蒙药额尔敦-乌日勒干预激素性股骨头坏死模型大鼠的作用机制

doi:10.12307/2023.854

中国组织工程研究 ›› 2023, Vol. 27 ›› Issue (35): 5670-5675.doi: 10.12307/2023.854

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蒙药额尔敦-乌日勒干预激素性股骨头坏死模型大鼠的作用机制

金红光1，2，石桩1，王华新1，尼玛2，付勇2

1内蒙古民族大学附属医院，内蒙古自治区通辽市 028005；2江西中医药大学附属医院，江西省南昌市 330006

收稿日期:2022-10-25 接受日期:2022-12-13 出版日期:2023-12-18 发布日期:2023-06-05
通讯作者: 付勇，博士，教授，江西中医药大学附属医院，江西省南昌市 330006
作者简介:金红光，男，1980年生，内蒙古自治区科左中旗人，蒙古族，2014年北华大学毕业，硕士，副主任医师，主要从事股骨头坏死的发病机制和防治研究。

Mechanism of Mongolian Medicine Erden-uril on avascular necrosis of the femoral head in rats

Jin Hongguang1, 2, Shi Zhuang1, Wang Huaxin1, Ni Ma2, Fu Yong2

1Affiliated Hospital of Inner Mongolia University for Nationalities, Tongliao 028005, Inner Mongolia Autonomous Region, China; 2Affiliated Hospital of Jiangxi University of Chinese Medicine, Nanchang 330006, Jiangxi Province, China

Received:2022-10-25 Accepted:2022-12-13 Online:2023-12-18 Published:2023-06-05
Contact: Fu Yong, MD, Professor, Affiliated Hospital of Jiangxi University of Chinese Medicine, Nanchang 330006, Jiangxi Province, China
About author:Jin Hongguang, Master, Associate chief physician, Affiliated Hospital of Inner Mongolia University for Nationalities, Tongliao 028005, Inner Mongolia Autonomous Region, China; Affiliated Hospital of Jiangxi University of Chinese Medicine, Nanchang 330006, Jiangxi Province, China

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

额尔敦-乌日勒：由29味药物配合而组成的蒙药，其方中含有藏红花、草果、柯子、牛黄，麝香、草决明、珍珠等，具有扩张毛细血管、改善微循环、抑制血小板聚集和抗血栓等作用，临床上主要用于防治黑、白脉病以及中风、痛风、痹病和全身拘挛等病。

激素性股骨头坏死：是一种类固醇治疗引起的双侧股骨头坏死并发症，致残率高。激素性股骨头坏死的发病机制复杂、多样。长期使用糖皮质激素药物导致股骨头血供受损，骨细胞和骨髓细胞死亡，进而导致结构改变、股骨头塌陷和关节功能障碍。

背景：激素性股骨头坏死是一种类固醇治疗引起的双侧股骨头坏死并发症，致残率高，然而临床治疗效果并不显著。额尔敦-乌日勒是珍贵蒙药方剂，主要用于防治骨关节疾病，但其改善激素性股骨头坏死的作用机制尚不清楚。
目的：研究蒙药额尔敦-乌日勒(Erden-uril，EU)对激素性股骨头坏死药效作用机制。
方法：将50只大鼠随机分成正常组、股骨头坏死组、低剂量EU组(灌胃0.1 g/kg的蒙药额尔敦-乌日勒)、高剂量EU组(灌胃0.4 g/kg的蒙药额尔敦-乌日勒)和阿仑膦酸钠组(灌胃阳性药阿仑膦酸钠片水溶液)。除正常组外，其余各组大鼠腹腔联合臀肌分别注射脂多糖(10 μg/kg)和甲泼尼松龙(20 mg/kg)建立激素性股骨头坏死模型；灌胃药物1次/d，共6周。6周后，采用苏木精-伊红染色法评估股骨头坏死模型；Tunel法检测各组股骨头组织中细胞凋亡情况；ELISA和免疫组化法检测各组股骨头组织中促凋亡蛋白Bax和抑凋亡蛋白Bcl-2的表达水平；Western blot法检测各组股骨头组织中ATG5、Beclin-1、LC3II、Caspase-3、Bax和Bcl-2的蛋白表达情况。

