冠洁. 氯化锂对去卵巢骨质疏松大鼠骨微结构和骨髓基质细胞分化的影响[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(41): 6584-6589.
[5]	陈波，杜远立，李玉鹏，王华，武斌，茹能，乐锦波. 骨锚置入先天性马蹄内翻足矫形固定胫前肌腱过程中的生物力学变化[J]. 中国组织工程研究, 2011, 15(4): 629-632.
[6]	林志伟，王应球，郑群香. 不同材料矫形器的生物学性能[J]. 中国组织工程研究, 2011, 15(21): 3965-3968.
[7]	刘树欣，卢红梅，刘玉倩，王海涛，康红哲，李文惠，陈军. 铁调素的表达与调节机制[J]. 中国组织工程研究, 2010, 14(41): 7739-7742.