丹参注射液联合脂肪干细胞移植改善脑梗死模型大鼠的神经功能

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.29.014

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
β-淀粉样蛋白：是由淀粉样前体蛋白经β-和γ-分泌酶的蛋白水解作用而产生的含有39-43个氨基酸的多肽。它可由多种细胞产生，循环于血液、脑脊液和脑间质液中，大多与伴侣蛋白分子结合，少数以游离状态存在。人体内β-淀粉样蛋白最常见的亚型是β-淀粉样蛋白1-40和β-淀粉样蛋白1-42。β-淀粉样蛋白1-42具有更强的毒性，且更容易聚集，从而形成β-淀粉样蛋白沉淀的核心，引发神经毒性作用。
环氧合酶：是花生四烯酸代谢的限速酶，具有环氧合酶和过氧化物酶功能的双重酶。目前环氧合酶有两个亚型，即环氧合酶1和环氧合酶2，其中环氧合酶2是一种诱导酶，在组织损伤、炎症等情况下表达增强。环氧合酶2调控机制复杂，在不同的组织器官中具有不同的功能，可能是抗炎治疗的一个靶点。

摘要
背景：研究发现，丹参注射液、脂肪干细胞分别对脑梗死大鼠具有明显的神经保护作用。
目的：观察丹参注射液联合脂肪干细胞移植对脑梗死大鼠脑组织及血清中环氧合酶2、β-淀粉样蛋白水平的影响。

方法：选取脑梗死模型大鼠63只，随机分为3组：脑梗死组、脂肪干细胞组、联合组，每组21只。造模后24 h，脑梗死组于尾静脉注射30 μL PBS，脂肪干细胞组尾静脉注射30 μL脂肪干细胞悬液(含有3×10⁶ L^-¹个脂肪干细胞)，联合组经尾静脉注射30 μL脂肪干细胞悬液(含有3×10⁶ L^-¹个脂肪干细胞)+腹腔注射丹参注射液0.5 g/(kg•d)，细胞注射1次，丹参注射液连续注射7 d。治疗后1，2，3，4周进行神经功能学缺损评分；治疗后3周，采用ELISA法检测血清环氧合酶2及β-淀粉样蛋白水平，TTC染色观察脑梗死范围，RT-PCR和蛋白免疫印迹技术检测脑组织环氧合酶2及β-淀粉样蛋白的mRNA和蛋白表达。
结果与结论：①脂肪干细胞组、联合组神经功能缺损评分明显低于脑梗死组(P < 0.05)，联合组又明显低于脂肪干细胞移植组(P < 0.05)；②与脑梗死组比较，脂肪干细胞组、联合组血清环氧合酶2及β-淀粉样蛋白水平显著降低(P < 0.05)；联合组明显低于脂肪干细胞组(P < 0.05)；③联合组梗死体积小于脂肪干细胞组(P < 0.05)，脂肪干细胞组小于脑梗死组(P < 0.05)；④与脑梗死组比较，脂肪干细胞组、联合组脑组织中环氧合酶2及β-淀粉样蛋白mRNA和蛋白表达明显下调(P < 0.05)，联合组降低更为显著(P < 0.05)；⑤结果表明，丹参注射液联合脂肪干细胞移植可改善脑梗死大鼠的神经功能，可能是通过降低脑组织及血清中环氧合酶2及β-淀粉样蛋白发挥作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0003-3501-5221(杨鹏)

关键词: 干细胞, 移植, 脑梗死, 脂肪干细胞, 丹参注射液, 细胞移植, 环氧合酶2, ；β-淀粉样蛋白

Abstract:

BACKGROUND: Both salvia miltiorrhiza injection and adipose-derived stem cells have evident neuroprotection against cerebral infarction in rats.
OBJECTIVE: To observe the effect of salvia miltiorrhiza injection combined with adipose-derived stem cell transplantation on cerebral infarction in rats and the levels of cyclooxygenase-2 (COX-2) and beta-amyloid protein (Aβ) in the serum and brain tissues.
METHODS: A rat model of cerebral infarction was successfully established in 63 rats, and then the model rats were randomly divided into three groups (n=21 per group): model group (cerebral infarction group with 30 μL of PBS via the tail vein), stem cell group (transplantation of adipose-derived stem cells, 30 μL, 3×10⁶/L, via the tail vein), salvia miltiorrhiza injection + adipose-derived stem cell transplantation(combined group with transplantation of adipose-derived stem cells, 30 μL, 3×10⁶/L, via the tail vein and intraperitoneal injection of salvia miltiorrhiza injection, 0.5g/(kg•d) for consecutive 7 days). The modified neurological severity scores of each group were evaluated before and at 1, 2, 3, and 4 weeks after treatment. At 3 weeks after treatment, MTT assay was used to detect the serum levels of COX-2 and Aβ; 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride staining was performed to detect infarction size; and RT-PCR and western blot assay were used to detect the mRNA and protein levels of COX-2 and Aβ in the brain tissues.
RESULTS AND CONCLUSION: The modified neurological severity scores in the three groups were ranked as follows: combined group < stem cell group < model group, and there were significant differences between groups (P < 0.05). Compared with the model group, the levels of COX-2 and Aβ in the serum and brain tissues at protein and mRNA levels were significantly lower in the stem cell group and combined group; compared with the stem cell group (P < 0.05), the levels of COX-2 and Aβ were significantly lower in the combined group (P < 0.05). The infarct size was smallest in the combined group, followed by the stem cell group, and biggest in the model group (P < 0.05). To conclude, salvia miltiorrhiza injection combined with adipose-derived stem cell transplantation can improve the neurological function of rats after cerebral infarction, probably through reducing the levels of COX-2 and Aβ in the rat brain and serum.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Brain Infarction, Adipose Tissue, Salvia miltiorrhiza, Cell Transplantation, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

杨鹏，高大维. 丹参注射液联合脂肪干细胞移植改善脑梗死模型大鼠的神经功能[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(29): 4673-4678.

Yang Peng, Gao Da-wei. Salvia miltiorrhiza injection combined with adipose-derived stem cell transplantation improves neurologic function of cerebral infarction rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(29): 4673-4678.

图/表（结果） 2

2.1 脂肪干细胞的形态 在显微镜下观察第3代脂肪干细胞生长旺盛，形态渐趋一致，趋向长梭形，以一点为中心向两头呈放射状。细胞呈复层生长，胞膜完整、细胞状态良好，细胞间联系紧密，见图1A。经PKH26标记的脂肪干细胞，荧光显微镜观察可见红色荧光，标记率达98%，见图1B。

2.2 神经功能学mNSS评分 由表1可见，治疗前各组大鼠神经功能损伤评分差异无显著性意义(P > 0.05)；治疗1-4周后脂肪干细胞组的神经功能缺损评分显著低于脑梗死组，联合组又明显低于脂肪干细胞组(P < 0.05)。提示脂肪干细胞移植治疗能够改善脑梗死模型大鼠神经功能，而联合治疗方法对大鼠神经功能的改善更显著。

2.3 血清环氧合酶2及β-淀粉样蛋白水平 由表2可见，与脑梗死组比较，脂肪干细胞组大鼠血清环氧合酶2及β-淀粉样蛋白水平显著降低(P < 0.05)；联合组大鼠血清环氧合酶2及β-淀粉样蛋白水平降低更明显(P < 0.05)。联合组血清环氧合酶2及β-淀粉样蛋白水平低于脂肪干细胞组(P < 0.05)。

2.4 脑梗死体积比较 在治疗后3周，脑梗死组大鼠脑梗死体积为(245±24) mm³，脂肪干细胞组为(158±14) mm³，联合组为(104±12) mm³。联合组与脑梗死组、脂肪干细胞组相比，差异有显著性意义(P < 0.05)。