结果与结论：①与正常组相比较，股骨头坏死组大鼠股骨头组织空骨陷窝数量增多，且脂肪细胞增大、增多；Bax表达量显著增加，ATG5、Beclin-1、LC3II和Bcl-2表达量显著降低。与股骨头坏死组相比，蒙药额尔敦-乌日勒处理后大鼠空骨陷窝、脂肪细胞均显著减小，脂肪细胞减少，骨髓细胞显著增多；凋亡细胞数显著减少；与股骨头坏死组相比，除Western blot法表明低剂量额尔敦-乌日勒显著上调Bax表达外，其他方法均表明低、高剂量额尔敦-乌日勒显著下调Bax和Caspase-3表达量，显著上调ATG5、Beclin-1、LC3II和Bcl-2表达量；低、高剂量组间蛋白表达差异无显著性意义。②结论：蒙药额尔敦-乌日勒可能通过促进细胞自噬发挥抗凋亡作用保护脂多糖联合甲泼尼松龙引起的大鼠股骨头坏死。

https://orcid.org/0000-0001-9775-9053(金红光)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 蒙药, 额尔敦-乌日勒, 激素性股骨头坏死, 凋亡, 自噬

Abstract: BACKGROUND: Steroid-induced avascular necrosis of the femoral head is a complication of bilateral osteonecrosis of the femoral head caused by steroid treatment with a high disability rate, but the therapeutic effect is not significant. Erden-uril is a precious Mongolian medicine prescription, mainly used to prevent and treat bone and joint diseases, but its mechanism of improving steroid-induced avascular necrosis of the femoral head is still unclear.
OBJECTIVE: To study the action mechanism of Mongolian Medicine Erden-uril on steroid-induced avascular necrosis of the femoral head in rat.
METHODS: Fifty rats were randomly divided into normal group, model group, low-dose Erden-uril group (0.1 g/kg Erden-uril by gavage), high-dose Erden-uril group (0.4 g/kg Erden-uril by gavage) and alendronate sodium group. Except for the normal group, rats in the other groups were intraperitoneally injected with 10 μg/kg lipopolysaccharide and 20 mg/kg methylprednisolone to establish animal models of steroid-induced avascular necrosis of the femoral head. Administration by gavage in each group was performed once a day for 6 weeks. Subsequently, hematoxylin-eosin staining was used to evaluate the femoral head necrosis model; TUNEL method was used to detect apoptosis in femoral head tissue; ELISA and immunohistochemistry were used to detect the expression levels of pro-apoptotic protein Bax and anti-apoptotic protein Bcl-2 in femoral head tissue; and western blot method was used to detect the protein expression of ATG5, Beclin-1, LC3II, Caspase-3, Bax and Bcl-2 in femoral head tissue.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the normal group, the number of empty bone lacunae was significantly increased, and adipocytes were enlarged and increased in the model group; the expression of Bax increased significantly and that of ATG5, Beclin-1, LC3II and Bcl-2 decreased significantly in the model group. Compared with the model group, treatment with Mongolian medicine Erdun-uril could significantly reduce the number of empty bone lacunae and the amount of adipocytes, significantly increase the number of bone marrow cells, and significantly decrease the number of apoptotic cells. Compared with the model group, all methods showed significant down-regulation of Bax and Caspase-3 expression and significant up-regulation of ATG5, Beclin-1, LC3II and Bcl-2 expression after treatment with low and high doses of Erdun-uril, except for western blot detection, which showed significant up-regulation of Bax expression after treatment with low-dose Erdun-uril. Moreover, there was no significant difference in protein expression between low- and high-dose Erdun-uril groups. To conclude, Erdun-uril may protect avascular necrosis of the femoral head induced by lipopolysaccharide combined with methylprednisolone in rats by promoting autophagy with anti-apoptotic effects.

Key words: Mongolian medicine, Erdun-uril, steroid-induced avascular necrosis of the femoral head, apoptosis, autophagy

中图分类号:

金红光, 石桩, 王华新, 尼玛, 付勇. 蒙药额尔敦-乌日勒干预激素性股骨头坏死模型大鼠的作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(35): 5670-5675.

