高效去除异体组织中脱细胞试剂十二烷基硫酸钠残留的清洗方法

doi:10.12307/2023.617

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
脱细胞：是指对异体组织或异种组织进行去除细胞及细胞成分的过程，主要目的是为了降低组织的免疫排斥反应风险，并且尽可能保留细胞外基质的结构和成分，便于临床应用。脱细胞方法一般分为物理法如超声和冻融，化学法如各种表面活性剂，生物法如蛋白酶、核酸酶等，不同的方法有不同的效果，一般应根据产品的具体用途选择合适的脱细胞方法。
脱细胞基质：来源于异体组织或者异种组织，经过脱细胞处理后，得到具有天然三维空间结构和部分细胞外基质成分的材料，该材料的结构和组成受脱细胞方式的影响比较大，一般情况下，脱细胞基质能够为细胞的生存及活动提供合适的场所，并可调节细胞的代谢活动。

背景：十二烷基硫酸钠是一种常用于同种异体组织脱细胞处理的脱细胞试剂，然而其难以从组织内去除，少量残留即可产生细胞毒性。
目的：提出一种高效去除异体组织中脱细胞试剂十二烷基硫酸钠的清洗方法。
方法：选择纯水、钾盐溶液和乙醇作为清洗介质，并通过不同介质的排列组合进行清洗，对十二烷基硫酸钠残留量、异体真皮和异体肌腱的组成、结构、力学性能和细胞毒性等方面进行检测，评价清洗效果。
结果与结论：总体上，乙醇+氯化钾、体积分数75%乙醇+氯化钾对样品的成分和结构无大影响。首先，十二烷基硫酸钠浸泡处理将异体真皮和异体肌腱的DNA残留控制在50 ng/mg以下之后再进行清洗，异体真皮、异体肌腱中的十二烷基硫酸钠含量分别降低了96.7%和97%；其次，异体真皮、异体肌腱的糖胺聚糖和胶原蛋白含量均无较大变化；此外，异体肌腱在清洗后，其最大拉力、强度和模量高于脱细胞后，与原材料相比无显著性差异；最后，细胞毒性结果显示异体真皮和异体肌腱清洗后的细胞存活率高于80%，细胞毒性分级不大于1级。
https://orcid.org/0000-0003-1694-7779 (胡凯)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 脱细胞, 十二烷基硫酸钠, 同种异体组织, 异体真皮, 异体肌腱

Abstract: BACKGROUND: Sodium dodecyl sulfate is commonly used for decellularization of allogeneic matrix, whereas it is hard to remove from matrix. Only a small amount of sodium dodecyl sulfate in matrix can cause cytotoxicity.
OBJECTIVE: To provide a high effective method to remove sodium dodecyl sulfate, which residuals in allogeneic matrix.
METHODS: The pure water, potassium salt solution and ethanol were chosen to remove sodium dodecyl sulfate. The decellularization degree, residual amount of sodium dodecyl sulfate, composition, structure and tensile properties and cytotoxicity of allogeneic dermis and allogeneic tendon were detected to evaluate the cleaning effect.
RESULTS AND CONCLUSION: In total, ethanol + potassium chloride and 75% ethanol + potassium chloride produced little significant impacts on the component and structure of allogeneic matrix. Firstly, on condition that sodium dodecyl sulfate was infiltrated into allogeneic matrix since DNA amount was controlled under 50 ng/mg (dry weight), the sodium dodecyl sulfate residual results showed a tremendous reduction of 96.7% and 97% in allogeneic dermis and allogeneic tendon, respectively. Secondly, no significant changes occurred in allogeneic dermis and allogeneic tendon for glycosaminoglycan and collagen. Moreover, after carefully washing, the allogeneic tendon exhibited higher the maximum tensile force, strength, and modulus than those after decellularization. Meanwhile, there was no significant difference compared with the raw material. Finally, the cytotoxicity test showed that cell viability was higher than 80% after washing of allogeneic dermis and allogeneic tendon; the cytotoxicity grade was not greater than lever 1.

