大鼠经过不同浓度大黄素和miR-338-3p mimic处理，8周后检测大鼠股骨中段及L5骨密度，与单纯骨折组相比，大黄素低、中、高剂量组大鼠股骨中段及L5骨密度升高(P < 0.05)，且呈剂量依赖性；大黄素高剂量+miR-338-3p mimic组股骨中段和腰椎骨密度高于骨折组(P < 0.05)，低于大黄素高剂量组(P < 0.05)，见图1B、C。



2.3   各组大鼠股骨形态学观察    见图2。

苏木精-伊红染色显示，大黄素高、中、低剂量组中软骨性骨痂组织少于骨性骨痂组织，且骨小梁较粗、致密、数量多，大黄素高剂量组骨小梁结构更密集、排列整齐，单纯骨折组骨小梁较细、间隙大、结构较乱和疏松；大黄素高剂量+miR-338-3p mimic组骨小梁也较细，但间隙较小，结构较为疏松。

定量分析结果显示，单纯骨折组骨小梁面积低于假手术组(P < 0.05)，大黄素低、中、高剂量组骨小梁面积高于单纯骨折组(P < 0.05)，且呈剂量依赖性；大黄素高剂量+miR-338-3p mimic组骨小梁面积低于大黄素高剂量组P < 0.05)，高于单纯骨折组(P < 0.05)。
2.4   各组大鼠骨痂组织中miR-338-3p的表达   RT-qPCR检测结果显示，单纯骨折组miR-338-3p mRNA表达水平高于假手术组(P < 0.05)；与单纯骨折组相比，大黄素低、中、高剂量组miR-338-3p mRNA表达水平降低，且呈剂量依赖性(P < 0.05)；大黄素高剂量+miR-338-3p mimic组miR-338-3p mRNA表达水平高于大黄素高剂量组和单纯骨折组(P < 0.05)，见图3。



2.5   各组大鼠血清炎症因子水平   见图4。

与假手术组相比，单纯骨折组血清NO水平降低(P < 0.05)；与单纯骨折组相比，大黄素低、中、高剂量组血清NO水平升高(P < 0.05)，且具有剂量依赖性。大黄素高剂量+miR-338-3p mimic组血清NO水平高于单纯骨折组(P < 0.05)，低于大黄素高剂量组(P < 0.05)。与假手术组相比，单纯骨折组血清肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β水平升高(P < 0.05)；与单纯骨折组相比，大黄素低、中、高剂量组血清肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β水平降低(P < 0.05)，且呈剂量依赖性(P < 0.05)。大黄素高剂量+miR-338-3p mimic组血清肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β水平高于大黄素高剂量组(P < 0.05)，低于单纯骨折组(P < 0.05)。
2.6   各组大鼠骨痂组织中成骨相关蛋白表达   见图5。

与假手术组相比，单纯骨折组碱性磷酸酶、骨钙蛋白和Runx2的蛋白表达水平降低(P < 0.05)；与单纯骨折组相比，大黄素低、中、高剂量组碱性磷酸酶、骨钙蛋白和Runx2的蛋白表达水平升高(P < 0.05)，且呈剂量依赖性；大黄素高剂量+miR-338-3p mimic组碱性磷酸酶、骨钙蛋白和Runx2的蛋白表达水平低于大黄素高剂量组(P < 0.05)，高于单纯骨折组(P < 0.05)。
2.7   各组大鼠骨痂组织中ERK/BMP/Smad通路相关蛋白表达  见图6。

与假手术组相比，单纯骨折组p-ERK1/2和p-JNK蛋白表达水平升高(P < 0.05)，骨形态发生蛋白2和p-Smad5蛋白表达水平降低(P < 0.05)；与单纯骨折组相比，大黄素低、中、高剂量组p-ERK1/2和p-JNK蛋白表达水平降低(P < 0.05)，骨形态发生蛋白2和p-Smad5蛋白表达水平升高(P < 0.05)，且呈剂量依赖性；大黄素高剂量+miR-338-3p mimic组p-ERK1/2和p-JNK蛋白水平高于大黄素高剂量组，骨形态发生蛋白2和p-Smad5蛋白水平低于大黄素高剂量组(P < 0.05)。