Jin Hongguang, Shi Zhuang, Wang Huaxin, Ni Ma, Fu Yong. Mechanism of Mongolian Medicine Erden-uril on avascular necrosis of the femoral head in rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2023, 27(35): 5670-5675.

图/表（结果） 6

2.1 实验动物数量分析实验选入50只大鼠，共分为5组，全部进入结果分析。
2.2 额尔敦-乌日勒对股骨头坏死病理形态的影响正常组大鼠的骨小梁排列规则，骨细胞分布均勾，空骨陷窝和脂肪细胞数量少；与正常组比较，股骨头坏死组大鼠的空骨陷窝数量和脂肪细胞增大、增多；与股骨头坏死组比较，高剂量EU组和阿仑膦酸钠组大鼠的空骨陷窝、脂肪细胞均显著减少，骨髓细胞显著增多；低剂量EU组与股骨头坏死组相近，结果如图1所示。

2.3 额尔敦-乌日勒对大鼠股骨头组织中细胞凋亡的影响与正常组比较，在脂多糖处理的SANFH模型中，细胞凋亡数显著增加(P < 0.001)；与股骨头坏死组比较，经额尔敦-乌日勒或阿仑膦酸钠处理后，细胞凋亡数显著减少(P < 0.01，P < 0.001)，结果如图2所示。

2.4 额尔敦-乌日勒对大鼠股骨头组织中凋亡相关蛋白表达的影响与正常组比较，促凋亡蛋白Bax在SANFH模型大鼠的股骨头组织中表达显著升高(P < 0.001)；与股骨头坏死组相比，经低、高剂量额尔敦-乌日勒或阿仑膦酸钠处理后，Bax在股骨头组织中表达显著降低(P < 0.001或P < 0.05)。而抑凋亡蛋白Bcl-2在SANFH的股骨头组织中表达量显著低于正常组(P < 0.001)；与股骨头坏死组相比，经低、高剂量额尔敦-乌日勒处理后，Bcl-2在股骨头组织中表达显著增加(P < 0.01或P < 0.001)，而阿仑膦酸钠处理无显著差异，但具有增加趋势。结果如图3所示。

2.5 额尔敦-乌日勒对大鼠股骨头组织中凋亡相关蛋白含量的影响与正常组相比，股骨头坏死组大鼠的促凋亡蛋白Bax表达水平显著增加(P < 0.05)；与股骨头坏死组相比，经额尔敦-乌日勒处理后，低、高剂量的额尔敦-乌日勒均显著降低Bax水平(分别为P < 0.001和P < 0.05，图4A)；与之相反，低、高剂量的额尔敦-乌日勒均显著增加抑凋亡蛋白Bcl-2的表达水平(P < 0.05，图4B)；阳性药阿仑膦酸钠则显著增加Bcl-2水平(P < 0.05)，而不影响Bax水平，结果如图4所示。

2.6 额尔敦-乌日勒对大鼠股骨头组织中细胞凋亡相关蛋白表达水平的影响与正常组比较，股骨头坏死组大鼠Bax和凋亡关键蛋白酶 Caspase-3表达量显著升高(P < 0.05，P < 0.01)，Bcl-2表达量显著下降(P < 0.001)；与股骨头坏死组相比，经高剂量额尔敦-乌日勒处理后，Bax和Caspase-3蛋白表达显著下调(P < 0.01，P < 0.05)，Bcl-2蛋白表达显著上调(P < 0.05)；然而，经低剂量额尔敦-乌日勒处理后Bax表达显著上调(P < 0.001)，结果如图5所示。

2.7 额尔敦-乌日勒对大鼠股骨头组织中细胞自噬相关蛋白的影响与正常组比较，股骨头坏死组大鼠自噬相关蛋白ATG5、Beclin-1和LC3Ⅱ表达量显著降低(P < 0.01、P < 0.05或P < 0.001)；与股骨头坏死组相比，经低剂量额尔敦-乌日勒处理后，ATG5、Beclin-1和LC3Ⅱ表达量显著增加(P < 0.001)；高剂量额尔敦-乌日勒显著增加ATG5和LC3Ⅱ的表达量(P < 0.01、P < 0.05)，结果如图6所示。

