初级纤毛/鞭毛转运系统介导力学反应性信号通路促骨髓基质干细胞成骨分化

doi:10.12307/2024.192

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (25): 3937-3941.doi: 10.12307/2024.192

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初级纤毛/鞭毛转运系统介导力学反应性信号通路促骨髓基质干细胞成骨分化

马占华，严旭，姜岩，曹争明，王永魁，李东哲，杨腾越，靳宜楷，付苏，张春霖

郑州大学第一附属医院骨科，河南省郑州市 450000

收稿日期:2023-06-27 接受日期:2023-08-18 出版日期:2024-09-08 发布日期:2023-11-23
通讯作者: 张春霖，博士，主任医师，教授，郑州大学第一附属医院骨科，河南省郑州市 450000
作者简介:马占华，男，1995年生，甘肃省临夏回族自治州人，回族，郑州大学在读硕士，主要从事脊柱微创、骨髓基质干细胞的研究。
基金资助:
中国博士后科学基金面上资助项目(2020M682359)，项目负责人：付苏

Primary cilia/intraflagellar transport mediates mechanics-responsive signaling pathway and promotes osteogenic differentiation of bone marrow stromal stem cells

Ma Zhanhua, Yan Xu, Jiang Yan, Cao Zhengming, Wang Yongkui, Li Dongzhe, Yang Tengyue, Jin Yikai, Fu Su, Zhang Chunlin

Department of Orthopedics, First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450000, Henan Province, China

Received:2023-06-27 Accepted:2023-08-18 Online:2024-09-08 Published:2023-11-23
Contact: Zhang Chunlin, MD, Chief physician, Professor, Department of Orthopedics, First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450000, Henan Province, China
About author:Ma Zhanhua, Master candidate, Department of Orthopedics, First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450000, Henan Province, China
Supported by:
China Postdoctoral Science Foundation (General Program), No. 2020M682359 (to FS)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

初级纤毛：真核细胞的长形力学感受性细胞器，介导力学信号转导及多种信号通路。
鞭毛转运系统：初级纤毛的核心轴丝动力系统，维持初级纤毛长度的动态平衡。
转化生长因子β/SMAD信号通路：转化生长因子β激活信号通路，广泛参与细胞分化、凋亡等功能调控。转化生长因子β与受体相结合后，发生初级纤毛内聚集，激活SMAD等因子转移入细胞核，激活骨形成蛋白2等基因转录。
骨形成蛋白2：属于转化生长因子β超家族成员，是促进成骨分化的重要蛋白。

背景：目前已证实力学刺激可以促进骨髓基质干细胞成骨分化，但其机制未完全明了。初级纤毛是重要的力学感受器并调控TGF-β1/BMP-2/SMAD等多种信号通路，很可能是骨髓基质干细胞力学调控的重要靶点。

目的：探讨流体剪切力对骨髓基质干细胞成骨分化的影响及机制。
方法：将大鼠骨髓基质干细胞分为对照组、力学刺激组(通过摇床施加流体剪切力学干预)、力学刺激+IFT88沉默组(力学刺激+使用siRNA沉默IFT88表达)，干预24 h后，采用qRT-PCR检测转化生长因子β1、骨形成蛋白2的表达、Western blot检测磷酸化SMAD2/3蛋白的表达，初级纤毛免疫荧光染色及形态学分析。

结果与结论：剪切力刺激可促进骨髓基质干细胞的初级纤毛表达，转化生长因子β1及骨形成蛋白2基因转录激活，提高磷酸化SMAD2/3蛋白表达。siRNA干扰初级纤毛生成后，这一力学反应效应明显减低。骨髓基质干细胞的初级纤毛面积改变比值与转化生长因子β1及骨形成蛋白2基因转录增高比例具有Spearman相关性。结果表明：初级纤毛/鞭毛转运系统介导了流体剪切力反应性的TGF-β1/BMP-2/SMAD信号通路激活，促进骨髓基质干细胞成骨分化。

https://orcid.org/0000-0001-9565-4485 (张春霖)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 骨髓基质干细胞, 转化生长因子β1, 骨形成蛋白2, 初级纤毛, 鞭毛转运系统, 剪切力学刺激

