丹参减轻新生大鼠低灌注性白质损伤

doi:10.12307/2024.343

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (20): 3229-3234.doi: 10.12307/2024.343

• 组织构建实验造模 experimental modeling in tissue construction • 上一篇下一篇

丹参减轻新生大鼠低灌注性白质损伤

苏学文，袁海凤，冯万禹，宋瑞霞，陈俊龙，伊儒晗，朱华，窦忠霞

内蒙古自治区人民医院，内蒙古自治区呼和浩特市 010010

收稿日期:2023-03-30 接受日期:2023-06-01 出版日期:2024-07-18 发布日期:2023-09-11
通讯作者: 窦忠霞，博士，主任医师，内蒙古自治区人民医院，内蒙古自治区呼和浩特市 010010
作者简介:苏学文，男，1982年生，内蒙古自治区达拉特旗人，汉族，2017年南方医科大学毕业，博士，副主任医师，主要从事小儿神经系统方向的研究。袁海凤，女，1981年生，内蒙古自治区包头市人，汉族，2019年南方医科大学毕业，博士，副主任医师，主要从事神经病学方向的研究。
基金资助:
内蒙古自治区自然科学基金(2018MS08067)，项目负责人：苏学文

Salvia miltiorrhiza attenuates white matter injury induced by hypoperfusion in neonatal rats

Su Xuewen, Yuan Haifeng, Feng Wanyu, Song Ruixia, Chen Junlong, Yi Ruhan, Zhu Hua, Dou Zhongxia

Inner Mongolia People’s Hospital, Hohhot 010010, Inner Mongolia Autonomous Region, China

Received:2023-03-30 Accepted:2023-06-01 Online:2024-07-18 Published:2023-09-11
Contact: Dou Zhongxia, MD, Chief physician, Inner Mongolia People’s Hospital, Hohhot 010010, Inner Mongolia Autonomous Region, China
About author:Su Xuewen, MD, Associate chief physician, Inner Mongolia People’s Hospital, Hohhot 010010, Inner Mongolia Autonomous Region, China Yuan Haifeng, MD, Associate chief physician, Inner Mongolia People’s Hospital, Hohhot 010010, Inner Mongolia Autonomous Region, China
Supported by:
Natural Science Foundation of Inner Mongolia Autonomous Region, No. 2018MS08067 (to SXW)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

白质损伤：指大脑的白质部分出现了疾病和损伤，是早产儿最常见的脑损伤，在极低出生体质量儿中，白质损伤发病率高达50%，白质发育期间髓鞘形成的失败被认为是早产白质损伤的原因。
脱髓鞘：是指髓鞘形成后发生的髓鞘损坏，少突胶质细胞损伤是白质损伤的原因之一，少突胶质细胞死亡导致髓鞘修复功能丧失，并导致严重脱髓鞘。

背景：早产是一个高发病率和高死亡率的重大的全球性健康问题。白质损伤是早产儿最常见的脑损伤。丹参是一种传统的草药，在亚洲国家最常用于治疗心脑血管疾病。

目的：探讨丹参在早产儿脑白质损伤方面的治疗作用。
方法：选取3 d龄新生雄性SD大鼠18 只，随机分为正常组、白质损伤组、白质损伤+丹参组，后两组通过永久性结扎右侧颈总动脉建立早产白质损伤大鼠模型，正常组不造模。白质损伤+丹参组自造模第1天起给予丹参5 mg/(kg•d)腹腔注射，正常组及白质损伤组给予同剂量PBS进行干预，连续给药7 d。造模14 d后处死大鼠，采用苏木精-伊红染色显微镜下观察大鼠脑组织病理情况，免疫荧光法观察髓鞘碱性蛋白和CC1在脑组织中的表达水平，应用液相色谱-质谱联用仪分析丹参发挥作用的可能途径。