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引言

股骨头缺血性坏死是临床上的常见病、难治病，分为创伤性与非创伤性两种类型。据统计，仅在中国就有812万例非创伤性股骨头缺血性坏死患者，非创伤性股骨头坏死类型中最常见的是激素性股骨头坏死(steroid-induced avascular necrosis of the femoral head，SANFH)，在非创伤性股骨头坏死中高达51%[1]，已经成为全球日益突出的问题。
SANFH是一种类固醇治疗引起的双侧股骨头坏死并发症，致残率高[2]。SANFH的发病机制复杂、多样，长期使用糖皮质激素药物，导致股骨头血供受损，骨细胞和骨髓细胞死亡，进而导致结构改变、股骨头塌陷和关节功能障碍[3]。近年来研究表明程序性细胞死亡即细胞凋亡与细胞自噬在参与SANFH发生发展中发挥关键作用[4]。在激素和酒精性骨坏死的早期阶段，检测到骨细胞、成骨细胞、破骨细胞、软骨细胸和骨髓细胞的凋亡[5-7]。临床研究表明SANFH患者的骨细胞凋亡显著增加[8]。大剂量糖皮质激素可以诱导骨细胞凋亡，并随着激素剂量的增加细胞凋亡率逐渐升高[9-11]。此外，骨细胞的凋亡、成骨细胞和破骨细胞的分化还受自噬调节[12-14]。
自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤可以显著降低兔SANFH的发生发展[4]。然而，截至目前，尚未见蒙药通过细胞凋亡和自噬防治激素性股骨头缺血坏死的研究报道。
额尔敦-乌日勒是由29味药物配合而组成的蒙药，其方中含有藏红花、草果、柯子、牛黄，麝香、草决明、珍珠等[15]，具有扩张毛细血管、改善微循环、抑制血小板聚集和抗血栓等作用，临床上主要用于防治黑、白脉病及中风、痛风、痹病和全身拘挛等病[16]。当前，额尔敦-乌日勒临床应用研究占多数，而药理研究相对不足，主要集中于防治心脑血管疾病和神经系统疾病等疾病的作用机制[17]。内蒙古民族大学附属医院科室临床研究发现蒙药额尔敦-乌日勒治疗早期股骨头坏死具有较显著的效果[18]，但其改善SANFH的作用机制尚不清楚。因此，该文章拟采用脂多糖联合激素诱导的股骨头坏死模型，从细胞自噬和凋亡角度探讨额尔敦-乌日勒防治SANFH的作用机制。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。采用独立样本t检验对两组数值进行比较，采用单因素方差分析Dunnet法对多组数值进行比较。
1.2 时间及地点实验于2021年1月至2022年8月在江西中医药大学实验动物中心实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验试剂脂多糖(批号：L8880，北京索莱宝科技有限公司)；甲泼尼松龙 (MPS，批号：AP5394，比利时辉瑞有限公司)；庆大霉素(批号：2007007，金馥康生物药业股份有限公司)；额尔敦-乌日勒(Erden-uril，EU；批号：M14060733，内蒙古蒙药股份有限公司)；阿仑膦酸钠(批号：S012746，新加坡MSD PHARMA有限公司)；大鼠Bcl-2 ELISA检测试剂盒和大鼠Bax ELISA检测试剂盒(批号：ER0762和ER0512，武汉菲恩生物科技有限公司)；TUNEL凋亡检测试剂盒(批号：C1088，上海碧云天生物技术有限公司)； LC3Ⅰ/Ⅱ抗体 (批号：AF5402，Affinity生物科学有限公司)，beclin-1 抗体 (批号：11306-1-ap，Proteintech生物科学有限公司)，ATG5抗体、Caspase 3抗体、Bax抗体和Bcl-2抗体(批号：ab108327、ab184787，ab32503和ab196495，英国Abcam生物科学有限公司)；辣根酶标记山羊抗兔IgG(H+L)(批号：ZB-2301北京中杉金桥生物技术有限公司)；DAB显色试剂盒(批号：CW0125，北京康为世纪生物科技有限公司)。
1.3.2 实验动物与分组取6-8周龄、体质量200-220 g的SPF级雄性SD大鼠50只，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号：SCXK(湘) 2019-0004，在普通环境适应1周后将大鼠随机分为正常组10只，模型组40只。实验方案经内蒙古民族大学附属医院医学伦理委员会审查、批准(NM-LL-2021-03-09-27)。
1.3.3 仪器显微镜[BX43，奥林巴斯(中国)有限公司]；切片机(2235，徕卡微系统有限公司)；电热鼓风干燥箱(HGZF-101-1，上海跃进医疗器械有限公司)；全自动酶标仪(WD-2102B，北京六一生物科技有限公司)；荧光显微镜[CKX53，奥林巴斯(中国)有限公司]。
1.4 实验方法