Key words: decellularization, sodium dodecyl sulfate, allogeneic tissue, allogeneic dermis, allogeneic tendon

中图分类号:

胡凯, 李淼, 邵怡然, 汪晶晶, 陈金发. 高效去除异体组织中脱细胞试剂十二烷基硫酸钠残留的清洗方法[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(15): 2311-2317.

Hu Kai, Li Miao, Shao Yiran, Wang Jingjing, Chen Jinfa. Efficient removal of a decellularized reagent sodium dodecyl sulfate in allogeneic tissue[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2023, 27(15): 2311-2317.

图/表（结果） 7

2.1 清洗前后的SDS含量清洗前后，异体真皮和异体肌腱中SDS含量见表1。为了去除异体真皮脱细胞处理后残留的SDS，设置了6组清洗方法，4个清洗时间，样品清洗前后的SDS含量见图1A。清洗前，异体真皮中的SDS含量为(89.24±21.27) μg/mg，在采用6种方式进行清洗后，异体真皮中的SDS含量均有所下降。其中，清洗1 h时，采用体积分数为75%乙醇清洗的效果最好，异体真皮中的SDS含量降低为(3.78±1.04) μg/mg；其次是采用体积分数为75%乙醇和氯化钾清洗，SDS含量为(4.21±1.48) μg/mg；采用其余几种方法清洗后异体真皮中的SDS含量均高于10 μg/mg。在清洗2 h后，所有组的SDS含量均进一步下降，其中7E+K组的SDS含量最低，为(2.99±0.54) μg/mg，其次分别为E+K组和7E组。清洗2 h后，除H组和K组外，其余所有组的SDS含量均低于10 μg/mg。继续延长清洗时间，除K组外，所有组的SDS含量均有所下降，而K组中的SDS含量上升。清洗8 h后，SDS含量由低到高的各组依次为7E，E+K，7E+K，E，H和K。此外，采用体积分数为75%乙醇和氯化钾对SDS脱细胞处理后异体肌腱进行清洗，清洗时间分别为2 h和4 h。样品在清洗前后的SDS含量见图1B。清洗之前，异体肌腱的SDS含量为(84.17±5.80) μg/mg，在清洗2 h和4 h后SDS含量分别为(2.51±0.14) μg/mg和(2.49±0.17) μg/mg。

2.2 脱细胞情况图2为异体真皮和异体肌腱在SDS脱细胞处理、清洗前后的苏木精-伊红染色及DNA含量图。其中，异体真皮的清洗方式为7E+K，清洗2 h；异体肌腱的清洗方式为7E+K，清洗4 h。
使用SDS进行脱细胞处理前，真皮组织结构完整，真皮中存在大量细胞；脱细胞处理后，真皮中已无肉眼可见细胞核。DNA含量检测结果显示，脱细胞处理后的真皮组织中DNA含量降低，说明SDS已经完全渗透进入真皮组织内部。SDS清洗后的苏木精-伊红染色和DNA含量结果表明，采用7E+K的清洗方式对异体真皮组织的结构及DNA含量无明显影响。
对异体肌腱而言，脱细胞前，纤维束的横截面有大量细胞，在使用SDS进行脱细胞处理后，肌腱纤维束结构被破坏，但已经无明显细胞核；DNA含量检测结果也显示其DNA含量降低，说明SDS已经完全渗透进入肌腱组织内部。SDS清洗后的苏木精-伊红染色和DNA含量结果表明，采用7E+K的清洗方式对异体肌腱组织的结构及DNA含量无明显影响。

