气虚血瘀型腰椎管狭窄症患者增生肥厚与正常黄韧带之间的蛋白质表达差异

doi:10.12307/2023.857

中国组织工程研究 ›› 2023, Vol. 27 ›› Issue (35): 5589-5595.doi: 10.12307/2023.857

• 肌肉肌腱韧带组织构建 tissue construction of the muscle, tendon and ligament • 上一篇下一篇

气虚血瘀型腰椎管狭窄症患者增生肥厚与正常黄韧带之间的蛋白质表达差异

王梦抒1，张宇2，郑周杭1，陈龙1，尤冬春2，郭伟锋2，胡飞2，陈欢2，刘幸明2，吴荣海2，张寅2

1广州中医药大学，广东省广州市 510405；2广东省第二中医院，广东省广州市 510095

收稿日期:2022-09-19 接受日期:2022-11-30 出版日期:2023-12-18 发布日期:2023-06-01
通讯作者: 张宇，博士，主任中医师，硕士生导师，广东省第二中医院，广东省广州市 510095
作者简介:王梦抒，女，1996年生，四川省攀枝花市人，汉族，广州中医药大学在读硕士，主要从事中医药治疗腰椎管狭窄症的研究。
基金资助:
广东省自然科学基金项目-面上项目(2021A1515011723)，项目负责人：张宇

Differential protein expression analysis of hypertrophic and normal ligamentum flavum in patients with lumbar spinal stenosis with Qi deficiency and blood stasis

Wang Mengshu1, Zhang Yu2, Zheng Zhouhang1, Chen Long1, You Dongchun2, Guo Weifeng2, Hu Fei2, Chen Huan2, Liu Xingming2, Wu Ronghai2, Zhang Yin2

1Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China; 2Guangdong Second Hospital of Traditional Chinese Medicine, Guangzhou 510095, Guangdong Province, China

Received:2022-09-19 Accepted:2022-11-30 Online:2023-12-18 Published:2023-06-01
Contact: Zhang Yu, MD, Chief physician, Master’s supervisor, Guangdong Second Hospital of Traditional Chinese Medicine, Guangzhou 510095, Guangdong Province, China
About author:Wang Mengshu, Master candidate, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China
Supported by:
Natural Science Foundation of Guangdong Province (General Program), No. 2021A1515011723 (to ZY)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

腰椎管狭窄症：是一种由马尾神经或神经根受压引起腰腿疼痛、下肢麻木、间歇性跛行、伴或不伴背痛等为主要临床表现的综合征，中医属于“腰痹”范畴，为临床上常见脊柱疾病。
差异蛋白质组学：比较分析不同状态下蛋白质的表达图谱，通过数据库对比分析实现对体系内代谢调控的动态监测，从而揭示机体对内外界环境变化产生反应的本质规律。通过研究疾病整体的差异、蛋白质的微观表达，可以更加全面地研判该疾病的变化与进展。

背景：从西医的病理机制来看，黄韧带增生肥厚是腰椎管狭窄症的关键致病因素，目前缺乏气虚血瘀型腰椎管狭窄症的生物学信息。
目的：分析气虚血瘀型腰椎管狭窄症患者增生肥厚黄韧带与同证患者正常黄韧带之间的蛋白质表达差异。
方法：选择2022年2-8月广东省第二中医院(黄埔医院)收治的气虚血瘀型腰椎管狭窄症患者6例，其中黄韧带增生肥厚者3例(实验组)，黄韧带厚度正常者3例(对照组)，采集所有患者黄韧带组织标本，进行4D Label free定量蛋白组学检测，筛选差异蛋白，运用GO、KEGG进行富集分析。

结果与结论：①实验组与对照组表达差异的蛋白总数为183个，其中上调蛋白87个，下调蛋白96个；②表达差异蛋白的GO富集分析显示，生物进程主要集中在细胞进程、生物调节、对刺激的反应等；细胞组成则集中在细胞、细胞内、蛋白质复合物种；分子功能主要为连接、催化活性、分子功能调节剂等；③上调蛋白主要富集到溶酶体信号通路、类风湿性关节炎信号通路、金黄色葡萄球菌感染信号通路；下调蛋白共富集到8条信号通路，分别为p53信号通路、肾细胞癌信号通路、转化生长因子β信号通路、泛素介导的蛋白水解作用信号通路、Ca信号通路、cGMP-PKG信号通路、缺氧诱导因子1信号通路、癌症中蛋白聚糖信号通路；④实验组的重要差异蛋白有INHBA、MMP14、TNC、HTRA1、FGF2等；⑤气虚血瘀型腰椎管狭窄症患者增生肥厚黄韧带与同证患者正常黄韧带蛋白质表达存在差异，其中INHBA可能为该疾病的关键影响因子，其作用机制可能为激活转化生长因子β/Smad相关信号通路引起黄韧带增生肥厚，导致腰椎管狭窄症。

https://orcid.org/0000-0002-7626-6628(王梦抒)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 差异蛋白质, 气虚血瘀证, 腰椎管狭窄, 黄韧带增生肥厚, INHBA, MMP14, TNC, HTRA1, FGF2