结果与结论：①白质损伤组大鼠胼胝体结构不规则，细胞肿胀坏死，髓鞘形成显著减少，神经纤维排列不规则且松散，髓鞘显著减少；与白质损伤组相比，白质损伤+丹参组大鼠脑组织细胞肿胀减轻，损伤减轻，髓鞘增多；②髓鞘碱性蛋白与髓鞘的形成密切相关，CC1是髓鞘少突胶质细胞的标志物，白质损伤组大鼠脑组织中髓鞘碱性蛋白及CC1表达显著降低；白质损伤+丹参组大鼠脑组织中髓鞘碱性蛋白及CC1的表达显著增加(P < 0.000 1)，表明丹参减轻了白质损伤；③液相色谱-质谱联用仪分析发现白质损伤+丹参组和白质损伤组之间差异最显著的蛋白与补体和凝血级联反应有关；④研究表明丹参具有治疗早产白质损伤的潜在运用价值。

https://orcid.org/0009-0003-4825-0520(苏学文)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 丹参, 早产儿, 白质损伤, 髓鞘碱性蛋白, 补体与凝血级联反应

Abstract: BACKGROUND: Premature birth is a major global health problem associated with high mortality and morbidity. White matter injury is the most common brain injury in preterm infants. Salvia miltiorrhiza is a traditional herbal plant that is commonly used to treat cardiovascular and cerebrovascular diseases in Asian countries.
OBJECTIVE: To investigate the therapeutic effect of Salvia miltiorrhiza on white matter injury in preterm infants.
METHODS: Eighteen neonatal male Sprague-Dawley rats at 3-day gestational age were selected and randomized into normal group, white matter injury group, and Salvia miltiorrhiza group. Animal models of preterm white matter injury were established by permanent ligation of the right common carotid artery in the latter two groups. Rats in the Salvia miltiorrhiza group were given intraperitoneal injection of Salvia miltiorrhiza (5 mg/kg•d) for 7 consecutive days. Normal group and white matter injury group were given the same volume of PBS for intervention. On the 14th day after modeling, the rats were sacrificed. Brains were pathologically observed by hematoxylin-eosin staining under microscope, and the expression levels of myelin basic protein and CC1 in brain tissue were visualized using immunofluorescence. Furthermore, liquid chromatography-tandem mass spectrometry was used to analyze possible pathways for the action of Salvia miltiorrhiza.
RESULTS AND CONCLUSION: In the white matter injury group, the structure of the corpus callosum was irregular and the cells appeared swollen and necrotic. In addition, induction of white matter injury resulted in significantly reduced myelin formation, with irregular and loosely arranged nerve fibers and significantly decreased myelin sheaths. Interestingly, white matter injury rats treated with Salvia miltiorrhiza had reduced cellular swelling, reduced lesions, and increased myelin sheaths. The expression of myelin basic protein was closely related to myelin formation, and CC1 was a marker of myelin oligodendrocytes. Salvia miltiorrhiza significantly up-regulated the expressions of myelin basic protein and CC1 in white matter injury rats (P < 0.000 1), indicating that Salvia miltiorrhiza alleviated white matter injury. Liquid chromatography-tandem mass spectrometry analysis showed that the therapeutic effect of Salvia miltiorrhiza in the rat model of white matter injury was closely related to the regulation of complement and coagulation cascades. To conclude, Salvia miltiorrhiza may be a potential therapeutic agent for treating preterm white matter injury.

Key words: Salvia miltiorrhiza, preterm infant, white matter injury, myelin basic protein, complement and coagulation cascades

中图分类号:

苏学文, 袁海凤, 冯万禹, 宋瑞霞, 陈俊龙, 伊儒晗, 朱华, 窦忠霞. 丹参减轻新生大鼠低灌注性白质损伤[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(20): 3229-3234.

Su Xuewen, Yuan Haifeng, Feng Wanyu, Song Ruixia, Chen Junlong, Yi Ruhan, Zhu Hua, Dou Zhongxia. Salvia miltiorrhiza attenuates white matter injury induced by hypoperfusion in neonatal rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(20): 3229-3234.