2.3 力学性能 3组异体肌腱的力学性能检测结果见图3，其中异体肌腱的清洗方式为7E+K，清洗4 h，结果表示为最大拉力、拉伸强度、拉伸模量、断裂伸长率、韧性和应力-应变曲线。总体上，原材料肌腱的力学性能最大，在最大拉力、拉伸强度、拉伸模量和韧性等方面，清洗肌腱与原材料肌腱相近，无显著性差异；而脱细胞肌腱在这4类数值上是最小的。
在最大拉力上，脱细胞肌腱与清洗肌腱存在显著性差异(P < 0.05)；在拉伸强度上，脱细胞肌腱与原材料肌腱存在显著性差异(P < 0.05)；在拉伸模量上，脱细胞肌腱与原材料肌腱和清洗肌腱均存在显著性差异(P < 0.05)；在韧性上，脱细胞肌腱与原材料肌腱存在显著性差异(P < 0.05)。

但是，脱细胞肌腱的断裂伸长率高于清洗肌腱，且原材料肌腱和清洗肌腱之间存在显著性差异(P < 0.01)。由应力-应变曲线也可看出，原材料肌腱和清洗肌腱曲线基本重合，但清洗肌腱曲线短于原材料肌腱曲线，脱细胞肌腱曲线处于另2条曲线下方。
2.4 生物学表征
2.4.1 组成异体真皮和异体肌腱的胶原蛋白和糖胺聚糖含量定性检测分别见图4的天狼猩红染色图和阿尔新蓝染色图。其中，异体真皮的清洗方式为7E+K，清洗2 h；异体肌腱的清洗方式为7E+K，清洗4 h。

对组织进行天狼猩红染色，在光学显微镜下胶原纤维呈红色，背景黄色。对于异体真皮而言，3种皮肤的胶原保存完整；对于异体肌腱而言，清洗肌腱组的胶原有所减少。对组织进行阿尔新蓝染色，在光学显微镜下糖胺聚糖呈现蓝色。脱细胞真皮和清洗真皮相比于原材料真皮蓝色变淡，糖胺聚糖含量有所减少；脱细胞肌腱相比于原材料肌腱蓝色变淡，糖胺聚糖含量有所减少；但清洗真皮蓝色较原材料肌腱无明显变化。
从异体真皮和异体肌腱的糖胺聚糖含量检测结果也可看出，两种组织均是原材料组的糖胺聚糖含量最高，显然脱细胞处理降低了糖胺聚糖含量。异体真皮中糖胺聚糖含量由高到低依次为原材料真皮、脱细胞真皮、清洗真皮；但3组样品进行两两对比，均无显著性差异。异体肌腱中糖胺聚糖含量由高到低依次为原材料肌腱、清洗肌腱、脱细胞肌腱；其中，原材料肌腱和脱细胞肌腱存在显著性差异(P < 0.01)；脱细胞肌腱和清洗肌腱存在显著性差异(P < 0.05)，见图5。

2.4.2 细胞毒性对清洗后的异体真皮和异体肌腱进行细胞毒性检测。其中，异体真皮的清洗方式为E+K、7E+K，分别清洗1，2 h；异体肌腱的清洗方式为7E+K，清洗4 h。图6显示异体真皮7E+K清洗2 h和异体肌腱7E+K清洗4 h样品的细胞形态良好；MTT检测结果显示异体真皮7E+K清洗2 h和异体肌腱7E+K清洗4 h细胞存活率均大于80%，细胞毒性分级不大于1级；其余组样品细胞存活率均低于70%，具有潜在细胞毒性。