1.4.1 动物造模与药物干预参照文献采用内毒素联合甲泼尼松龙建立大鼠SANFH模型[19]。大鼠适应1周后，随机取40只大鼠，第1天给予大鼠臀肌注射16×104 U庆大霉素，连续注射3 d；第4天腹腔注射剂量为10 μg/kg 的脂多糖；第5-7天联合注射脂多糖(10 μg/kg)和甲泼尼松龙(20 mg/kg)；第8-15天每天臀肌注射1次16×104 U庆大霉素。如果造模后大鼠股骨头病理观察有空骨陷窝形成、骨细胞核固缩和周围骨髓细胞坏死则认为模型成功[20]。将SANFH模型大鼠随机分成4组：股骨头坏死组大鼠灌胃生理盐水；阿仑膦酸钠组灌胃阿仑膦酸钠，剂量为7 mg/kg；低剂量EU组，灌胃额尔敦-乌日勒，剂量为0.1 g/kg；高剂量EU组，灌胃额尔敦-乌日勒，剂量为0.4 g/kg。灌胃1次/d，共6 周。给药结束后采用戊巴比妥钠(15-40 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠后，眼眶采血，收集的血液于室温下静置30 min后，3 000×g离心10 min，所得上清即为大鼠血清；同时取大鼠股骨头，将一部分股骨头保存于 4 ℃预冷的多聚甲醛固定液中，另一部分进行液氮保存备用。