图/表（结果） 6

2.1 实验动物数量分析实验选入18只大鼠，随机分为 3 组，全部进入结果分析。
2.2 丹参减少白质损伤建模后第14 天，取大鼠脑组织多聚甲醛固定并进行苏木精-伊红染色。正常组大鼠胼胝体结构清晰，细胞排列整齐，分布均匀，没有细胞肿胀或病理变化；白质损伤组胼胝体结构不规则，细胞肿胀坏死，此外，白质损伤组髓鞘形成显著减少，神经纤维排列不规则且松散，髓鞘显著减少；而丹参治疗的白质损伤大鼠细胞肿胀明显减少、组织损伤减轻、髓鞘增多(图1A)。
采用免疫荧光法检测MBP及CC1的表达，发现白质损伤组脑组织中MBP及CC1表达显著降低；丹参治疗后的白质损伤大鼠脑组织中MBP及CC1的表达显著增加(P < 0.000 1)，见图1B。这些结果表明丹参减轻了白质损伤。

2.3 服用丹参的白质损伤大鼠脑组织蛋白质表达的变化对3 组间表达显著差异的蛋白质进行比较评估(图2A)。白质损伤组和正常组的蛋白质表达谱分析显示，87 种蛋白质(52 种上调和35 种下调)在两组间差异表达(图2B)。此外，白质损伤组和白质损伤+丹参组的蛋白表达谱分析显示，有113种蛋白质(34 种上调，79 种下调)在两组间差异表达(图2B)。白质损伤+丹参组和正常组的蛋白表达谱分析显示，79 个基因(37 个上调，42 个下调)在两组间的表达存在差异(图2B)。作者对正常组(n=3)、白质损伤组(n=3)、白质损伤+丹参组(n=3)中差异表达的蛋白进行了聚类分析(图3)。

2.4 基因本体论分析差异表达的蛋白采用基因本体论对差异对差异表达的蛋白进行进一步分析，结果表明差异表达蛋白可分为以下3 类：生化过程相关类、细胞成分相关类和分子功能相关类。与正常组相比，白质损伤组生化过程相关类的差异蛋白主要集中在急性炎症反应、内肽酶活性的负调节和肽酶活性的负调节(图4A)，细胞成分相关类蛋白主要富集于胞外空间和胞外区域(图4B)，分子功能相关类的蛋白主要集中在内肽酶抑制剂活性、肽酶抑制剂活性、内肽酶调节活性和肽酶调节活性等(图4C)。此外，与白质损伤组相比，白质损伤+丹参组生化过程相关类蛋白主要富集于急性伤口愈合和急性炎症反应(图5A)，细胞成分相关蛋白主要富集在细胞外空间和细胞外区域(图5B)，分子功能差异类蛋白主要集中在核小体DNA结合、核小体结合、内肽酶调节活性(图5C)。

2.5 KEGG分析显示在丹参治疗后白质损伤大鼠脑组织差异蛋白主要集中在补体与凝血级联反应采用KEGG确定上述3 组中最显著富集的生物途径。KEGG分析显示，白质损伤组和正常组之间差异表达的蛋白质与补体和凝血级联、胆固醇代谢、维生素消化和吸收以及脂肪消化和吸收有关(图6A)，并且白质损伤组和正常组之间差异最显著的蛋白与补体和凝血级联有关(图6A)。
此外，白质损伤+丹参组与白质损伤组之间差异表达的蛋白与补体和凝血级联、维生素消化和吸收、胆固醇代谢和中性粒细胞细胞外捕获网形成有关(图6B)。白质损伤+丹参组和白质损伤组之间差异最显著的蛋白与补体和凝血级联反应有关，该通路中其中差异最明显的蛋白包括Serpina1及纤溶酶原的前体(图6B)。