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引言

通过对生物组织进行脱细胞处理，得到具有天然结构的生物支架，是治疗临床组织损伤的理想方法[1-2]。天然结构的生物支架能够提供与机体相近的力学性能和结构特征，天然的组成也能够增强细胞反应性，调节细胞相容性[3-4]。近年来，大量文献报道了使用表面活性剂十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，SDS)进行同种异体、异种器官/组织脱细胞[5-8]。SDS能够结合细胞膜蛋白，实现短时间内破坏细胞膜和核膜，从而使细胞质DNA及染色体DNA暴露在细胞外基质中。相比于TritonX-100、SB、CHAPS等众多脱细胞试剂，SDS脱细胞的效率更高；相比于核酸酶，SDS并不会引起免疫反应；相比于酸、碱液或物理法如压力、电穿孔、超临界流体、搅拌等，SDS对细胞外基质的损害更小。但是，组织长时间浸泡于SDS溶液中会导致蛋白质变性并破坏其三维结构。当然，可以通过调节SDS浓度和处理时间来调控这种破坏。对于一些组织而言，细胞外基质的结构保持完整是最重要的，因为它能够提供细胞生长空间。然而，SDS很难从组织中清洗干净，容易造成试剂残留[9-10]。由于SDS几乎可以使所有的蛋白质溶解，破坏蛋白质的非共价键，从而使蛋白质变性，并丧失天然构象和功能，所以其残留会对动物和人体产生显著的毒副作用，往往需要长时间清洗、多次换液才能够降低脱细胞组织中的SDS残留。对于生产而言，工序耗时耗力是不经济的，并且长时间清洗可能对产品的微结构有破坏，因此迄今为止并未有企业采用该试剂进行脱细胞产品的生产。此前研究表明，脱细胞组织内的试剂残留可能会影响组织在体内外的细胞重组和生物相容性[11]。因此，对脱细胞试剂SDS进行清洗研究是很有必要的。文献报道，通过改变洗涤液的pH值或介电常数、赖氨酸的去质子化和SDS的释放是可能的[10，12]。此外，SDS在不同的清洗介质中溶解度是不一致的，也可通过这种手段移出组织中的SDS。基于此，提出一种经济高效的SDS残留清洗方法，通过使用乙醇和钾盐溶液，将同种异体组织内部的SDS残留控制到安全限度。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计研究型设计(探索性研究)。
1.2 时间及地点实验于2021年1月至2022年2月在上海亘从生物医用材料研究中心完成。
1.3 材料异体真皮和异体肌腱均由上海亚朋生物技术有限公司提供。其中，异体真皮厚度为0.2-0.7 mm，异体肌腱直径为3-7 mm。SDS(国药集团化学试剂有限公司)，无水乙醇(EtOH，上海凌峰化学试剂有限公司)，氯化钾(KCl，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，SDS残留检测试剂盒[生工生物工程(上海)股份有限公司]，摇床(YQI-II，江苏东鹏仪器制造有限公司)，光学显微镜(Nikon Eclipse E100，尼康，日本)，冷冻干燥机(FD-1A-50，北京博医康实验仪器有限公司，中国)，水浴锅(DKZ-3，上海一恒科技有限公司，中国)，多功能酶标仪(INFINITE 200 PRO，TECAN，瑞士)。配制0.5% SDS脱细胞试剂，配制体积分数75%乙醇，配制0.5 mol/L 氯化钾溶液。
1.4 实验方法
1.4.1 脱细胞处理将异体真皮和异体肌腱分别浸泡于盛有0.5% SDS的碘量瓶中，置于摇床以180 r/min、25℃振荡24 h。然后，取出异体真皮和异体肌腱，在纯水中漂洗3次以除去异体组织表面泡沫，除去泡沫的异体组织用于接下来的实验研究。脱细胞处理后的异体真皮和异体肌腱分别命名为脱细胞真皮和脱细胞肌腱。