骨质疏松症是骨质脆性增加、易发生骨折的骨组织疾病[1-2]。骨质疏松性骨折是由骨质疏松症引起的严重创伤性骨折，以骨量下降和骨小梁结构恶化为特征，多发于椎体、股骨近端、肱骨远端和桡骨远端，发病率高、致残率高[3-4]。随着年龄的增长，骨质疏松性骨折的发生率将逐渐增高。据报道，2010年中国发生骨质疏松性骨折患者约233万例，至 2050年骨质疏松性骨折患者将达到599万例[3]。因此，骨质疏松性骨折不仅是一个公共健康问题，还是一个重要的社会问题[5]。骨折的成功愈合依赖于炎症、血管形成、软骨形成和成骨细胞的募集、迁移和归巢[6]。成骨细胞形成骨和破骨细胞吸收骨为特征的骨重塑失衡，是很多骨骼疾病的原因，包括骨质疏松症[7]。骨折后骨再生是由细胞因子、生长因子和转录因子参与的连续且复杂漫长的组织修复过程。在生物力学状况适宜、生物学反应良好的情况下，多种控制骨细胞系活性的因子上调，使骨痂形成，激活骨髓间充质干细胞及前成骨细胞，最终促进骨折修复形成正常骨结构。骨折愈合包括合成代谢和分解代谢的延长。骨折愈合过程非常复杂，需要遗传、细胞和生理因素的多阶段整合[8]。在这些分子的调节下，骨骼通过膜内骨化或软骨内骨化进行重塑[9]，而在此过程中成骨细胞增殖和凋亡控制是增强骨修复的关键因素[10]。因此，寻找在骨折愈合过程中调节成骨细胞和破骨细胞的方法可以显著改善骨折护理。很多中药可以通过改变骨细胞中的基因表达来影响骨稳态，包括骨重塑和骨折愈合[11]。大黄素是从大黄中分离出来的天然蒽醌和植物雌激素，具有多种药理活性，包括抑制炎症反应、抗癌、减轻组织损伤、促进血管生成和改善葡萄糖代谢等[12-14]，如大黄素可以通过下调 miR-223来减轻脂多糖诱导的炎症损伤[15]，大黄素通过提高 miR-1271的表达水平来抑制胰腺癌细胞的增殖和侵袭[16]。miRNA是骨重建的关键参与者，具有调节成骨细胞和破骨细胞的功能[17-18]。miR-338-3p是一种骨组织稳态的调节分子[19]，可以通过靶向IKKβ 基因调节破骨细胞生成[20]，通过靶向 Runx2和Fgfr2调节小鼠骨髓基质干细胞的成骨分化[21]，通过靶向MafB抑制破骨细胞分化来调节骨质疏松症[22]。但其如何参与成骨细胞和骨形成的过程尚不清楚。此次实验通过建立骨质疏松性大鼠骨折模型，探讨大黄素和miR-338-3p对骨质疏松性骨折大鼠炎症及成骨相关基因表达的影响，为骨质疏松性骨折的临床研究提供理论基础。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1   设计   对比观察体内动物实验，两组间比较采用t检验，多组间差异比较采用单因素方差分析。