Abstract: BACKGROUND: Mechanical stimulation has been confirmed to promote osteogenic differentiation of bone marrow stromal stem cells, but the mechanism is unknown. Primary cilia are important mechanoreceptors and regulate various signaling pathways such as TGF-β1/BMP-2/SMAD. They are likely to be important targets for mechanical regulation of bone marrow stromal stem cells.
OBJECTIVE: To investigate the effect and mechanism of fluid shear stress on osteogenic differentiation of bone marrow stromal stem cells.
METHODS: Rat bone marrow stromal stem cells were divided into control group, mechanical stimulation group (fluid shear mechanics intervention by shaking table), mechanical stimulation + IFT88 silencing group (mechanical stimulation + silencing IFT88 expression with siRNA). After 24 hours of intervention, qRT-PCR was utilized to determine the expression of transforming growth factor β1 and bone morphogenetic protein 2. Western blot assay was used to detect the expression of phosphorylated SMAD2/3 protein. Immunofluorescent staining of primary cilia was conducted and morphology was analyzed.
RESULTS AND CONCLUSION: Shear stress stimulation could promote the transcriptional activity of transforming growth factor β1 and bone morphogenetic protein 2 genes, and increase the expression of phosphorylated SMAD2/3 protein. After siRNA interfered with primary cilia, this mechanical response effect was significantly reduced. There was a Spearman correlation between the change ratio of the primary cilium area of bone marrow stromal stem cells and the increased ratio of transforming growth factor β1 and bone morphogenetic protein 2 gene transcription. These findings indicate that primary cilia/intraflagellar transport mediates the activation of fluid shear stress-responsive transforming growth factor β1/bone morphogenetic protein 2/SMAD signaling pathway and promotes osteogenic differentiation of bone marrow stromal stem cells.

Key words: bone marrow stromal stem cell, transforming growth factor β1, bone morphogenetic protein 2, primary cilia, intraflagellar transport, shear stress stimulation

中图分类号:

马占华, 严旭, 姜岩, 曹争明, 王永魁, 李东哲, 杨腾越, 靳宜楷, 付苏, 张春霖. 初级纤毛/鞭毛转运系统介导力学反应性信号通路促骨髓基质干细胞成骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(25): 3937-3941.

Ma Zhanhua, Yan Xu, Jiang Yan, Cao Zhengming, Wang Yongkui, Li Dongzhe, Yang Tengyue, Jin Yikai, Fu Su, Zhang Chunlin. Primary cilia/intraflagellar transport mediates mechanics-responsive signaling pathway and promotes osteogenic differentiation of bone marrow stromal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(25): 3937-3941.

图/表（结果） 4

2.1 骨髓基质干细胞分离培养及鉴定结果大鼠原代骨髓基质干细胞经离心分离、贴壁生长培养后形态逐渐延伸，呈现梭形、多边形等多种形态，传代后生长速度明显加快。传代至第4代后，光镜下形态稳定，流式细胞术鉴定骨髓基质干细胞绝大多数表现为CD29、CD44、CD73、CD90 及 CD105 阳性，阳性率为81%-96%，而CD34和CD45阴性，细胞阳性率低于 2%，见图1。

2.2 通过siRNA沉默 IFT88构建初级纤毛抑制的骨髓基质干细胞模型由于IFT是初级纤毛的重要组成部分，而目前IFT88是IFT系统的核心蛋白，多数研究采用IFT88敲除、沉默等手段进行初级纤毛产生的抑制干预[6-7]。该研究同样采用siRNA进行IFT88沉默，结果显示对照组骨髓基质干细胞仍然存在初级纤毛，而siRNA干预后骨髓基质干细胞的初级纤毛明显减少，图2A。对照组骨髓基质干细胞的初级纤毛存有率约80%(/DAPI染色细胞核数目)，而IFT88-siRNA处理后，初级纤毛的存有率极低，占比在10%以下，沉默效应明显，见图2B。

2.3 流体剪切力刺激下初级纤毛的形态学分析各组干预24 h后进行Arl13b免疫荧光染色以显示初级纤毛形态。共聚焦显微镜摄片结果显示，对照组骨髓基质干细胞的初级纤毛表达正常，见图3A左图；经24 h流体剪切力刺激后，骨髓基质干细胞初级纤毛延长，见图3A中图；IFT88-siRNA处理过的骨髓基质干细胞经力学刺激后，初级纤毛表达仍然较少且长度极短，见图3A右图。初级纤毛阳性细胞数量方面，对照组与力学刺激组无统计学差异(约80%)，见图3B。而力学刺激组的初级纤毛长度显著长于对照组(t=4.65，P < 0.001)，见图3C。同样，力学刺激组初级纤毛面积显著高于对照组(t=4.84，P < 0.001)，见图3D。由于siRNA干扰IFT88的骨髓基质干细胞表达初级纤毛较少，其数量远低于对照组和力学刺激组，因此该研究不做此组统计分析。以上结果说明，剪切力学刺激可诱导初级纤毛延长及面积增大，而力学条件下siRNA干扰IFT88阻碍初级纤毛生成。