2.5 脑组织病理形态和PKH26阳性细胞数 治疗3周后，脑梗死组可见梗死处脑组织被胶质细胞和胶质纤维充填，形成胶质瘢痕，局部脑萎缩，软化灶形成(图2A)。脂肪干细胞组移植部位出现典型的神经细胞样形态学改变，组织瘢痕和软化灶小于脑梗死组，而大于联合组(图2B)。联合组出现典型的神经细胞样形态学改变且软化灶消失，有少量瘢痕(图2C)。荧光显微镜观察损伤灶脑组织中的PKH26阳性细胞数：脑梗死组为(0±0.00)个/高倍视野，脂肪干细胞组为(34.32±5.58)个/高倍视野，联合组为(56.34±7.42)个/高倍视野，见图3。

2.6 脑梗死组织中环氧合酶2及β-淀粉样蛋白mRNA表达 由图4和表3所见，与脑梗死组比较，脂肪干细胞组及联合组中环氧合酶2及β-淀粉样蛋白mRNA表达明显下调，联合组显著优于脂肪干细胞组(P < 0.05)。

2.7 脑梗死组织中环氧合酶2及β-淀粉样蛋白表达 由图5和表4所见，与脑梗死组比较，脂肪干细胞组及联合组中环氧合酶2及β-淀粉样蛋白表达明显下调，联合组显著优于脂肪干细胞组(P < 0.05)。

参考文献

[1] 汪丽静,崔艳玲,孙丽敏,等.复方丹参注射液对脑梗死患者血管内皮细胞功能的影响[J].中国当代医药,2011,18(7):74-75.

[2] 王新杰.复方丹参注射液联合纳洛酮治疗新生儿缺氧缺血性脑病[J].中国实验方剂学杂志,2013,19(12):338-340.

[3] 刘志刚,孙宜芬,孟红旗.丹参注射液液治疗急性脑梗死90例临床观察[J].中国民族民间医药杂志,2015,24(22):78-79.

[4] Yoshida Y, Yamanaka S. Recent stem cell advances: induced pluripotent stem cells for disease modeling and stem cell-based regeneration. Circulation. 2010;122(1):80-87.

[5] 沙德潜,陈伟.盐酸法舒地尔在脂肪干细胞向表皮细胞诱导分化中的作用[J].新乡医学院学报,2011,28(6):711-713.

[6] Gage FH, Temple S. Neural stem cells: generating and regenerating the brain. Neuron. 2013;80(3):588-601.

[7] 刘波,朱金土,曹毅,等.脂肪干细胞定向诱导分化为成骨细胞及其鉴定[J].中华中医药学刊,2011,29(12):2680-2681,2843.

[8] Kim SU. Neural stem cell-based gene therapy for brain tumors. Stem Cell Rev. 2011;7(1):130-140.

[9] 周向阳,邓永文,方芳,等.大鼠脂肪干细胞的培养及向神经细胞的定向分化[J].中国现代医学杂志, 2010, 20(4):530-534.

[10] Maciaczyk J, Singec I, Maciaczyk D, et al. Restricted spontaneous in vitro differentiation and region-specific migration of long-term expanded fetal human neural precursor cells after transplantation into the adult rat brain. Stem Cells Dev. 2009;18(7):1043-1058.

[11] Zhang ZH, Wang RZ, Wang RZ, et al. Transplantation of neural stem cells modified by human neurotrophin-3 promotes functional recovery after transient focal cerebral ischemia in rats. Neurosci Lett. 2008;444(3):227-230.

[12] Andres RH, Horie N, Slikker W, et al. Human neural stem cells enhance structural plasticity and axonal transport in the ischaemic brain. Brain. 2011;134(Pt 6):1777-1789.

[13] Roelofs HM, Te Morsche RH, van Heumen BW, et al. Over-expression of COX-2 mRNA in colorectal cancer. BMC Gastroenterol. 2014;14:1.