1.2   时间及地点   实验于2020年9月至2021年5月在河南省中医院河南中医药大学实验动物中心完成。
1.3   材料
1.3.1   主要药物与试剂   大黄素(货号：S30748，95%)购自上海源叶生物科技有限公司；NO含量检测试剂盒购自北京索莱宝公司；肿瘤坏死因子α试剂盒购自北京冬歌博业生物科技公司；白细胞介素1β试剂盒购自南京森贝伽生物科技公司；抗ERK1/2抗体(货号：ab184699)、抗phospho-ERK1/2抗体(p-ERK1/2，货号：ab223500)抗JKN抗体(货号：ab40766)、抗phospho-JNK抗体(货号：ab32385)、抗骨形成蛋白2抗体(货号：ab214821)、抗Smad5抗体(货号：ab40771)、抗phospho-Smad5抗体(p-Smad5，货号：ab92698)、抗碱性磷酸酶抗体(货号：ab229126)、抗骨钙蛋白抗体(货号：ab133612)、Runx2(货号：ab236639)、β-actin、HRP山羊抗兔二抗，均购自英国Abcam生物科技公司；ECL化学发光试剂盒(36208ES60)购自上海翊圣生物科技公司；miR-338-3p模拟物(miR-338-3p mimic)及其阴性对照(NC mimic)购自Santa Cruz 生物科技公司。
1.3.2   实验动物   53只健康雌性SD大鼠，6周龄，清洁级，体质量275-310 g，购自郑州大学实验动物中心，动物合格证编号为：SYXK(豫)2020-0008。于郑州大学标准动物实验室内饲养，环境温度控制在(22±3) ℃，湿度45%-60%，采用昼夜节律12 h 间隔照明，分笼饲养，实验期间保证自由进食。动物实验经河南省中医院河南中医药大学第二附属医院伦理委员会批准(HNZYY-20190339)，并符合美国国立卫生研究院批准的《实验动物的护理和使用指南》。
1.4   实验方法   
1.4.1   实验分组及骨折大鼠模型制备   6周龄SD大鼠在动物房适应性喂养到11周，待性成熟后随机抽签法分为假手术组(5只)和骨质疏松组(48只)[23]。假手术组大鼠行假性卵巢摘除手术，手术时显露和确认卵巢后缝合伤口。骨质疏松组大鼠进行双侧卵巢切除手术，充分止血后缝合伤口。3个月后，从假手术组和骨质疏松组中随机选出5只大鼠进行腰椎骨密度检查，确认造模成功。