2.4 初级纤毛/IFT介导了力学反应性骨形成蛋白2及转化生长因子β1的转录激活以及磷酸化SMAD2/3激活 qRT-PCR结果显示，力学刺激组转化生长因子β1 mRNA表达显著高于对照组(t=5.22，P < 0.001)，而力学刺激+IFT88沉默组则低于力学刺激组(t=3.43，P=0.005)，见图4A。同样，力学刺激组骨形成蛋白2 mRNA表达显著高于对照组(t=7.82，P < 0.001)，而力学刺激+IFT88沉默组则低于力学刺激组(t=5.15，P < 0.001)，见图4B。
Western blot实验用于检测磷酸化SMAD2/3的表达，以确定SMAD2/3的激活状态，结果显示剪切力显著提高了磷酸化SMAD2/3蛋白表达，IFT88干扰阻断初级纤毛后，SMAD2/3处于失活状态，见图4C。基因转录和蛋白表达结果说明剪切力可促进转化生长因子β1及骨形成蛋白2基因转录活性提高，伴随SMAD2/3磷酸化激活，而siRNA干扰IFT88/初级纤毛后，这一力学反应效应明显减低。
2.5 初级纤毛面积与骨髓基质干细胞力学反应性基因转录活性的相关性分析该研究分别计算了力学刺激组5个生物学重复样本的mRNA转录增加比值及初级纤毛面积增大比值(相较于对照组平均值)，并分析其Spearman相关性。结果显示，转化生长因子β1及骨形成蛋白2基因转录活性的增加比值与初级纤毛的面积增高比值均有相关性且呈线性相关，见图4D。转化生长因子β1与初级纤毛面积的Spearman r系数为0.97，P=0.004；骨形成蛋白2与初级纤毛面积的Spearman r系数为0.95，P=0.02。说明初级纤毛面积改变与转化生长因子β1及骨形成蛋白2基因转录具有相关性。

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引言

材料方法

1.1 设计体外细胞观察实验。
1.2 时间及地点 2021年12月至2022年6月在郑州大学第一附属医院生物治疗中心细胞实验室完成。
1.3 材料 SD大鼠骨髓基质干细胞购自赛业生物科技公司(批号：RASMX-01001)。胎牛血清、双抗溶液及DMEM培养基均购买于Gibco公司；p-SMAD2/3一抗购买于Santa Cruz公司；细胞培养6孔板、离心管等细胞培养耗材购买于Corning公司；RNA提取试剂盒(细胞组织RNeasy kit)、RNA反转录试剂盒和SYBR Green染料均购买于Qiagen公司；光学显微镜照相系统购买于Olympus公司；核酸分析仪购买于Bio-Rad公司；高速离心器、核酸定量仪、CO2孵育箱及摇床均为国产设备。
1.4 实验方法
1.4.1 骨髓基质干细胞培养大鼠骨髓基质干细胞解冻后，加入含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养基培养72 h，换液去除未贴壁细胞后分瓶培养，接种于25 cm2塑料培养瓶，加入含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基培养，两三天换液1次，7-9 d细胞汇合后可传代，按1∶2传代。光镜及倒置显微镜观察体外培养细胞的生长、增殖和形态变化。胰酶消化第4代骨髓基质干细胞，PBS清洗3遍，计数细胞，重悬细胞后采用流式鉴定法检测表面标记CD29、CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105的表达。
1.4.2 实验分组将培养的第4代骨髓基质干细胞分为3组：对照组(正常培养)、力学刺激组(通过摇床施加流体剪切力学干预)、力学刺激+IFT88沉默组(力学刺激+使用siRNA沉默IFT88表达)，干预24 h后分别进行RNA、蛋白提取、固定染色等操作。
1.4.3 流体剪切力学干预方法参考相关文献步骤使用平板小室进行剪切力加载。将骨髓基质干细胞培养于盖玻片上，放置于密闭加压力小室中，组装层流流体小室，并使其连接到储液柱和蠕动泵。向储液柱中加入300 mL 37 ℃的DMEM培养基进行循环加载(15 dyn/cm2，即1.5 Pa)流体剪切力24 h。
1.4.4 siRNA干扰IFT88细胞模型的构建及验证首先对慢病毒进行侵染效率评估，确认效率较高(> 80%)后，根据IFT88干扰序列设计合成若干siRNA，构建到慢病毒载体中。目的基因 IFT88沉默序列为NM_001107266.1(NCBI 参考序列，ThermoFisher公司)，最后通过ARL13b蛋白免疫染色确认初级纤毛表达。siRNA转染前1 d，消化骨髓基质干细胞为细胞悬液(2×105个，2 mL)接种于6孔板内，培养48 h，将转染体系于37 ℃，体积分数5% CO2培养箱中进行干预。待转染完成，换液后进行力学刺激处理。