1.4.2 SDS清洗将脱细胞真皮置于清洗介质中分别清洗1，2，4，8 h，料液比为1 cm2∶5 mL，清洗方式为4 ℃冰箱静置，每个清洗时间内换液3次。清洗介质有6种，分别为纯水、氯化钾溶液、无水乙醇、体积分数75%乙醇、无水乙醇+氯化钾溶液和体积分数75%乙醇+氯化钾溶液。采用这6种清洗介质的方式分别命名为H、K、E、7E、E+K和7E+K。其中，E+K或7E+K是指先用无水乙醇或者体积分数75% 乙醇，再用氯化钾溶液清洗，在总清洗时间内，2种清洗介质清洗时间均等。清洗后的异体真皮用PE袋中密封，置于2-8 ℃冰箱低温保存用于接下来的检测。将脱细胞肌腱置于清洗介质7E+K中清洗2，4 h，料液比为1 cm2∶5 mL，清洗方式同上所述。清洗后的异体肌腱用PE袋中密封，置于2-8 ℃冰箱低温保存用于接下来的检测。清洗处理后的脱细胞真皮和脱细胞肌腱分别命名为清洗真皮和清洗肌腱。
1.4.3 组织学检测将样品用固定液固定24 h后，切取5 mm×5 mm装入脱水盒进行脱水、包埋、切片处理，切片厚度为5 μm，使用苏木精和伊红染料按照标准组织学方案染色，用阿尔新蓝染料(Servicebio，G1049)对糖胺聚糖，天狼猩红染料(Servicebio，G1018)对胶原蛋白进行染色观察。
1.4.4 SDS、DNA、糖胺聚糖含量检测将样品置于冷冻干燥机内24 h去除水分，并称取一定质量的干组织，加入蛋白酶K 100 μL、蛋白酶K缓冲液200 μL和焦碳酸二乙酯水800 μL至最终反应体积为1 110 μL，58-60 ℃水浴加热至无可见的组织物质残留，所得消化液作试样液进行含量检测。
(1) SDS含量检测：采用SDS残留检测试剂盒，按照说明书所述，先制作SDS标准曲线，然后再进行试样液中SDS检测，得出吸光度代入标准曲线得出试样液中的SDS含量，换算成材料干试样SDS含量。每组3个平行样，结果取平均值。
(2) DNA含量检测：DNA含量检测方法如徐丽明等[13]所述，使用PicoGreen DNA检测试剂盒-Quant-IT DNA分子试剂盒进行检测，标准液和试样液中的DNA被荧光染料PicoGreen染色，用荧光酶标仪测定。测定条件：以480 nm为激发光波长，以520 nm为增强的发射荧光检测波长。通过标准液的DNA含量与浓度之间的线性方程得出试样液中的DNA含量。
(3)糖胺聚糖含量检测：采用二甲基亚甲基蓝分光光度法测定[14]，检测方法同此前研究[15]。
1.4.5 力学性能测试肌腱的力学性能在很大程度上决定了其应用，因此对异体肌腱的拉伸性能进行了测试，拉伸性能测试在电子万能实验机上进行。拉伸速率为20 mm/min，夹持器间的初始距离为25 mm。拉伸强度为样品的最大拉伸强度，断裂伸长率为最大拉伸强度时对应的应变，拉伸模量为应力-应变曲线上线性部分的斜率，范围为最大载荷的20%-50%。韧性定义为应力-应变曲线所围面积，由origin software计算得出。每组4个平行样，结果取平均值。
1.4.6 细胞毒性检测取清洗方式为7E+K的异体真皮(清洗2 h)和异体肌腱(清洗4 h)，经25 kGy辐照灭菌后按照GB/T 16886.5-2017进行细胞毒性检测。实验前，先将产品在无菌生理盐水中浸泡30 min再进行浸提，异体真皮浸提比为3 cm2/mL，异体肌腱浸提比为0.2 g/mL，浸提介质为含体积分数为10%胎牛血清的MEM 培养基，浸提温度为(37±1) ℃，浸提时间(24±2) h。实验方式同前期研究所述[12]，按照GB/T 16886.5-2017规定，存活率在80%以上为试验样品无细胞毒性作用。
1.5 主要观察指标经不同清洗方式清洗后，异体组织中SDS残留量、异体组织的结构性能变化和细胞毒性。
1.6 统计学分析所有结果表示为x±s，并通过Excel中函数TTEST单尾Student-t检验评估两组之间的显著性差异。显著性差异值(P值)分别设置为P < 0.05，P < 0.01和P < 0.001。