确定骨质疏松造模成功后，在无菌条件下用3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(50 mg/kg)大鼠，沿右侧股骨外侧纵形切口，用弯钳钝性分离肌肉，露出股骨中断，钢锯横行切断，克氏针(直径 1 mm)髓腔逆行内固定，依次缝合关闭切口，建立大鼠股骨骨折模型。造模后，采用随机数字表法分为6组，每组8只，分别为单纯骨折组、大黄素低剂量组(10 mg/kg)、大黄素中剂量组(20 mg/kg)、大黄素高剂量组(40 mg/kg)、大黄素高剂量+NC mimic组和大黄素高剂量+miR-338-3p mimic组。大黄素为灌胃给药，剂量分别为10，20，40 mg/kg，1次/d，连续8周。NC mimic与miR-338-3p mimic为骨痂注射给药，剂量为2 mg/kg，1次/d，连续7 d。假手术组与单纯骨折组灌胃给予等剂量含0.1%吐温80的生理盐水(溶剂对照)，剂量为7.5 mL/kg，1次/d，连续8周。

术后，大鼠分笼饲养，每只大鼠腹腔注射40×104 U青霉素，连续3 d，预防感染。
 

1.4.2   骨密度测定   给药结束后次日，采用0.4%戊巴比妥钠0.1 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，采用双能X射线小动物骨密度仪检测大鼠右侧股骨中段及L5骨密度值。
1.4.3   骨组织形态学检测   骨密度检测结束后，麻醉后脱颈处死各组大鼠，用剪刀剪开皮肤，取出右侧股骨，将股骨标本用40 g/L多聚甲醛固定72 h，在10%EDTA溶液中脱钙处理4周，随后用石蜡包埋，冷却凝固成块后进行切片，苏木精-伊红染色10 min后，在显微镜下观察并采集图像。每张切片随机选取5个100倍视野，用Leica Qwin Runner彩色病理图像分析软件测量各组骨小梁面积。
1.4.4   血清炎症因子水平检测   收集各组大鼠腹腔主动脉血，室温静置30 min后3 500 r/min离心10 min，取上清，分别加入96孔板中，严格按照NO、肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β的ELASE检测试剂盒操作说明进行操作，于450 nm波长处用酶标仪检测吸光度值。根据已知浓度的标准样品吸光度值绘制标准曲线，将各组待测样品NO、肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β的吸光度值代入标准曲线，计算各个样品的浓度。实验重复3次，取平均值。
1.4.5   骨痂组织中miR-338-3p表达水平检测   取各组大鼠骨痂组织，使用TRIzol试剂提组织总RNA取，按照制造商说明书要求和以往的文献报道进行[24-25]。利用反转试剂盒将总RNA反转录成cDNA。cDNA扩增采用PrimeScript RT Master Mix，采用25 μL反应体系，包含12.5 μL的SYBRPremix Ex Taq Ⅱ、上游引物0.5 μL、下游引物0.5 μL、cDNA 1 μL、灭菌双蒸水 10.5 μL。PCR程序为：95 ℃ 10 min，25个循环，95 ℃持续15 s，60 ℃持续60 s。设计引物：miR-338-3p，上游引物：5′- ATC CAG TGC GTG TCG TGG -3′，下游引物：5′- TGC TTC CAG CAT CAG TGA T -3′；内参U6，上游引物：5′- ACC CTG AGA AAT ACC CTC ACA T-3′，下游引物：5′-GAC GAC TGA GCC CCT GAT G-3′。采用2-ΔΔCt方法计算mRNA的表达水平。
1.4.6   骨痂组织中相关蛋白表达   取各组大鼠骨痂组织，PBS清洗后，用RIPA裂解液提取总蛋白，并使用BCA试剂盒测定蛋白浓度。将30 μg的总蛋白与上样缓冲液按4∶1比例混合后，在95℃下煮沸10 min，每孔10 μL上样，用12%的SDS-PAGE分离后，用转膜仪将蛋白转移至PVDF膜，随后用5%脱脂牛奶封闭1 h，洗膜后一抗分别为抗碱性磷酸酶抗体(1∶500)、抗骨钙蛋白抗体(1∶500)、Runx2(1∶500)、ERK1/2(1∶1 000)、p-ERK1/2(1∶10 000)、JKN(1∶500)、p-JNK(1∶500)、骨形态发育蛋白2(1∶500)、Smad5(1∶500)、p-Smad5(1∶500)，4 ℃孵育过夜，加HRP山羊抗兔二抗(1∶1 000)室温孵育1 h，TBST洗膜3次后，在ECL显影液中显色，凝胶成像系统采集条带，以β-actin为内参，采用 ImageJ 软件计算目标蛋白与β-actin带灰度比值。 
1.5   主要观察指标   各组大鼠骨密度、股骨形态学、血清炎症因子及骨痂组织中相关蛋白表达水平。
1.6   统计学分析   所有数据采用SPSS 22.0进行统计学分析，采用Shapiro-Wilk方法进行正态分布检验，所有符合正态分布的数据均采用x±s表示。两组间比较采用t检验，多组间差异比较采用单因素方差分析。P < 0.05为差异有显著性意义(双尾)。该文统计学方法已经河南省中医院生物统计学专家审核。