Abstract: BACKGROUND: From the pathological mechanism of Western medicine, ligamentum flavum hypertrophy is the key pathogenic factor of lumbar spinal stenosis, and there is a lack of biological information on lumbar spinal stenosis of the Qi deficiency and blood stasis type.
Objective: To analyze and compare differential protein expression between hypertrophic and normal ligamentum flavum in patients with lumbar spinal stenosis of the Qi deficiency and blood stasis type.
METHODS: Ligamentum flavum tissue samples were collected from six lumbar spinal stenosis patients with Qi deficiency and blood stasis, including three cases of ligamentum flavum hypertrophy (experimental group) and three cases of normal ligamentum flavum (control group). 4D Label free quantitative proteomic detection was performed to screen differentially expressed proteins. Gene oncology and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes were used for enrichment analysis.
RESULTS AND CONCLUSION: There were 183 differentially expressed proteins between the two groups, including 87 up-regulated and 96 down-regulated. Gene oncology enrichment analysis showed that biological processes mainly focused on cell processes, biological regulation and response to stimuli. Cell composition was concentrated in cell, intracellular, and protein-complex species. The main molecular functions included linkage, catalytic activity and molecular function regulator. The up-regulated proteins were mainly enriched to lysosomal signaling pathway, rheumatoid arthritis signaling pathway, and Staphylococcus aureus infection signaling pathway, while the down-regulated proteins were enriched to eight signaling pathways, namely p53 signaling pathway, renal cell carcinoma signaling pathway, transforming growth factor β signaling pathway, ubiquitin-mediated protein hydrolysis signaling pathway, Ca signaling pathway, cGMP-PKG signaling pathway, hypoxia-inducible factor 1 signaling pathway, and proteoglycan signaling pathway in cancer. INHBA, MMP14, TNC, HTRA1, FGF2 were the important differentially expressed proteins in the experimental group. To conclude, there are differential protein expressions between hypertrophic and normal ligamentum flavum in patients with Qi-stagnation and blood-stasis type lumbar spinal stenosis. INHBA may be the determinant of this disease, and its mechanism may be the activation of transforming growth factor β/Smad related signaling pathway, causing ligamentum flavum hypertrophy and subsequently leading to lumbar spinal stenosis.

Key words: differentially expressed protein, Qi deficiency and blood stasis syndrome, lumbar spinal stenosis, ligamentum flavum hypertrophy, INHBA, MMP14, TNC, HTRA1, FGF2

中图分类号:

王梦抒, 张宇, 郑周杭, 陈龙, 尤冬春, 郭伟锋, 胡飞, 陈欢, 刘幸明, 吴荣海, 张寅. 气虚血瘀型腰椎管狭窄症患者增生肥厚与正常黄韧带之间的蛋白质表达差异[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(35): 5589-5595.

Wang Mengshu, Zhang Yu, Zheng Zhouhang, Chen Long, You Dongchun, Guo Weifeng, Hu Fei, Chen Huan, Liu Xingming, Wu Ronghai, Zhang Yin. Differential protein expression analysis of hypertrophic and normal ligamentum flavum in patients with lumbar spinal stenosis with Qi deficiency and blood stasis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2023, 27(35): 5589-5595.

图/表（结果） 11

2.1 参与者数量分析 6例患者全部进入结果分析。
2.2 两组基线资料比较见表1。

实验组3例的责任节段分别为L5/S1、L5/S1、L4/5，对照组3例的责任节段分别为L4/5、L4/5、L5/S1。
2.3 主成分分析研究共采集6个样本，所有样本的蛋白定量主成分分析结果展示如图1，实验组与对照组两组坐标点在图上相距较远，提示两组样本之间差异显著。

2.4 差异蛋白筛选通过两组样本间对比，此次共筛选出183个差异蛋白，其中87个蛋白表达显著上调，96个蛋白表达显著下调。火山图中红色圆点为表达显著上调蛋白，绿色圆点为表达显著下调蛋白，灰色圆点为差异不显著蛋白，见图2。

2.5 差异表达蛋白功能分类统计结果
GO二级注释分类：对183个差异表达蛋白进行GO二级注释分类统计，其中生物进程主要为细胞进程、生物调节、对刺激的反应、代谢进程、定位、多细胞生物过程等；细胞组成主要为细胞、细胞内、蛋白质相关复合物；分子功能主要为连接功能、催化活性相关功能、分子功能调节等，见图3。

2.6 差异表达蛋白富集分析结果
2.6.1 GO 富集分析结果
上调差异蛋白GO富集分析：细胞组成主要集中在高尔基腔、色素颗粒、黑素体；见图4A。生物进程主要集中在细胞外基质的组织、生殖结构发展、生殖系统发展、细胞氧化解毒、细胞解毒等，见图4B。分子功能主要集中在蛋白催化活性作用、阳离子结合、金属离子结合、钙离子结合等，见图4C。