讨论

相比于物理法、酶法和非离子型去污剂，离子型去污剂的脱细胞效率是最高的[16]。然而，离子型去污剂易于残留在组织内部，对脱细胞组织的生物相容性产生严重的影响[17]。SDS是一种最常用的离子型去污剂，其能在短时间内去除同种异体组织内的细胞成分，脱细胞效率非常高。但是，SDS会使细胞外基质蛋白变性，并对移植后的再繁殖细胞具有很强的毒性[18-20]，这阻碍了SDS在组织脱细胞领域的应用。因此，去除脱细胞组织中残留的SDS是个亟待解决的研究课题。
该研究选择纯水、氯化钾溶液和乙醇作为清洗介质，并通过不同介质的排列组合进行清洗优化，高效去除同种异体组织中残留的SDS。“乙醇清洗”是基于SDS微溶于乙醇而易溶于水这一特性，且乙醇可降低溶液的表面张力，有助于清洗剂完全渗透入组织中。“氯化钾溶液清洗”是基于SDS能够与K+生成沉淀从而被清洗去除这一特性，此外高介电常数会降低SDS临界胶束浓度，更易于 SDS的沉淀析出。不同的清洗原理均能达到SDS清洗目的，且将不同原理的清洗方式组合，更能彻底地清洗组织中的SDS。
清洗介质对清洗效果的影响是显著的。在脱细胞后，对异体真皮中残留的SDS进行清洗，采用纯水、氯化钾溶液清洗8 h后，SDS残留均高于10 μg/mg；而采用无水乙醇、体积分数为75%乙醇以及乙醇与氯化钾溶液组合(E+K、7E+K)清洗8 h后，SDS残留均降低至10 μg/mg以下。WOLF等[21]指出，10 μg/mg是SDS低细胞毒性的一个阈值。显然，在8 h内，纯水和氯化钾是无法满足SDS清洗要求的。从短时间清洗效果来看，7E+K清洗2 h是最佳的，SDS降低了96.7%左右。对于异体肌腱而言，采用7E+K清洗2 h和4 h无显著性差异，降低了97%。相比于清洗24-72 h，7E+K清洗的效率明显提高[6，22]。KIM等[23]选择PBS、EtOH和碱液(pH 9)对脱细胞猪肺动脉壁中SDS进行清洗，该清洗方法清洗时长为24 h。SERGHEI等[24]选择PBS对 1% SDS脱细胞处理的猪肺瓣膜连续清洗10遍，共12 h，清洗液的细胞毒性才降低到20%以下。以上两种清洗方式的清洗时间较长。对于无水乙醇和体积分数为75%乙醇的清洗效果存在差异这一原因，可能是因为SDS微溶于无水乙醇而易溶于水。SDS的脱细胞效果是显著的，对组织细胞外基质的影响也不明显。图2展示了原材料、脱细胞处理和清洗后这3组组织的苏木精-伊红染色和DNA残留检测结果。显然，无论是异体真皮还是异体肌腱，在脱细胞处理和清洗后的苏木精-伊红染色图均无细胞核，而DNA含量也降低至50 ng/mg，这个值是DNA的安全限值[25]。ZAMBON等[26]和KASIMIR等[7]也证实使用SDS脱细胞能够有效降低异种组织大部分细胞核和残余DNA。从结构看，异体真皮的细胞外基质无明显变化，异体肌腱有所变化，但仍然保持其基本形态。事实上，相对疏松的结构利于细胞渗透，脱细胞外基质能够为细胞提供合适的生长环境，利于伤口愈合[27-28]。此处，SDS处理和7E+K清洗并未对支架结构产生较大影响。