[14] Lin JY, Wang WA, Zhang X, et al. Intraneuronal accumulation of Aβ42 induces age-dependent slowing of neuronal transmission in Drosophila. Neurosci Bull. 2014;30(2): 185-190.

[15] 林福虹,郑荣远,王沛,等. 2-BFI对EAE小鼠iNOS和COX-2 mRNA表达的影响[J].中国神经免疫学和神经病学杂志, 2011, 18(1):27-31.

[16] 邵瑛,王艳芳,冯德琳,等.电针对血管性痴呆大鼠在体海马CA1 区β淀粉样蛋白1-40的影响[J].广州中医药大学学报,2014,31(3): 389-393.

[17] 李振华,承欧梅,蒋青松,等.黄芩苷抑制beta淀粉样蛋白诱导的海马COX-2蛋白表达[J].中国中西医结合杂志,2011,31(5): 676-679.

[18] 李宁,宋莲军,张平安,等.铅暴露对仔鼠海马中β淀粉样蛋白40表达影响[J].中国公共卫生,2012,28(9):1205-1206.

[19] 吴磊,赵建华,冯继.不同环氧合酶-2抑制剂治疗大鼠脑外伤早期炎症实验观察[J].陕西医学杂志,2012,41(5):525-527.

[20] Paradis V, Perlemuter G, Bonvoust F, et al. High glucose and hyperinsulinemia stimulate connective tissue growth factor expression: a potential mechanism involved in progression to fibrosis in nonalcoholic steatohepatitis. Hepatology. 2001;34(4 Pt 1):738-744.

[21] Mura E, Zappettini S, Preda S, et al. Dual effect of beta-amyloid on α7 and α4β2 nicotinic receptors controlling the release of glutamate, aspartate and GABA in rat hippocampus. PLoS One. 2012;7(1):e29661.

[22] Reed-Geaghan EG, Savage JC, Hise AG, et al. CD14 and toll-like receptors 2 and 4 are required for fibrillar A{beta}-stimulated microglial activation. J Neurosci. 2009; 29(38):11982-11992.

[23] Du H, Yan SS. Mitochondrial permeability transition pore in Alzheimer's disease: cyclophilin D and amyloid beta. Biochim Biophys Acta. 2010;1802(1):198-204.

[24] Arispe N, Diaz J, Durell SR, et al. Polyhistidine peptide inhibitor of the Abeta calcium channel potently blocks the Abeta-induced calcium response in cells. Theoretical modeling suggests a cooperative binding process. Biochemistry. 2010;49(36):7847-7853.

引言

脑梗死是因各种原因导致动脉管腔狭窄、堵塞，脑组织供血供氧不足，诱发脑组织功能障碍的一种脑血管疾病。急性脑梗死在临床上最为常见，其发病率和致残率均居于心脑血管疾病的前列，严重影响患者的神经系统功能。缺血导致梗死周围半暗带区血流量降低，若长期脑灌注缺乏，最终导致脑细胞坏死。因此，脑梗死早期或者超早期进行有效治疗，控制脑水肿，提高患者的大脑血供水平，逆转半暗带区患者脑细胞的缺血坏死，是治疗成功的关键。

研究表明，丹参有良好的活血化瘀功能，临床试验研究已证明丹参除了具有扩张血管作用外，还有降低血液黏稠度，对各种组织器官的缺血再灌注损伤具有明显的改善作用，是治疗缺血性脑血管病常用而有效的中药，曾被美国FDA认可，对缺血后脑组织有诸多保护作用。近年来研究表明，丹参因其具有疗效明确和不良反应小的生物学功效已经被广泛用于治疗脑梗死^[1-3]。