下调差异蛋白GO富集分析：对96个表达下调蛋白进行GO富集分析，以P < 0.05为筛选标准。细胞组成主要集中在超分子纤维、超分子复合体、超分子聚合物、细胞外基质、微纤维、胶原蛋白三聚物等；见图5A。生物进程主要集中在基因表达的正向调控、细胞外基质组织、循环系统开发、心血管系统开发、细胞运动的负调控等，见图5B。分子功能主要集中在细胞骨架的蛋白绑定、细胞外基质的结构成分、钙依赖性蛋白绑定等，见图5C。

2.6.2 KEGG 通路富集分析结果
上调蛋白KEGG富集分析结果：对87个表达上调蛋白进行KEGG富集分析，富集到溶酶体信号通路、类风湿性关节炎信号通路、金黄色葡萄球菌感染信号通路。
下调蛋白KEGG富集分析图：对96个表达下调蛋白进行KEGG富集分析，共富集到8条信号通路，分别为p53信号通路、肾细胞癌信号通路、转化生长因子β信号通路、泛素介导的蛋白水解作用信号通路、Ca信号通路、cGMP-PKG信号通路、缺氧诱导因子1信号通路、癌症中蛋白聚糖信号通路，见图6。

2.7 差异表达蛋白聚类分析结果对183个差异表达蛋白进行Q聚类分析，以差异倍数将蛋白分为Q1-Q4 4个范围，Q1和Q2为下调差异表达蛋白，Q3和Q4为上调差异表达蛋白，见图7。

2.8 KEGG通路聚类分析结果对183个差异蛋白进行KEGG通路聚类分析，Q1主要集中在JAK-STAT信号通路、花生四烯酸代谢信号通路、Rap1信号通路、肾细胞癌信号通路、Ca信号通路、p53信号通路；Q2集中于转化生长因子β信号通路；Q3发现溶酶体信号通路；Q4集中在幽门螺杆菌感染中的上皮细胞信号转导、甘油磷脂新陈代谢、半乳糖代谢等，见图8。

2.9 纤维化重要差异蛋白筛选通过上述分析步骤，筛选出影响气虚血瘀型腰椎管狭窄症患者增生肥厚黄韧带的10位重要蛋白，见表2。

2.10 纤维化关键蛋白筛选通过对上述10种蛋白质在GO、KEGG数据库的分析比较及相关文献查阅，进一步筛选出可能与黄韧带纤维化密切相关的5种蛋白，分别是：INHBA、MMP14、TNC、HTRA1、FGF2，其中INHBA参与转化生长因子β信号通路，见图9。