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引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验，两组间比较采用unpaired two-sample t-test，多组间比较采用one-way ANOVA。
1.2 时间及地点实验于2021 年1 月至2022 年2 月在内蒙古自治区人民医院实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 3 d龄新生雄性SD大鼠18 只，SPF级，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物机构许可证号：SYXK(京)2022-0052。所有动物实验程序均经内蒙古人民医院动物伦理委员会批准(批准号：202303305L)，并符合中国国家卫生研究院《实验动物护理和使用指南》的要求。
1.3.2 试剂及仪器丹参，上海源叶生物科技有限公司；戊巴比妥钠，购于吉林省昊迪化学试剂有限公司；苏木精-伊红染色液及山羊血清，购于碧云天生物技术有限公司；抗髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein，MBP)一抗、CC1一抗及荧光二抗，购于Abcam公司；光学显微镜(莱卡)；荧光显微镜(莱卡)；AKTA净化器系统(GE Healthcare)。
1.4 方法
1.4.1 白质损伤的诱导和治疗 18 只大鼠按随机数字表法随机分为3 组(n=6)，即正常组、白质损伤组、白质损伤+丹参组。正常组不造模，后两组造模。无菌环境下采用3%戊巴比妥钠诱导麻醉大鼠(90 μL/只)，随后将大鼠固定在手术台上。碘伏消毒大鼠颈部皮肤，在颈部正中切口分离右侧皮下组织，寻找并分离伴行颈内静脉和迷走神经的颈总动脉。用电凝笔永久性结扎右侧颈总动脉，缝合皮肤切口。随后将大鼠置于37 ℃的恒温垫，并使其在含体积分数6%氧气和94%氮气的33 ℃缺氧室内缺氧80 min。白质损伤+丹参组自建模第1 天开始，连续7 d给予丹参5 mg/(kg•d)腹腔注射；正常组及白质损伤组给予同剂量PBS进行7 d干预。

1.4.2 苏木精-伊红染色建模后第14 天，麻醉后处死大鼠，打开胸腔，经左心室灌注PBS(约50 mL)，随后灌注40 g/L多聚甲醛。取出大鼠脑组织，固定在体积分数4%的甲醛中，随后石蜡包埋。切片并用苏木精-伊红染色，采用光学显微镜观察载玻片。

1.4.3 免疫荧光脑组织用体积分数4%甲醛固定，石蜡包埋。切片脱蜡，用PBS冲洗3 次，然后用体积分数5%山羊血清封闭60 min。封闭后，切片在4 ℃下与抗MBP一抗(1∶100)(ab40390)和抗CC1(ab2377)孵育过夜，次日采用荧光二抗孵育2 h，采用DAPI进行核染。荧光显微镜观察切片并拍照。
1.4.4 液相色谱-质谱联用(liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)分析提取脑组织蛋白质，蛋白样品(20 µg)分别与缓冲液混合，并煮沸5 min。在12.5% SDS-PAGE凝胶(恒流14 mA，90 min)上分离蛋白，考马斯蓝R-250染色显示蛋白条带。使用iTRAQ和TMT试剂标记每个样品。使用AKTA净化器系统(GE Healthcare)通过SCX色谱分离标记的肽。
在Q Extractive质谱仪(Thermo Scientific)上进行LC-MS/MS分析，并与Easy nLC(Thermo Fisher Scientific)耦合90 min。蛋白质的鉴定和定量采用ASCOT engine (Matrix Science，London，UK；version 2.2) 进行MS原始数据识别和定量分析，然后进行聚类分析、亚细胞定位、结构域注释、基因本体论注释、京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)注释、富集分析和蛋白质相互作用分析。
1.5 主要观察指标建模后第14 天，取出大鼠脑组织，光学显微镜观察脑组织病理损伤，免疫荧光法检测MBP及CC1表达；采用LC-MS/MS分析各组大鼠脑组织中蛋白的表达差异，进一步探究丹参在白质损伤中发挥作用的可能途径。