1.4.5 qRT-PCR检测骨形成蛋白2及转化生长因子β1的表达收集上述干预后的各组骨髓基质干细胞，使用Trizol提取各组细胞总RNA，使用Qiagen公司RNA反转录试剂盒合成cDNA。该研究使用的引物见表1。 PCR反应条件优化后采用SYBR Green染料法进行Real Time PCR检测。以β-actin作为内参，最终结果以ΔΔCt法计算。

1.4.6 Western blot检测p-SMAD2/3蛋白的表达收集上述干预后的各组骨髓基质干细胞，提取总蛋白，在预制胶内总蛋白点样后电泳；电泳结束后转膜，体积分数5%山羊血清室温封闭60 min；稀释比例为1∶500的p-SMAD2/3一抗4 ℃孵育过夜；HRP标记的二抗(1∶10 000)室温孵育1 h；ECL化学发光剂在化学发光成像系统上曝光并摄像。以β-actin为内参，采用Image J图像处理软件进行定量分析。
1.4.7 初级纤毛免疫荧光染色及3D形态学测量培养于玻片的骨髓基质干细胞经40 g/L多聚甲醛固定后，通过一抗Arl13b免疫荧光孵育，标记初级纤毛蛋白，体积分数5%山羊血清封闭后，二抗免疫荧光标记Arl13b，使用共聚焦显微镜按最小距离分层获取初级纤毛图像，并使用最大投射影像图片于Image J软件内进行初级纤毛形态学分析。
1.5 主要观察指标初级纤毛形态及比例；骨形成蛋白2及转化生长因子β1的基因水平表达；p-SMAD2/3的蛋白表达。
1.6 统计学分析采用SPSS 13.0统计软件进行统计分析，所有数据结果均以x±s表示。2个样本均数的比较采用t检验，多个样本均数的比较采用one-way ANOVA，两两比较采用LSD-t法，指标间相关关系采用Spearman相关性分析，P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经通过郑州大学第一附属医院生物统计学专家审核。