参考文献

[1] LURIE J, TOMKINS-LANE C. Management of lumbar spinal stenosis. BMJ. 2016;352:h6234.
[2] SAKAI Y, ITO S, HIDA T, et al. Clinical outcome of lumbar spinal stenosis based on new classification according to hypertrophied ligamentum flavum. J Orthop Sci. 2017;22(1):27-33.
[3] MUNNS JJ, LEE JY, ESPINOZA ORÍAS AA, et al. Ligamentum flavum hypertrophy in asymptomatic and chronic low back pain subjects. PLoS One. 2015;10(5):e0128321.
[4] SUN C, ZHANG H, WANG X, et al. Ligamentum flavum fibrosis and hypertrophy: Molecular pathways, cellular mechanisms, and future directions. FASEB J. 2020;34(8):9854-9868.
[5] ANDERSON DB, LUCA K, JENSEN RK, et al. A critical appraisal of clinical practice guidelines for the treatment of lumbar spinal stenosis. Spine J. 2021;21(3):455-464.
[6] 祝乾清,曾曼杰.国际中医临床实践指南:退变性腰椎管狭窄症[J].世界中医药,2021,17(34):21.
[7] 周宾宾，李玉文,蔡乐乐,等.腰椎管狭窄症中医证型规范化的探讨[J].时珍国医国药,2009,20(12):3176-3177.
[8] 鲁齐林.高糖伴腰椎管狭窄黄韧带肥厚的炎性机制及姜黄素的干预效应研究[D].武汉:湖北中医药大学,2020.
[9] 中华医学会.临床诊疗指南·骨科分册[M].北京:人民卫生出版社,2009.
[10] PIECHOTA M, KRÓL R, ELIAS DA, et al. The nerve root sedimentation sign in diagnosis of lumbar spinal stenosis. Acta Radiol. 2019;60(5): 634-642.
[11] NAMWANJE M, BROWN CW. Activins and inhibins: Roles in development, physiology,and disease.Cold Spring Harb Perspect Biol. 2016;8(7):a021881.
[12] YI Y, CHENG JC, KLAUSEN C, et al. Activin A promotes ovarian cancer cell migration by suppressing E-cadherin expression. Exp Cell Res. 2019;382(2):111471.
[13] KALLI M, MPEKRIS F, WONG CK, et al. Activin A Signaling Regulates IL13Rα2 Expression to Promote Breast Cancer Metastasis. Front Oncol. 2019;9:32.
[14] QIANG L, CAO H, CHEN J, et al. Pancreatic tumor cell metastasis is restricted by MT1-MMP binding protein MTCBP-1. J Cell Biol. 2019; 218(1):317-332.
[15] 许静轩,杜少倩,曹源,等.MMP14在胰腺癌中的表达及其与肿瘤免疫微环境特征的相关性研究[J].上海交通大学学报(医学版), 2022,42(3):312-322.
[16] 李刚,刘江豪,罗璟璐,等.MMP14通过调节Wnt/β-catenin信号通路影响胃癌的发生、发展机制研究[J].医学研究杂志,2020,49(2): 92-98.
[17] 蔡隽,沈文远,王慧,等.重组人源TNC诱导胰腺癌细胞系PANC1的EMT及迁移和侵袭[J].基础医学与临床,2020,40(2):167-172.
[18] FISCHER D, TUCKER RP, CHIQUET-EHRISMANN R, et al. Cell-adhesive responses to tenascin-C splice variants involve formation of fascin microspikes. Mol Biol Cell. 1997;8(10):2055-2075.
[19] 王道,梁波罗.人HtrA1基因的生物信息学分析[J].湖南师范大学自然科学学报,2021,44(3):54-62.
[20] CLAUSEN T, SOUTHAN C, EHRMANN M. The HtrA family of proteases: implications for protein composition and cell fate. Mol Cell. 2002;10(3): 443-455.
[21] OKA C, TSUJIMOTO R, KAJIKAWA M, et al. HtrA1 serine protease inhibits signaling mediated by Tgfbeta family proteins. Development. 2004;131(5):1041-1053.
[22] LI XY, BAN GF, AL-SHAMERI B, et al. High-temperature Requirement Protein A1 Regulates Odontoblastic Differentiation of Dental Pulp Cells via the Transforming Growth Factor Beta 1/Smad Signaling Pathway. J Endod. 2018;44(5):765-772.
[23] YAMAWAKI S, NAITOH M, KUBOTA H, et al. HtrA1 Is Specifically Up-Regulated in Active Keloid Lesions and Stimulates Keloid Development. Int J Mol Sci. 2018;19(5):1275.
[24] JIN SF, WANG YX, XU N, et al. High temperature requirement factor A1 (HTRA1) regulates the activation of latent TGF-β1 in keloid fibroblasts. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 2018;64(1):107-110.
[25] Guan X, Nie L, He T, et al. Klotho suppresses renal tubulo-interstitial fibrosis by controlling basic fibroblast growth factor-2 signalling. J Pathol. 2014;234(4):560-572.
[26] 陈立,袁军,詹理睿,等.FGF2/FGFR1/ERK信号通路在高糖诱导人肾小管上皮细胞转分化中的机制及肾元颗粒的干预作用[J].中国中西医结合肾病杂志,2017,18(3):201-204.
[27] 刘梦昕,孙昌业,李铎,等.大鼠成纤维细胞生长因子对心肌成纤维细胞增殖和转分化的作用机制[J].解剖学报,2021,52(5):712-719.
[28] 张晗,孙超,刘新晖.腰椎黄韧带纤维化的研究进展[J].临床骨科杂志,2022,25(3):450-453.
[29] EMING SA, MARTIN P, TOMIC-CANIC M. Wound repair and regeneration: mechanisms, signaling, and translation. Sci Transl Med. 2014;6(265):265sr6.
[30] STONE RC, PASTAR I, OJEH N, et al. Epithelial-mesenchymal transition in tissue repair and fibrosis. Cell Tissue Res. 2016;365(3):495-506.
[31] 戚潇禹,刘璐佳,杨阳,等.基于TGF-β_1/Smads信号通路中医药抗纤维化研究进展[J].辽宁中医药大学学报,2021,23(1):58-62.
[32] 杨信强,陈锋,闫乾,等.TGF-β_1/CTGF信号通路及其在黄韧带肥厚中作用机制的研究进展[J].医学综述,2021,27(17):3345-3350.
[33] HAWKE LG, MITCHELL BZ, ORMISTON ML. TGF-β and IL-15 Synergize through MAPK Pathways to Drive the Conversion of Human NK Cells to an Innate Lymphoid Cell 1-like Phenotype. J Immunol. 2020;204(12): 3171-3181.