肌腱的力学性能是其功能关键指标。从图3展示的结果看，总体上原材料肌腱的力学性能最优，脱细胞肌腱最差，这与脱细胞处理对肌腱的细胞外基质结构破坏有关，导致了其力学性能下降。但清洗肌腱的力学强度、模量、最大拉力比脱细胞肌腱要高。显然，采用7E+K清洗能够提高异体肌腱的力学性能。与骆井万等[29]报告的人体肌腱力学数值相比，原材料肌腱的力学数值低，可能是因为原材料的差异。清洗肌腱力学性能有所提高，可能与乙醇有关。乙醇能够使胶原蛋白等蛋白质肽链间生成氢键而使力学性能有所变化[30-31]，
这一点，也正好弥补了因脱细胞处理而导致异体肌腱力学损失。
细胞外基质中的必要蛋白质能够提高脱细胞组织的生物相容性。SDS是一种常见的阴离子表面活性剂，在生化实验及免疫检验中常用作蛋白质变性剂和助溶剂[32]。SUZUKI等[33]此前研究过从蛋白质溶液中除去SDS，采用钾盐、钡盐和钙盐进行清洗，结果证明钡盐和钙盐对蛋白有损害，而钾盐没有。该研究使用氯化钾溶液进行清洗，原因之一在于保护组织中的蛋白质。此前研究表明，胶原蛋白极易受到SDS诱导的结构变化的影响，因为SDS能够展开胶原蛋白三重螺旋结构并使其完全变性[34-35]。通过采用氯化钾溶液进行清洗，对蛋白质进行保护，也是清洗的目的之一。图4中天狼猩红对胶原蛋白染色结果显示出异体真皮清洗前后的胶原无明显差异，胶原蛋白保存完好；而异体肌腱在清洗后胶原有所损失，可能是乙醇的影响。阿尔新蓝染色和定量检测结果(图5)显示脱细胞对糖胺聚糖有所影响，但清洗对糖胺聚糖无较大影响。图4中异体肌腱阿尔新蓝染染色结果显示，相对于清洗前颜色变深，图5中显示相对于清洗前，清洗后糖胺聚糖含量有所上升，这是因为SDS能够与糖胺聚糖中的氨基酸分子结合，导致其变性。在清除了SDS后，糖胺聚糖有所恢复。此外，糖胺聚糖是多价阴离子，对K+具有较大亲和力，采用钾盐溶液清洗组织残留SDS，对稳定糖胺聚糖具有较大效果。
脱细胞对组织物质的减少是不可避免的，少量减少或许能够为异体细胞重建提供空间。此前的研究并没有比较清洗前后组织成分的影响，但在采用SDS脱细胞后，脱细胞支架仍然表现出良好的生物相容性[36]。清洗的目的是为了去除SDS的细胞毒性。就SDS的毒性效应而言，接触体表的浓度大于0.5%即会造成皮肤红肿[37]，浓度超过5×10-6 mol/L会导致白细胞活力下降[38]。SERGHEI等 [24]研究证明溶液SDS质量浓度高于50 mg/L会产生细胞毒性。而脱细胞组织在体内会缓慢降解，残留的SDS浓度无确定值。在体外细胞毒性评价中，将组织经过一定时间和比例浸提，将浸提液进行细胞培养。图6显示异体真皮和异体肌腱在清洗后的细胞存活率高于80%，细胞毒性分级不大于1级。显然，SDS含量低于(2.99±0.54) μg/mg是可接受的安全浓度。
结论：该研究选择的几种清洗方法，采用体积分数为75%乙醇和无水乙醇与氯化钾溶液组合(E+K、7E+K)的清洗方式是能够清洗异体真皮和异体肌腱残留SDS至安全限度的。其中，7E+K的清洗方式最优，该方法对脱细胞组织的性能影响小，是较理想的清洗方式。该研究的不足之处在于未系统研究清洗后的组织生物相容性。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程