干细胞可在一定条件下体外培养扩增、定向分化为多种类型成熟细胞系，已被广泛应用于各种疾病的治疗^[4-9]。与骨髓干细胞类似，脂肪干细胞由脂肪组织提取而来，具有高度自我更新能力和多向分化潜能。以往人们认为脂肪是人体肥胖之源，瘦身后抽出的脂肪组织都当成废弃物丢弃，现经由医学专家研究证实，与骨髓中存在造血干细胞一样，脂肪组织中同样含有大量的间质干细胞，这种间质干细胞也具有体外增殖及多重分化的潜力。新近研究表明，脂肪干细胞治疗脑梗死疗效明显^[10-12]。

研究表明，环氧合酶2和β-淀粉样蛋白表达水平与脑梗死后神经功能损伤有着密切关系^[13-14]。实验旨在探讨丹参注射液联合脂肪干细胞移植对脑梗死模型大鼠脑组织和血清中环氧合酶2、β-淀粉样蛋白水平的影响。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 实验于2014年3月至2015年10月在河北医科大学动物实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 雌性SD大鼠100只，1个月龄，体质量180-200 g，由河北医科大学动物实验室提供，室温23 ℃，湿度50%-80%，SPF环境下自由饮水和采食。

1.3.2 主要细胞、试剂和仪器 冻存脂肪干细胞由河北医科大学动物实验室提供。BCA蛋白浓度检测试剂盒(增强型)、5×SDS蛋白上样缓冲液、20×TBS缓冲液(南京建成生物)；胎牛血清和PBS(Hyclone)；Trizol试剂盒(Invitrogen)；Real-time PCR仪(Bio-Rad)；聚合酶链式反应的引物采用Primer 5.0软件设计，由克劳宁(北京)生物科技有限公司合成；血清环氧合酶2及β-淀粉样蛋白酶联免疫检测试剂盒(上海生工生物有限公司)。

1.4 方法

1.4.1 体外复苏并培养和标记脂肪干细胞 取出实验室冻存的脂肪干细胞，置于37 ℃恒温水浴箱，不间歇、轻轻摇动冷冻管，1 min内进行快速复苏，放置于无菌操作台上，吸取细胞悬浮液，加至1∶10倍稀释的L-DMEM培养基中，静置在37 ℃、体积分数为5%CO₂的饱和湿度培养箱中培养，每2 d更换1次新鲜培养液，除去未贴壁细胞，至细胞融合85%时，去除培养基，吸取贴壁细胞，加至培养皿中，3 g/L胰酶消化5 min，用等体积的含体积分数为10%胎牛血清的低糖培养基终止消化，细胞吹打到成悬液，1 500 r/min离心5 min，弃去上清非贴壁细胞，调整细胞浓度为1×10⁷ L^-¹，放置在37 ℃、体积分数为5%CO₂的饱和湿度培养箱中培养，每2 d或3 d更换1次培养基，取第4代细胞用于细胞移植实验。

吸取5 µL PKH26至1.5 mL EP管中，加入1 mL完全培养液，吹打均匀，即得PKH26标记液。取贴壁达90%融合的第3代脂肪干细胞，吸弃培养液，PBS洗3次，加入上述标记液40 µL/cm²，于37 ℃、体积分数为5%CO₂、饱和湿度恒温培养箱中孵育20 min，吸弃标记液，加入37 ℃的完全培养液5 mL，孵育10 min后吸弃，继续加入培养液重复清洗2次，培养24 h后在倒置荧光显微镜下观察PKH26标记效果和细胞形态变化。随机选取5个视野，计数PKH26阳性细胞数及细胞总数，计算标记率。移植时PBS洗涤细胞3次，将细胞终浓度调为2×10¹⁰ L^-¹备用。