引言

腰椎管狭窄症是一种由马尾神经或神经根受压引起腰腿疼痛、下肢麻木、间歇性跛行、伴或不伴背痛等为主要临床表现的综合征[1]。目前认为，椎间盘突出、小关节退化和黄韧带增生肥厚是导致腰椎管狭窄症发展的致病因素，其中黄韧带增生肥厚被认为是其关键影响因素[2-3]。而纤维化是导致黄韧带增生肥厚公认的主要病理因素，炎症因子、生长因子、微小核糖核酸(miRNA)等是目前发现的导致纤维化的重要影响因子[4]。临床上针对腰椎管狭窄症的治疗分为保守治疗及手术疗法。手术治疗的疗效值得肯定，然而手术治疗的相对费用高、创伤大、术后并发症等问题也无法避免。保守治疗方面，西医常规治疗主要包括硬膜外类固醇注射、非类固醇抗炎、脱水、营养神经等[5]，中医治疗以针灸、推拿等疗法多见，并且临床广泛应用具有活血化瘀、补肾强筋、舒筋活络等功效的中药。
根据腰椎管狭窄症的症状，祖国医学中将其归属于“腰痹”范畴，最早对腰椎管狭窄症等腰部的症状及病因病机等内容的记载来自《黄帝内经》《素问·痹论》里记载：“荣卫之气令人痹乎？逆其气则病，不与风寒湿气合，故不为痹”“肾阳虚，风寒湿邪侵入，肝主筋，筋脉失养而风寒聚集，气血凝滞，遂致经脉痹阻、屈伸不利”，说明了肝肾不足遭遇风寒湿邪后致血瘀阻于腰府，则发为“腰痹”的病机。《素问·五脏生成》中描述：“卧出而风吹之，血凝于肤者，为痹。”也说明血瘀是引起“腰痹”病发的关键因素。经过作者所在课题组长期的临床研究，发现大部分患者具有不耐久坐、疼痛缠绵、下肢麻木、舌质瘀紫、苔薄、脉涩等气虚血瘀型的表现[6-7]。《医林改错》中记载到：“元气既虚，必不能达于血管，血管无气，必停留而瘀。”因此，元气虚、不能温煦督脉，遇腰部慢性劳损、急性外伤加之风、寒、湿等外邪侵袭致血瘀伤腰，则发为“腰痹”[8]。从西医的病理机制方面来看，黄韧带增生肥厚是腰椎管狭窄症的关键致病因素，因此作者结合课题组的临床经验，从气虚血瘀型腰椎管狭窄症角度出发，探讨其生物学基础。利用蛋白质组学研究疾病整体的差异、蛋白质的微观表达，研究黄韧带组织中全部蛋白质在气虚血瘀型腰椎管狭窄症中的表达水平、功能和相互作用等，这种研究方法可以更加全面地研判该疾病的变化与进展。
此次研究采用4D Label-free定量蛋白质组学技术进行分析，以“气虚血瘀型腰椎管症”的正常黄韧带与“同证”增生肥厚黄韧带为研究对象，获取气虚血瘀型共有的差异表达蛋白，并进行生物信息学分析，研究腰椎管狭窄症气虚血瘀型患者黄韧带组织的变化规律，为阐明气虚血瘀型腰椎管狭窄症提供生物信息学依据。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计提取气虚血瘀型黄韧带增生肥厚患者和气虚血瘀型正常黄韧带患者的黄韧带组织，进行生物信息学分析。
1.2 时间及地点试验于2022年2-8月在广东省第二中医院(黄埔医院)完成。
1.3 对象选择2022年2-8月就诊于广东省第二中医院(黄埔医院)住院部的腰椎管狭窄症气虚血瘀型患者6例，其中黄韧带增生肥厚者3例(实验组)、黄韧带厚度正常者3例(对照组)。患者对试验知情同意。研究已通过广东省第二中医院伦理委员会审批，伦理审批号：粤二中医(2020)伦审第K39号。
腰椎管狭窄症诊断与辨证标准：①西医诊断标准：参照中华医学会2009年发布的《临床诊疗指南-骨科分册》[9]；②中医诊断标准：气虚血瘀证，面色少华，神疲无力，腰痛不耐久坐，疼痛缠绵，下肢麻木。舌质瘀紫，苔薄，脉涩。主症必备，次症兼有2项或以上者，结合舌脉即可辨证[6]。
纳入标准：①符合上述西医诊断与中医辨证标准，CT及MRI下明确诊断单节段腰椎管狭窄者；②年龄45-85岁；③自愿签署试验知情同意书；④保守治疗失败患者；实验组MRI下测得黄韧带厚度> 4 mm，对照组MRI下测得黄韧带厚度< 4 mm。
排除标准：①先天性椎管骨性狭窄；②接受过腰椎相关手术者；③合并其他系统性病变或器质性病变。
1.4 方法
1.4.1 样本采集在经皮椎间孔镜髓核摘除手术期间获取增生肥厚黄韧带与正常黄韧带的无菌组织标本，剔除周围附着的软组织，用PBS洗净标本上的血渍，液氮下固定30 min，于-80 ℃冰箱中保存至使用。