骨质疏松性骨折是骨质疏松症最严重的后果，患者往往伴随疼痛、抑郁、活动恐惧等，具有较高的致残率和致死率。据统计，临床上5%-10%的骨折患者会出现延迟愈合甚至不愈合[26]。随着现代医学的进步，治疗骨折的方法也多种多样，以手术方法和固定方法更新进步最快，尽管手术越做越完美、内固定越来越可靠，但骨折愈合速度似乎并未出现太大的变化[27]。骨折愈合是一个复杂的生物过程，包括活血化瘀、接骨续筋、成骨钙化等阶段，说明骨折痊愈的时间较长。在骨折修复的不同阶段，中医药良好的疗效已经在漫长历史的临床诊疗过程中得到了充分印证，中医运用中药治疗骨折历史悠久[28-29]。实践证明，中医药促进骨折愈合具有独特优势，中医治疗骨折既注重整体观、辨证论治与动静结合的治疗观点，又强调整复、外固定、练功和内外用药4大疗法的综合运用[30]。骨折后，影响骨折愈合的因素包括骨折切口部位是否存在严重的开放性损伤、感染，患者是否患有糖尿病、营养不良和恶性病变，以及患者是否吸烟和吸毒[31-32]。除此之外，研究人员发现破骨细胞的骨吸收和成骨细胞的骨形成之间的平衡，可以维持骨量在体内的稳定状态，当骨吸收大于骨形成时，可能导致包括骨质疏松症在内的大多数成人骨骼疾病[33]。骨密度能反映骨转换状态，被用于预测骨折风险和骨质疏松症的诊断[34]。在骨折中，骨形成被抑制、骨吸收增强，平衡被打破，骨折大鼠的骨密度值低于假手术组，说明骨结构的稳定性被破坏。大黄素作为一种应用广泛的蒽醌类天然产物，已被报道对多种疾病有治疗作用，包括骨质疏松[35]。YANG等[36]报道大黄素可增加卵巢切除小鼠成骨细胞数量，增加成骨标志物基因和蛋白的表达。LEE等[37]报道大黄素可以增加骨小梁的体积和厚度，促进骨折愈合。此次实验结果显示，大黄素可显著增加骨折大鼠腰椎和股骨中段的骨密度、骨小梁面积和厚度，且呈剂量依赖性。骨钙蛋白与碱性磷酸酶是成骨细胞成熟和骨矿化的标志物[38-39]，Runx2是早期成骨细胞特异性转录因子，对成骨细胞的形成和分化具有重要作用[40]。骨折大鼠中碱性磷酸酶、骨钙蛋白和Runx2蛋白表达显著降低，表明在骨折中成骨细胞分化被抑制，而大黄素处理后可增加碱性磷酸酶、骨钙蛋白和Runx2的蛋白表达，且呈浓度依赖性，表明大黄素可促进成骨相关蛋白的表达。

股骨外侧壁承受人体的张力，其完整能有效防止股骨头颈骨块旋转和内翻，帮助骨折部位复位丢失，减少骨折并发症的发生[40-41]，因此，股骨转子外侧壁不稳定易导致骨折部位稳定性下降。内侧壁承受人体的压力，其完整性是决定骨折稳定性和患者预后的重要因素。老年骨质疏松患者由于股骨骨质松，受力大，骨折后因内、外侧壁损伤严重难于愈合，因此对外侧壁和内侧壁的重建也显得尤为重要。大黄素对于骨质疏松性骨折大鼠有一定的促愈合作用，但其对内、外侧壁的修复作用仍有待探讨。

大黄素对炎症具有较好的抑制作用。DONG等[42]报道大黄素通过发挥抗炎活性抑制肺炎的进展。骨折通常伴随着炎症反应的发生，炎症反应可激活一系列细胞因子，影响破骨细胞和成骨细胞的分化和功能[43]。此次实验结果显示，给予不同剂量大黄素处理可显著抑制骨折大鼠血清中肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β水平，说明大黄素参与骨折大鼠骨愈合过程有可能是通过抑制炎症反应来实现的。