1.4.2 大脑中动脉闭塞模型的建立及实验分组 100只SD大鼠麻醉后仰卧位固定，分离结扎颈外动脉与右颈总动脉，迅速于颈外动脉与颈内动脉分叉处作一切口，插入一端加热成光滑球形的尼龙线(球端直径0.29-0.35 mm)，直至20 mm处，再回撤至18 mm处，实现大脑中动脉闭塞导致脑缺血。将尼龙线外留约1 cm，缝合手术切口。2 h后，密切观察大鼠的行为学变化和精神状态，若出现左前肢卷曲或共济失调的体征，则入选；将未出现这些体征的大鼠或术后长时间未清醒的大鼠弃去。将入选的大鼠固定在超净手术台之上，轻拉留于体外的尼龙线线头直至产生阻力并实现大脑动脉的缺血再灌注。成功建立大鼠脑梗死模型87只，随机选取63只，再随机分为3组：脑梗死组(不做任何特殊处理)、脂肪干细胞组(仅进行PKH26标记的脂肪干细胞移植)、联合组(丹参注射液治疗+PKH26标记的脂肪干细胞移植)，每组21只。造模后24 h开始注射，脑梗死组于尾静脉注射30 μL PBS，脂肪干细胞组尾静脉注射30 μL脂肪干细胞悬液(含有3×10⁶ L^-¹个脂肪干细胞)，联合组经尾静脉注射30 μL脂肪干细胞悬液(含有3×10⁶ L^-¹个脂肪干细胞)+腹腔注射丹参注射液0.5 g/(kg•d)。细胞只注射1次，丹参注射液连续注射7 d。

1.4.3 神经功能学mNSS评分 0分：无神经系统损伤体征，1分：手术对侧前爪有明显的伸直障碍；2分：向手术对侧转圈；3分：向手术对侧倾倒；4分：不能自发行走，意识丧失。分别于治疗前及治疗后1，2，3，4周的每周最后一天测定各组大鼠mNSS评分。

1.4.4 采用ELISA法检测血清环氧合酶2及β-淀粉样蛋白水平 在治疗后3周各组随机取3只大鼠用乙醚麻醉，经主动脉取血，按环氧合酶2及β-淀粉样蛋白ELISA试剂盒说明书的操作方法，测定大鼠血清环氧合酶2及β-淀粉样蛋白水平。

1.4.5 苏木精-伊红染色及免疫荧光显微镜观察 在治疗后3周各组随机取3只大鼠麻醉处死，取梗死处脑组织，40 g/L多聚甲醛固定，行常规冰冻切片，进行苏木精-伊红染色及荧光显微镜观察。每张切片在高倍镜(×200)下任取10个视野，计算每个视野中的PKH26阳性细胞数，取平均值。

1.4.6 脑梗死体积的测定 在治疗后3周各组随机取3只大鼠麻醉处死，取脑组织行冰冻切片，置于2% TTC进行染色处理，以病理图像分析系统测定梗死面积，然后根据梯形公式计算梗死体积。

1.4.7 采用RT-PCR方法检测脑梗死组织中环氧合酶2及β-淀粉样蛋白mRNA表达^[15-18] 治疗3周后，每组取3只大鼠。通过Primer Primer 5.0软件设计引物，环氧合酶2上游引物：5’-TCA AAA GAA GTG CTG GAA AAG GTT-3’，下游引物：5’-TCT ACC TGA GTG TCT TTG ACT GTG-3’，扩增片段长度为296 bp；β-淀粉样蛋白上游引物：5’-TCG TGA TTC CTT ACC GGT GC-3’，下游引物：5’-CTC ACA AAC GTC CAT CCG C-3’，扩增片段长度为104 bp；内参照β-actin上游引物：5’-AGG GCT GCC TTC TCT TGT GA-3’，下游引物：5’-AAC TTG CCG TGG GTA GAG TCA-3’，扩增片段长度为110 bp。提取各组大鼠脑梗死组织的总RNA，运用实时聚合酶链式反应测定基因相对表达水平。