1.4.2 蛋白提取将黄韧带样本组织于-80 ℃的冰箱中取出，将适量的样本组织加入预冷的研钵中，再倒入液氮，研磨样本直至粉末状。将粉末量4倍体积的裂解缓冲液(1%SDS，1%蛋白酶抑制剂)分别加入各样本中，进行超声裂解。4 ℃下12 000×g离心10 min，取上清液至新的离心管，测定其蛋白浓度(试剂盒为BCA试剂)，用于胰酶酶解制备所需的肽段。
1.4.3 胰酶酶解以制备肽段取制备好的等量蛋白进行酶解，使用裂解液调整各样本体积直至相同。先加入为样本体积1倍的预冷丙酮，涡旋混匀后再加入为样本体积4倍的预冷丙酮，-20 ℃中沉淀2 h。4 500×g离心5 min，留取沉淀，以预冷的丙酮洗涤沉淀2次后晒干。四乙基溴化铵的终浓度为200 mmol/L，将处理好的沉淀样本加入其中，利用超声将其打散，加入质量比例为1∶50(蛋白酶∶蛋白)的胰蛋白酶，酶解至第2天。加入二硫苏糖醇将溶液浓度调整为5 mmol/L，放置于56 ℃的环境下使其还原30 min。最后用碘乙酰胺将溶液终浓度调整至11 mmol/L，在室温避光的条件下孵育15 min。
1.4.4 液相色谱-质谱联用分析液相色谱设置为流动相A相(流动相A水溶液：0.1%甲酸，2%乙腈；流动相B水溶液：0.1%甲酸和90%乙腈)，用于溶解肽段，EASY-nLC1200超高效液相系统分离肽段。液相梯度分别设置为：0-68 min，8%-23%B；68-82 min，23%-32%B；82-86 min，32%-80%B；86-90 min，80%B，500 nL/min，保持流速。将肽段投入超高效液相系统进行分离，分离成功后的肽段注入NSI离子源中继续电离，OrbitrapExploris™480质谱分析。利用高分辨Orbitrap对肽段的母离子和其二级碎片进一步检测、分析。400-1 200 m/z为一级质谱的扫描范围，60 000为扫描分辨率；110 m/z为固定起点设置二级质谱扫描范围，二级扫描的分辨率设置为15 000，TurboTMT调至Off。数据依赖型扫描模式(DDA)采集相关数据，一级扫描后在HCD碰撞池依次放入信号强度排名前25的肽段母离子，在27%的碎裂能量之下碎裂使肽段母离子。采用相同方法对二级质谱进行分析。
1.4.5 差异表达蛋白筛选选取差异倍数表达> 1.5的差异蛋白为显著上调蛋白，选取差异倍数表达< 0.667的差异蛋白为显著下调蛋白。
1.4.6 差异表达蛋白功能分类统构建出与样本特异性对应的蛋白数据库，在数据库中利用分析软件进行搜索；根据在数据库中的搜索结果，将肽段和蛋白水平进行质控分析；对被鉴定到的蛋白在GO和KEGG数据库进行功能注释；进一步对蛋白进行定量分析；根据定量分析的结果筛选差异蛋白，将所得的分析结果绘制成相关统计图。
1.4.7 差异表达蛋白功能富集分析通过GO、KEGG两个层面的富集分析(显著性Pvalue计算运用了Fishers exacttest)，寻找差异表达蛋白的富集趋势。
1.4.8 差异表达蛋白聚类分析将差异表达蛋白根据差异表达倍数划分为4个部分，Q1为差异表达倍数< 0.5，Q2为0.5≤差异表达倍数< 0.667，Q3为1.5 <差异表达倍数≤2，Q4为差异表达倍数> 2。将每个Q组进行GO分类、KEGG通路富集分析。
1.4.9 蛋白相互作用网络分析在数据库中将筛选得到的差异蛋白进行编号(差异表达倍数> 1.5或差异表达倍数< 0.667)，在蛋白互作网络数据库进行比对[STRING(v.11.0)]，提取差异蛋白之间相互关系confiden cescore > 0.7 (high confidence)，用Rpackage“network D3”展示差异蛋白的互作网络。
1.5 主要观察指标差异蛋白鉴定结果，生物信息学分析结果。
1.6 统计学分析采用SPSS 18.0统计软件进行分析，组间基线资料比较采用t检验或卡方检验。文章统计学方法已经通过广州中医药大学生物统计学专家审核。