miRNA与成骨细胞的分化密切相关，通过调节其在患者体内的含量和表达水平，有可能成为治疗骨质疏松症的新靶点[44]。大黄素被报道可通过调节多种miRNA的表达参与疾病的发展，如大黄素通过上调miR-1271的表达抑制胰腺癌细胞的侵袭[16]；大黄素通过下调miR-223的表达减轻脂多糖诱导的心肌损伤[15]。miR-338-3p被报道可通过调节前蛋白转化酶枯草溶菌素5抑制年龄相关性的骨质疏松症，但其在骨质疏松症中的具体作用机制尚不完全清楚。此次实验结果显示，miR-338-3p在去卵巢大鼠骨痂组织中高表达，经大黄素治疗的大鼠骨痂组织中其表达水平随着大黄素剂量的升高而降低，因此猜想大黄素促进骨质疏松症恢复可能是与抑制miR-338-3p的表达有关。随后分析了miR-338-3p在骨质疏松性骨折中的作用，发现给予高剂量大黄素治疗的同时注射miR-338-3p mimic，可显著逆转高剂量大黄素对大鼠腰椎和股骨中段骨密度、骨痂组织骨小梁面积和炎症水平的改善，以及对成骨相关蛋白的促进作用。miRNA可调控靶基因或者相应的信号转导途径影响成骨细胞或破骨细胞形成和功能[45-46]，因此miR-338-3p对下游蛋白的调控是后续研究的方向。

ERK/JNK信号通路与成骨因子的激活密切相关[47]。CHEON等[48]报道辛伐他丁通过呈剂量依赖性地抑制ERK/JNK的表达，进而促进成骨细胞的形成来治疗骨质疏松症。茴香可通过抑制ERK/JNK信号通路的激活促进成骨基因的表达[49]。成骨细胞来源于间充质干细胞，受各种成骨信号分子与转录因子如骨形态发生蛋白2的调控，而骨形态发生蛋白2可通过Smad5激活多能性间质细胞向成骨细胞谱系分化[50]。此次实验结果显示，磷酸化ERK和JNK的蛋白在骨折大鼠骨痂组织中表达显著增加，骨形态发生蛋白2和磷酸化的Smad5的表达水平显著降低，大黄素可呈剂量依赖性地抑制磷酸化ERK和JNK的蛋白表达、促进骨形态发生蛋白2和磷酸化的Smad5表达水平，而过表达miR-338-3p可显著逆转高剂量大黄素对ERK/BMP/Smad5信号通路的抑制作用。

综上所述，此次实验结果显示，大黄素可呈剂量依赖性地促进骨质疏松性骨折的愈合，其机制可能为抑制骨折大鼠炎症反应和miR-338-3p的表达、促进成骨相关蛋白表达和激活ERK/BMP/Smad5信号通路，但骨质疏松性骨折愈合的过程涉及多种机制和通路，此次实验只从miR-338-3p、成骨相关蛋白表达水平和ERK/BMP/Smad5信号通路出发，故后续应进行更多的实验，进一步探索大黄素促进骨折愈合的机制。
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文题释义：
miR-338-3p：以往的研究表明，miR-338-3p在多种组织和细胞分化过程中异常表达，在骨髓基质细胞成骨细胞分化过程中miR-338-3p表达显著下调，在去卵巢小鼠中miR-338-3p表达上调，其不仅参与干细胞的生长、增殖和分化，在神经系统、肿瘤侵袭和成骨分化过程中同样发挥调控作用。
骨形态发生蛋白2：是骨形成最重要的调节因子，也是目前公认的促进骨形成因子，具有诱导未分化间充质干细胞向成软骨细胞和成骨细胞定向分化与增殖的能力，促进骨组织再生。

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大黄素是从大黄中分离出来的天然蒽醌和植物雌激素，具有多种药理活性，包括抑制炎症反应、抗癌和改善葡萄糖代谢等，如大黄素可以通过下调 miR-223 来减轻脂多糖诱导的炎症损伤；大黄素通过提高 miR-1271 的水平来抑制胰腺癌细胞增殖和侵袭。MiRNA是骨重建的关键参与者，具有调节成骨细胞和破骨细胞的功能。MiR-338-3p是一种骨组织稳态的调节分子，但其是如何参与成骨细胞和骨形成的过程尚不清楚。此次实验通过建立骨质疏松性大鼠骨折模型，探讨大黄素和miR-338-3p对骨质疏松性骨折大鼠炎症及成骨相关基因表达的影响，为骨质疏松性骨折的临床研究提供理论基础。

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