讨论

该研究首次从初级纤毛/IFT角度，提出了剪切力学刺激促进骨髓基质干细胞成骨分化的内在机制，该信号通路主要通过转化生长因子β1/SMAD调控骨形成蛋白2表达来实现。转化生长因子β1通路是重要的骨代谢调控通路，主要对细胞增殖、分化、细胞外基质产生、迁移等方面进行调控。转化生长因子β1与骨形成蛋白家族多数存在于细胞外间质，在受到力学信号刺激时激活。而IFT系统维持的初级纤毛结构可感受外界力学刺激而发生形态学变化，导致其介导的通路功能改变。该研究主要建立了“初级纤毛/IFT-TGF-β1/SMAD/BMP”这样一种“结构-功能”之联系，提示诸多调控初级纤毛/IFT的手段可能应用于组织工程骨构建中骨髓基质干细胞成骨活性调控。
组织工程骨在诸多提高骨缺损修复能力的研究中提出了多种解决方案，如血管神经束植入[8]、活性生长因子加入、负载支架改进等[9]，其关键点在于促进种子细胞的快速成骨作用。骨髓基质干细胞是重要的组织工程种子细胞，广泛分布于体内各组织且呈现不同的表型及功能。基于2006年国际细胞治疗协会提出了骨髓基质干细胞定义[10]，该研究通过其表面标志物表达确认骨髓基质干细胞纯度较好。
该研究采用了经典流体剪切力模型进行力学加载模拟。骨髓腔内骨髓基质干细胞受到周围流体产生的剪切力学刺激[2]，且该类型力学刺激可以促进骨髓基质干细胞增殖、成骨分化，从而提高骨量[3]。SUWITTAYARAK等[11]使用锥形转盘加载流体力学刺激(0.05-1 Pa)人牙周膜干细胞3 h，发现力学刺激并未促进转化生长因子β1的mRNA转录，但促进活性转化生长因子β1的细胞外分泌。RUI等[12]使用平行流体小室加载剪切力(0.4-2.2 Pa)作用于人骨髓基质干细胞4，8 d，骨形成蛋白2的mRNA转录活性增高2-5倍，且碱性磷酸酶活性增强，成骨分化水平提高。该研究所选择的剪切力大小范围正是参考以上文献，并于该研究中确认其促成骨分化作用。文献证实，剪切力学刺激24 h可提高骨形成蛋白2、骨桥蛋白基因表达[13]，而刺激48 h可提高Runx2、碱性磷酸酶和骨桥蛋白基因表达[14]。最近一项系统评价指出，流体剪切力在早期主要促进骨形成蛋白2、环氧化酶2和Runx2表达[15]。尽管诸多文献采用的剪切力参数不完全一致(主要为干预强度及时间不同)，但多数研究结论一致，即流体剪切力提高骨髓基质干细胞的成骨分化活性。
初级纤毛是骨髓基质干细胞表面伸出的细胞器，真核细胞均有1根，属于不动纤毛范畴。初级纤毛主要由基底部、轴丝、纤毛膜及纤毛基质构成。其中，轴丝则由规则排列的微管及其附属蛋白组成，形成9+0型结构，IFT系统正是借助Kinesin-Ⅱ和Dynein-2等运动蛋白，与IFT组成蛋白形成协同关系，转运多种受体蛋白、信号通路蛋白等至初级纤毛内部，同时伴随初级纤毛形态学改变。IFT88为IFT复合体B的核心蛋白，是初级纤毛/IFT进行沉默或转基因干预的重要靶点[16-17]。该研究构建了IFT88-siRNA模型，很好地阻断了IFT运输及初级纤毛产生。免疫荧光染色结果中仍有小部分细胞保留初级纤毛，这可能是由于细胞状态特殊、干扰片段不完全等原因所致。
根据以往研究报告，转化生长因子β家族的转化生长因子β1及转化生长因子β2受体表达于胚胎成纤维细胞和干细胞的初级纤毛内部或周围[18]，二者均分布于初级纤毛尖端到基底部的区域。转化生长因子β通路激活时，网格蛋白介导受体聚集于初级纤毛，导致下游的SMAD2/3及ERK1/2于初级纤毛基底部激活[19]。因此，该研究发现剪切力学刺激时，初级纤毛延长且面积增加，这会导致转化生长因子β受体募集于初级纤毛，促进下游SMAD2/3转录因子的磷酸化，从而进入细胞核激活骨形成蛋白2转录，提高骨髓基质干细胞成骨分化活性。LABOUR等[20]研究证实，在骨形成过程中初级纤毛介导了转化生长因子β诱发的骨髓基质干细胞募集过程，其机制在于转化生长因子β受体集中于初级纤毛，而转化生长因子β1与受体于初级纤毛处结合，介导了初级纤毛基底部的SMAD3激活。转化生长因子β/骨形成蛋白存在经典的SMAD依赖性通路，通过激活Runx2基因促进成骨分化[21]。
LIU等[22]发现IFT组分IFT80抑制的转基因小鼠骨痂组织内转化生长因子β1及转化生长因子β受体均表达下降，且SMAD2/3磷酸化程度也减低，抑制了软骨细胞分化。该研究中初级纤毛/IFT的调控机制可能通过上述转化生长因子β1-SMAD2/3磷酸化调控过程实现。
该实验存在一些局限性，未来仍需开展进一步的研究：第一，细胞体外实验优势在于力学刺激容易控制且探索通路、成骨分化效应明确，但不能完全代表真实情况。因此，进一步实验应采用三维立体培养的骨髓基质干细胞、富含骨髓基质干细胞的骨髓组织或动物体内实验等，探索初级纤毛/IFT调控力学反应性转化生长因子β1通路的效应。第二，下游因子需进一步研究，该研究发现了初级纤毛/IFT调控机制，但其相关核转录因子如P300 CBP和P38 MAPK通路等需进一步确认。第三，调控初级纤毛/IFT的具体方式需进一步研究，例如IFT系统的IFT20、IFT88、IFT80等组分、细胞周期-初级纤毛调控蛋白、IFT运载蛋白Kinesin等，这是未来应用于组织工程骨构建的潜在靶点所在。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

初级纤毛/鞭毛转运系统介导力学反应性信号通路促骨髓基质干细胞成骨分化

Primary cilia/intraflagellar transport mediates mechanics-responsive signaling pathway and promotes osteogenic differentiation of bone marrow stromal stem cells

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