讨论

腰椎管狭窄症是脊柱方面常见疾病，其多由于关节突关节肥大内聚、椎间盘突出、黄韧带纤维化及钙化等因素导致的椎间孔、中央椎管的狭窄，从而引发马尾神经、神经根受压，出现神经功能障碍的一种疾病[10]。从解剖层面上看，黄韧带增生肥厚能影响中央椎管、神经根管、椎间孔等所致腰椎管狭窄的以上3项因素，因此预防、抑制黄韧带增生肥厚是治疗腰椎管狭窄症的关键方向。随着时代进步，现代生活、工作方式的改变以及长期不良坐姿、缺乏锻炼等问题，脊柱的退行性病变所致腰椎管狭窄症的问题日益突出，而中医认为退变多为肾气不足加之外伤等因素所致，《景岳全书》云：“腰痛肾虚十之八九，腰痛多为肾虚，久腰痛必有肾虚”，《景岳全书·腰痛》言：“跌扑伤而腰痛者，此伤在筋骨，而血脉凝滞也。”肾气亏虚，气虚则血行不畅，瘀血阻滞腰府，则表现为腰痛，反之血瘀阻碍津液疏布，筋脉不得濡养，则筋脉拘挛、关节拘紧活动不利。因此，作者从气虚血瘀型腰椎管狭窄症角度出发，探索黄韧带增生肥厚的生物信息，为后续基础、临床研究等奠定坚实基础。
此次研究运用现代生物学技术方法，诠释了气虚血瘀型腰椎管狭窄症的本质特征，发现增生肥厚黄韧带与正常黄韧带存在生物信息学水平上差异，并通过GO、KEGG富集分析等更深层次地挖掘出具体的差异蛋白质及其参与信号通路。通过此次研究分析鉴定出 10种相关差异蛋白，进一步分析其与气虚血瘀型腰椎管狭窄症患者黄韧带发生增生肥厚的相关因素后发现，INHBA、MMP14、TNC、HTRA1、FGF2可能作为靶点蛋白在该疾病中发挥重要作用。
INHBA是转化生长因子β超家族成员。INHBA基因的异常表达常与恶性肿瘤密切相关[11]。INHBA可通过转化生长因子β/Smad信号通路调控肿瘤的发生，在经典的转化生长因子β/Smad 信号通路中，参与其中的Smad蛋白家族、转化生长因子β超家族、转化生长因子β受体等任意蛋白异常均可以导致肿瘤的发生。YI等[12]在对卵巢癌的研究中发现，INHBA基因可通过Smad2/3-Smad4信号通路下调上皮钙黏素的表达以促进卵巢癌转移。在乳腺癌中，KALLI等[13]通过实验发现，INHBA能下调转移性乳腺癌细胞中IL-13Rα2的表达，其作用机制是作为IL-13Rα2基因的上游基因，其可能涉及转化生长因子β/Smad信号通路。MMP14属于MMP家族，与上皮间质转化密切相关。MMP作为细胞外基质降解过程中一种重要的蛋白酶，几乎可以完全降解细胞外基质，在胰腺癌中，MMP14可通过重塑细胞外基质促进肿瘤的侵袭和转移[14]。许静轩等[15]通过KEGG富集分析发现，MMP14相关信号通路主要集中在转化生长因子β、细胞外基质受体、P53等信号通路；GO富集分析提示，MMP14涉及细胞基质的黏附、白细胞转移、细胞外基质等生物学过程发挥作用，提示MMP14可能与胰腺癌的抑制性免疫微环境相关。在胃癌的体外细胞实验中发现，敲低MMP14能使E-钙黏蛋白、波形蛋白和血管内皮生长因子等与上皮间质转化相关蛋白表达上调，其机制可能为Wnt/β-catenin 信号通路[16]。TNC是一种细胞外基质糖蛋白，是细胞外基质的重要成分，有研究对胰腺癌细胞中的上皮间质转化相关分子进行了检测发现，稳定过表达TNC使得胰腺癌细胞中E-钙黏蛋白表达减少、N-钙黏蛋白表达增加，诱导胰腺癌细胞发生上皮间质转化，促进肿瘤细胞迁移与侵袭[17]。FISCHER等[18]发现TNC能够促进FSCN1蛋白，介导肿瘤细胞的黏附和迁移。HTRA1作为一种能被热休克诱导的、与包膜相关的丝氨酸蛋白酶，其能够降解包括细胞外基质在内的多种底物[19-20]。研究发现，HTRA1能够广泛地与转化生长因子β家族成员结合，且能在体内和体外抑制细胞外转化生长因子β蛋白的信号传导，可能为转化生长因子β亚家族成员的抑制剂[21]。另有实验发现，HTRA1能通过转化生长因子β1/SmaD信号通路，调节牙髓细胞分化[22]。在瘢痕组织研究中，HTRA1表达增加，沉默HTRA1可抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖和细胞外基质沉积[23-24]。FGF2属于成纤维细胞生长因子家族的一名成员，实验证实FGF2表达上调介导转化生长因子β1升高致纤维化发生[25]。而抑制FGF2/FGFR1/ERK信号途径，是改善肾间质纤维化的重要途径[26]。大鼠心肌细胞的体外实验发现，FGF2抑制心肌成纤维细胞向肌成纤维细胞分化效果显著，其机制可能是调控成纤维细胞生长因子受体1，从而抑制转化生长因子β信号通路后抑制α-SMA和Ⅰ型胶原在细胞中的表达[27]。上述蛋白质，在黄韧带增生肥厚领域的相关研究报道尚未被发掘，但在器官纤维化、肿瘤转移迁徙等方面已被论证发挥了重要作用，其中一些蛋白质的家族的成员转化生长因子β1、MMP1、bFGF等也已成为黄韧带纤维化研究的重点[28]。在黄韧带增生肥厚的研究领域中，纤维化是公认的关键致病因素，因此结合上述结果，作者提出合理的猜想，INHBA、MMP14、TNC、HTRA1、FGF2等可调节黄韧带纤维化致黄韧带增生肥厚发生。
文章通过GO分析结果得出黄韧带增生肥厚主要与生物进程相关，生物进程涉及细胞外基质方面。上皮间质转化可能是导致组织器官纤维化中肌成纤维细胞产生的主要途径之一。损伤修复过程中细胞外基质经过代谢后，组织中Ⅲ型胶原蛋白减少，Ⅰ型胶原蛋白增多，成分的变化增强了组织的修复能力[29]。实验证明，器官严重反复慢性损伤和炎症引起的伤口愈合反应失调情况下，可引起细胞外基质过度增多和沉积，导致器官发生纤维化和硬化[30]。而Ⅰ、Ⅲ型胶原增多亦是黄韧带细胞发生纤维化的典型表现，提示了气虚血瘀型腰椎管狭窄症患者其黄韧带细胞可能发生了上皮间质相关转化，介导了黄韧带纤维化，从而导致黄韧带增生肥厚。通过KEGG分析结果得出，其主要涉及通路为转化生长因子β信号通路，转化生长因子β可以激活Smad进行介导[31]，也可激活其下游CTGF信号分子[32]，还能激活MAPK通路中的成员和其他相关酶以调控黄韧带纤维化的发生[33]。由此可以猜想，气虚血瘀型腰椎管狭窄症患者其黄韧带增生肥厚的机制为INBHA的释放，激活了转化生长因子β/Smad相关信号通路，致黄韧带纤维化发生。
综上所述，此次研究从整体到微观的研究角度，应用蛋白质组学技术对气虚血瘀型腰椎管狭窄症黄韧带增生肥厚的生物学本质及调控机制进行研究，发现气虚血瘀型腰椎管狭窄症的增生肥厚黄韧带差异表达蛋白涉及多功能、多通路。INHBA、MMP14、TNC、HTRA1、FGF2等在生物信息学上与气虚血瘀型腰椎管狭窄症黄韧带增生肥厚密切相关，其中INHBA可能为影响该疾病的关键因子。
研究仍存在一定的局限性：首先，纳入样本量较小，实验结果存在偏倚可能，后续将扩大样本量，减少实验误差；其次，缺少非气虚血瘀型患者的增生肥厚黄韧带样本，后续将纳入符合相关标准的病例样本，以期从生物信息学角度获得更多的信息；后续研究可在减小误差基础上，进一步验证INHBA在该疾病中参与的具体通路及其调控机制，为气虚血瘀型黄韧带增生肥厚所致腰椎管狭窄症患者诊断奠定生物学基础，为深入了解中医证型本质特征提供依据。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