1.4.8 Western Blot检测脑梗死组织中环氧合酶2及β-淀粉样蛋白的表达 将上述反转录PCR的提取物，在4 ℃条件下，17 000 r/min离心30 min，收集上清行蛋白定量。于沉淀中加入其2倍体积的溶解缓冲液，4 ℃条件下，17 000 r/min离心30 min。取30 μg沉淀及40 μg上清液蛋白，经15% SDS-PAGE电泳后，电转移至硝酸纤维膜，室温封闭1 h，加入羊抗鼠环氧合酶2及β-淀粉样蛋白及兔抗β-actin，室温孵育2 h，TBS洗3遍，每次5 min；加入碱性磷酸酶标记兔抗羊IgG(1∶500)，室温孵育1 h，TBS洗3遍，每次5 min，用显色剂显色约10 min，待蛋白条带显色清晰时终止反应拍摄照片，记录实验结果。

1.5 主要观察指标 ①神经功能学mNSS评分；②血清环氧合酶2及β-淀粉样蛋白水平；③脑梗死体积；④脑梗死组织中环氧合酶2及β-淀粉样蛋白基因与蛋白的表达。

1.6 统计学分析 数据以x(_)±s表示，采用SPSS 15.0统计软件进行完全随机设计的方差分析。两组之间的比较采用Dunnett t 检验进行分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

急性脑梗死是脑内血栓形成或动脉硬化后缺血缺氧最终导致脑组织局部缺血性坏死，出现相应的神经功能缺损。实验采用经典的大脑中动脉阻塞法制备脑梗死模型。

环氧合酶2是生物机体内具有重要意义的炎症递质，该酶在细胞合成前列腺素的生化过程中发挥了极其重要的作用；环氧合酶2属于限速酶，可将花生四烯酸有效转化为有血管活性的前列腺素前体物质，使氧自由基明显堆积，从而使得脂质过氧化、DNA损伤和细胞膜破坏加剧，降低了血管内皮细胞的血管舒张反应性，造成细胞损伤、代谢紊乱和血管机能障碍^[19]。环氧合酶2本身没有导致神经损伤的活性，但是在其催化的酶促反应中具有促炎性质的花生四烯酸产物将会持续性加剧脑损伤。环氧合酶2的酶解产物至少可在脉管系统、血脑屏障和神经元本身这3个环节加重脑损伤^[20]。

β-淀粉样蛋白是一类具有神经毒性作用的蛋白分子家族，可能引发血管功能障碍和衰竭。该分子的堆积可能会影响神经递质的释放，在脑梗死进程中，β-淀粉样蛋白的产生与清除失衡会导致其在脑梗死部位大量堆积，当其浓度超过促进天冬氨酸和谷氨酸释放的上限时，机体将获得抑制兴奋性神经递质释放的能力，从而导致神经功能性障碍和大脑记忆缺失^[21]。β-淀粉样蛋白可以通过活化多种神经细胞，释放多种促炎症细胞因子(如前列腺素、肿瘤坏死因子α、一氧化氮、白细胞介素等)诱发炎症反应，促使自由基在机体组织内的堆积和氧化应激，进而加剧神经细胞的变性和坏死^[22]。此外其还会引起线粒体功能异常，具体表现为线粒体DNA突变、糖代谢降低和呼吸链活性下降^[23]，其在脑组织中大量集聚也会因此降低脑组织的有氧活动，造成更为严重的脑梗死；β-淀粉样蛋白还可能会破坏脑组织中的钙离子平衡^[24]，产生神经毒性。这些与实验中模型组β-淀粉样蛋白分子在基因和蛋白水平表达水平较为一致。

实验结果显示，联合组大鼠脑组织中的环氧合酶2及β-淀粉样蛋白表达水平显著降低，这提示丹参注射液与脂肪干细胞移植联合促进了脑梗死组织的微循环，通过抑制炎症和氧化应激反应，抑制了环氧合酶2诱发的细胞损伤和血管舒张性降低，显著缓解了脑梗死后β-淀粉样蛋白引起的神经毒性反应。