讨论

丹参始载于《神农本草经》，是唇形科鼠尾草属丹参的干燥根和根茎，味苦、性微寒，入心、肝经，具有活血补血、清心除烦、养血安神的功效。丹参已经被广泛应用于各种微循环障碍相关疾病的治疗，包括心血管疾病、脑血管疾病、肾虚、肝功能不全和糖尿病血管并发症[16]。然而，没有使用丹参治疗早产白质损伤的报道。在此次研究中，证实了丹参可以减轻新生大鼠低灌注诱导的白质损伤，并且丹参的治疗作用与补体和凝血级联的调节密切相关。
作者基于3日龄新生SD大鼠建立了早产儿白质损伤模型，通过结扎大鼠右侧颈总动脉使其缺氧，之后给予丹参治疗，发现使用丹参治疗的白质损伤大鼠脑组织细胞肿胀减少，损伤减少，髓鞘增加。在中枢神经系统中，MBP维持多片层节间致密髓鞘细胞质表面的黏附[17]，MBP在髓鞘形成前由少突胶质细胞表达，与髓鞘形成密切相关[18]。MBP被认为是中枢神经系统中成熟致密髓鞘的重要结构成分。此次研究通过检测MBP的表达，发现服用丹参后白质损伤大鼠脑组织中的MBP表达显著增加，结果表明丹参对早产儿白质损伤有保护作用。
少突胶质细胞损伤是白质损伤的原因之一，少突胶质细胞死亡导致髓鞘修复功能丧失，并导致严重脱髓鞘疾病[19-20]。减少髓鞘丢失和促进髓鞘形成是治疗脱髓鞘疾病的两种主要方法。以往的研究表明，促进内源性少突胶质细胞前体细胞的生长或移植外源性少突胶质细胞前体细胞可以使髓鞘再生[21-22]。CC1是髓鞘少突胶质细胞的标记，因而，此次研究评估了CC1的表达，发现经丹参治疗后CC1在白质损伤大鼠脑中的表达增加，该结果进一步表明丹参缓解了早产儿白质损伤。
为了进一步探究丹参在白质损伤中的作用，作者分析了正常组、白质损伤组和白质损伤+丹参组蛋白表达的差异，发现经丹参治疗的白质损伤大鼠脑组织蛋白表达发生了改变。经丹参治疗后，生化过程相关的蛋白主要集中在急性伤口愈合−相反应和急性炎症反应。补体系统是参与神经退行性疾病、炎症和脑血管疾病的一个重要因素，星形胶质细胞和神经元能够合成补体成分；髓磷脂和少突胶质细胞在体外缺乏抗体的情况下激活补体的经典途径；在没有细胞死亡的情况下，亚裂解C5b-9诱导原癌基因，激活细胞周期，提高星形胶质细胞的存活率；此外，C5b-9逆转了星形胶质细胞的分化表型，提高了细胞存活率[23-25]。补体蛋白的合成及其在中枢神经系统常驻细胞中的调控是影响炎症性中枢神经系统疾病转归的重要病理生理因素。
原代大鼠星形胶质细胞合成许多成分，包括C2、C3、C4、C5-C9、因子B、调节蛋白、因子H、因子Ⅰ、C4bp、S蛋白等[26-27]。Sublytic terminal C complexes(TCC)能够刺激细胞并影响靶细胞的活性。在少突胶质细胞中产生白三烯B4的TCC的激活是抗体介导的啮齿动物小脑外植体脱髓鞘的一个必要过程。多发性硬化症及其动物模型实验性变应性脑脊髓炎是由活化淋巴细胞、巨噬细胞/小胶质细胞和补体系统介导的中枢神经系统炎症性脱髓鞘疾病，补体激活可促进这些疾病的发病发展：激活的末端复合体C5b-9促进脱髓鞘[28]。补体水平与MBP的表达密切相关[29]，C5b-9在少突胶质细胞上的亚裂解组装减少了髓鞘蛋白、编码MBP和蛋白脂蛋白的水平[30]。在缺乏抗体的情况下，少突胶质细胞和髓鞘激活了补体的经典通路[31]；亚溶解水平的C5b-9增加少突胶质细胞的存活并诱导细胞周期[32]。在此次研究中，KEGG分析表明在丹参治疗后差异蛋白主要富集于补体和凝血级联，这些结果提示丹参的治疗作用与补体和凝血级联反应有着密切的关系。然而，具体丹参是通过调节补体和凝血级联反应中哪些关键分子进而对白质损伤大鼠进行治疗的，有待于后续实验的进一步深入探究。
综上所述，此次研究发现丹参可以降低新生大鼠低灌注诱导的白质损伤，并且丹参的治疗作用与补体和凝血级联反应密切相关，提示丹参可作为早产儿白质损伤的潜在治疗药物。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

丹参减轻新生大鼠低灌注性白质损伤

Salvia miltiorrhiza attenuates white matter injury induced by hypoperfusion in neonatal rats

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