气虚血瘀型腰椎管狭窄症患者增生肥厚与正常黄韧带之间的蛋白质表达差异

Differential protein expression analysis of hypertrophic and normal ligamentum flavum in patients with lumbar spinal stenosis with Qi deficiency and blood stasis

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 11

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	张景贺, 窦永峰, 许世东, 邢建强, 刘栋, 田霖, 戴国华. 有限元模拟单通道分体内镜下双侧腰椎管减压对腰椎生物力学的影响[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(12): 1849-1854.
[2]	王建业, 刘鑫, 田霖, 孙宁, 李岳飞, 毕经纬, 刘昌震, 孙兆忠. 构建腰椎三维模型测量腰椎管减压术区神经组织及骨性结构的位置关系[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(4): 539-546.
[3]	安河朋, 刘振腾, 李立新, 许雅芳, 樊国峰. 脑源性神经营养因子干预腰椎管狭窄症大鼠神经元活性、疼痛及相关因子的变化[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(26): 4120-4125.
[4]	肖士鹏, 郭辰, 李士春, 李钦亮, 许勇, 徐帅. 老年腰椎管狭窄症矢状位腰椎-骨盆序列的解析与重建[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(18): 2903-2909.
[5]	张晗硕, 丁宇, 蒋强, 卢正操, 练诗林, 李土胜. 脊柱内镜下椎板开窗减压与单侧入路双侧减压治疗腰椎管狭窄症的生物力学稳定性及有限元分析[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(13): 1981-1986.
[6]	姚汝斌, 王仕永, 杨开舜. 微创经椎间孔椎间融合治疗单节段腰椎管狭窄症对腰椎-骨盆平衡的改善作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(9): 1387-1392.
[7]	田洋, 唐超, 廖烨晖, 唐强, 马飞, 钟德君. CT和MRI在腰椎管狭窄症中测量椎管面积的一致性和可重复性[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(24): 3882-3887.
[8]	王晶, 徐帅, 刘海鹰. 伴和不伴类风湿性关节炎患者腰椎管狭窄后路减压融合过程中隐性失血的对比[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(33): 5307-5314.
[9]	杨金丰, 马三辉. 椎间盘退行性变与HTRA1和HAPLN1基因多态性的相关性[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(32): 5128-5132.
[10]	张春霖, 尚利杰, 严旭, 曹争明, 邵成龙, 冯阳. 后路双牵开摆动式椎间盘镜下单纯融合器置入治疗腰椎管狭窄并失稳症的中长期评估 [J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(3): 335-341.
[11]	刘金玉, 丁宇, 蒋强, 崔洪鹏, 卢正操. 全内镜下腰椎板开窗减压有限元模拟建模及生物力学变化[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(27): 4291-4296.
[12]	姜树东, 任龙喜, 郭函, 梁得华, 张彤童, 刘正. 单侧减压机器人辅助微创经椎间孔腰椎间融合治疗影像学双侧腰椎管狭窄[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(24): 3797-3802.
[13]	蒋强, 丁宇, 刘金玉, 曹世奇, 卢正操. 有限元模拟全内镜下精准椎板开窗减压术及生物力学分析[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(12): 1891-1896.
[14]	何达，赵经纬，刘波，田伟. 长节段与短节段固定治疗伴有轻度退行性侧弯腰椎管狭窄症的比较[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(36): 5811-5817.
[15]	戎飞龙，尹若峰，冯蒙蒙，张伯寅，刘艺，赵宝林. 退变性腰椎滑脱症和腰椎管狭窄症与椎体周围肌容量的相关性：CT和MRI影像资料分析[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(24): 3840-3845.