1.4.2 苏木精-伊红染色骨组织用10% EDTA脱钙，蒸馏水浸洗，取出组织流水冲洗数小时，具体方法参照谢磊等[21]所述，采用苏木精-伊红染色后，于光镜下观察股骨头组织病理学改变。
1.4.3 ELISA检测Bax和Bcl-2水平取各组股骨头组织1 g放入研砵，以液氮研磨成粉末状后取0.1 g粉末加入1 mL裂解液，置于冰上裂解30 min后，于4 ℃ 10 000×g离心10 min，
小心吸取上清。采用ELISA试剂盒检测股骨头组织中Bax和Bcl-2水平，具体方法参照ELISA试剂盒说明书。
1.4.4 TUNEL法检测骨细胞凋亡情况参照王哲等[22]所述方法，取骨组织置于1% zinc固定液中固定48 h，取出，于流水冲洗后，自动脱水机中脱水(不同体积分数乙醇、二甲苯和石蜡)，再放置于包埋机进行石蜡包埋，连续切片(厚度为3.0-4.0 μm)，将切片依次进行烤片(65 ℃ 2 h)，二甲苯洗(10 min ×2次)，不同体积分数乙醇洗(100%，95%，80%各5 min)；转入湿盒，滴加 50 μg/mL 蛋白酶K(37 ℃，30 min)，PBS洗(3次×5 min)；参照TUNEL试剂盒说明书操作后，用抗荧光淬灭封固，荧光显微镜拍照，采用Image J软件定量荧光强度，计算阳性细胞数，平均荧光强度=总荧光强度值/细胞数。
1.4.5 免疫组化法检测骨组织凋亡相关蛋白水平参照1.4.2所述方法获得各组大鼠股骨头切片，依次进行烤片(65 ℃ 2 h)，二甲苯洗(10 min ×2次)，不同体积分数乙醇洗(100%，95%，80%各5 min)，水洗，高压抗原修复(3 min)，PBS洗(3次×5 min)，滴加体积分数3% H2O2除过氧化物酶活性，PBS洗(3次×5 min)，滴加封闭液(体积分数5%山羊血清+0.5%BSA)，室温孵育盒内封闭2 h，加一抗工作液(Bax和Bcl-2浓度均为1∶1 000)4 ℃过夜孵育，PBS洗(3次×5 min)，加二抗液室温孵育2 h，PBST洗(3次×5 min)，加HRP工作液孵育15 min，PBST洗(3次×5 min)，滴加DAB显色液100 s，显微镜下观察阳性反应，流水冲洗，苏木素染色5 min，盐酸乙醇分化10 s，脱水，封固，拍照，在每张载玻片上随机选择5个区域，使用Image J在200放大倍数下评估阳性染色区的吸光度值。阳性区平均吸光度值/阳性区面积为各组骨组织凋亡相关蛋白水平。
1.4.6 Western blot检测凋亡及自噬相关蛋白表达取各组股骨头组织1 g放入研砵，以液氮研磨成粉末状后取0.1 g粉末加入1 mL裂解液，置于冰上裂解30 min后，于4 ℃ 10 000×g离心10 min，小心吸取上清，采用BCA试剂盒测定蛋白浓度。单样取40 μg总蛋白与上样缓冲液混匀煮后，加入SDS-PAGE凝胶孔中，依次进行电泳(100 V，1.5 h)、湿法转膜(200 mA 1.5 h)、一抗溶液过夜孵育(GAPDH和ACTIN浓度1∶2 000，Caspase-3、Bcl-2、LC3Ⅰ/Ⅱ、Beclin-1 和ATG5抗体浓度均为1∶1 000)、TBST漂洗(3次×15 min)、二抗溶液(1∶5 000)室温孵育2 h、TBST漂洗(3次×15 min)、滴加ECL曝光液、于凝胶成像系统内拍摄图片。目的蛋白和内参蛋白条带灰度值用Image J软件进行定量分析，目的蛋白相对表达量=目的蛋白灰度值/内参蛋白灰度值。
1.5 主要观察指标 ①大鼠股骨头坏死病理形态；②股骨头组织中细胞凋亡情况；③股骨头组织中促凋亡蛋白Bax和抑凋亡蛋白Bcl-2的表达水平；④股骨头组织中ATG5、Beclin-1、LC3Ⅱ、Caspase-3、Bax和Bcl-2的蛋白表达情况。
1.6 统计学分析采用SPSS 20.0软件对数据进行统计分析，定量结果采用x±s表示。采用独立样本t检验对两组数值进行比较，采用单因素方差分析Dunnet法对多组数值进行比较，以P < 0.05为差异有显著性意义。文章的统计学方法已经内蒙古民族大学附属医院生物统计学专家审核。

讨论

SANFH是最常见的股骨头坏死类型。随着激素的大量使用，罹患此病者数以千百万计，并仍在迅猛地增长，如果治疗不当也会导致股骨头塌陷和骨关节炎[23]。此次研究采用蒙药额尔敦-乌日勒防治脂多糖联合激素构建的大鼠SANFH模型，结果表明蒙药额尔敦-乌日勒可通过促进自噬抑制骨细胞凋亡显著缓解SANFH。
研究表明，地塞米松和糖皮质类激素可诱导成骨细胞凋亡导致SANFH[24]。激素、酒精和(或)其代谢产物可直接导致骨细胞发生凋亡[25]，且骨细胞凋亡参与糖皮质激素诱导的股骨头早期缺血性坏死的病理改变[26]。也有研究报道甲泼尼松龙以剂量依赖的方式增加SANFH模型中骨细胞的自噬，影响成骨细胞和破骨细胞之间的相互作用[27]，甲泼尼松龙构建的SANFH模型坏死区域会从骨骺延伸到股骨骨干。以高剂量脂多糖联合3次注射大剂量甲泼尼松龙诱导股骨头坏死发病率高(85%)，但伴有高实验动物死亡率(50%)[28]。此次研究以低剂量脂多糖联合3次注射大剂量甲泼尼松龙可诱导股骨头坏死达到高发病率和低动物死亡率[19]。
Bax、Caspase-3和Bcl-2分别作为促凋亡和抗凋亡的调节因子，且Bcl-2与Bax之间的失衡是地塞米松诱导成骨细胞凋亡的重要原因[23]。研究发现SANFH患者体内Caspase-3表达水平升高，激活的Caspase-3导致成骨细胞凋亡[29]。此外，地塞米松处理骨细胞后，骨细胞中caspase-3和Bax的表达增加，Bcl-2的蛋白表达降低，显著促进骨细胞凋亡[30]。采用红花多糖和蒜素处理成骨细胞后，Caspase-3活性和PI3K/AKT通路被抑制，成骨细胞凋亡数量显著降低[10，31]。红花多糖和仙鹤草多糖还可以通过上调Bcl-2表达保护激素诱导的细胞凋亡[32-33]。此次研究中，与股骨头坏死组相比，仅高剂量的蒙药额尔敦-乌日勒可显著下调Bax和Caspase-3蛋白表达，且高剂量EU组的Bax和Caspase-3蛋白表达小于低剂量EU组，显著上调Bcl-2蛋白表达，推测其具有抗细胞凋亡作用；但Tunel实验显示低剂量EU组的凋亡细胞数比高剂量EU组的高，且免疫组化和ELISA实验显示低剂量EU组的Bax表达却又低于高剂量EU组，相比具有降低趋势，推测原因可能是取股骨头的位置不同引起，不同部位所存在的凋亡细胞种类及数量可能不同。因此，额尔敦-乌日勒具体影响激素诱导坏死股骨头中何种细胞凋亡有待进一步确定。
自噬与凋亡均属细胞程序性死亡的类型，两者相互制约、相互调控。自噬可以通过抑制caspase表达或活性阻断细胞凋亡，降低细胞损伤，促进细胞存活[34]。ATG5介导的自噬通过P53/Rb通路调控细胞凋亡[35]。地塞米松诱导Bax、caspase-3和LC3表达水平显著增加，以及P62和Bcl-2表达水平显著降低，导致成骨细胞凋亡[36]，而甲状旁腺激素可以通过增强细胞自噬来减轻地塞米松诱导的MLO-Y4 骨细胞的凋亡过程[37]。研究表明骨细胞中beclin-1的减少伴随着骨细胞Caspase-3的增加，表现出自噬的抗凋亡活性减弱[38]。采用匹诺西布林抑制骨细胞中的PI3K/Akt/mTOR通路，可以激活细胞自噬，减轻糖皮质激素诱导的细胞凋亡[39]，而采用高活性血小板裂解物可抑制自噬保护激素诱导的大鼠股骨头缺血性坏死[40]。此外，切除卵巢也会诱导骨细胞凋亡，推测是因骨细胞Beclin-1和LC3Ⅰ的减少和骨细胞p62增加所致[41]。也有研究表明中药健骨散和淫羊藿可通过调节自噬改善股骨头缺血性坏死[42-43]。此次研究中，股骨头坏死组自噬标记物ATG5、Beclin-1和LC3Ⅱ等表达量显著降低，经低剂量蒙药额尔敦-乌日勒处理后，ATG5、Beclin-1和LC3Ⅱ表达量显著增加，表明低剂量额尔敦-乌日勒可促进细胞自噬作用，但蒙药额尔敦-乌日勒作用于股骨头组织中的何种细胞有待进一步验证。
由于股骨头坏死的修复机制非常复杂，临床上其治疗方法主要以髋关节置换术为主，但手术风险高、创伤程度大、假体耐久性较差、需再次手术、费用昂贵，给患者家庭和社会带来沉重的经济和心理负担。内蒙古民族大学附属医院科室临床研究显示蒙药额尔敦-乌日勒临床疗效显著，但作用机制不明。此次研究表明蒙药额尔敦-乌日勒能够显著抑制大鼠SANFH，其作用机制可能是通过促进股骨头组织中的细胞自噬发挥抑制细胞凋亡作用。该研究为蒙药额尔敦-乌日勒在SANFH临床治疗上的科学应用提供了理论依据。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

蒙药额尔敦-乌日勒干预激素性股骨头坏死模型大鼠的作用机制

Mechanism of Mongolian Medicine Erden-uril on avascular necrosis of the femoral head in rats

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