煅烧骨结合脱细胞真皮基质用于犬牙槽嵴的保持

doi:10.12307/2022.268

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (22): 3445-3449.doi: 10.12307/2022.268

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煅烧骨结合脱细胞真皮基质用于犬牙槽嵴的保持

李晶，乔玮，任晓琦，石浩，杨婷，马绍英，苏成忠，李宝兴，赵亚平

中国辐射防护研究院生物材料研发中心，山西奥瑞生物材料有限公司，山西省太原市 030006

收稿日期:2020-10-20 修回日期:2020-11-21 接受日期:2021-05-23 出版日期:2022-08-08 发布日期:2022-01-10
通讯作者: 赵亚平，主任医师，中国辐射防护研究院生物材料研发中心，山西奥瑞生物材料有限公司，山西省太原市 030006
作者简介:李晶，男，1983年生，山西省太原市人，汉族，实验员，主要从事生物材料的应用研究。

Calcined bovine bone combined with acellular dermal matrix for maintaining the alveolar ridge in dog

Li Jing, Qiao Wei, Ren Xiaoqi, Shi Hao, Yang Ting, Ma Shaoying, Su Chengzhong, Li Baoxing, Zhao Yaping

Biomaterials Research & Development Center, China Institute of Radiation Protection, Shanxi Osteorad biomaterials Co., Ltd., Taiyuan 030006, Shanxi Province, China

Received:2020-10-20 Revised:2020-11-21 Accepted:2021-05-23 Online:2022-08-08 Published:2022-01-10
Contact: Zhao Yaping, Chief physician, Biomaterials Research & Development Center, China Institute of Radiation Protection, Shanxi Osteorad biomaterials Co., Ltd., Taiyuan 030006, Shanxi Province, China
About author:Li Jing, Experimentalist, Biomaterials Research & Development Center, China Institute of Radiation Protection, Shanxi Osteorad biomaterials Co., Ltd., Taiyuan 030006, Shanxi Province, China

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
煅烧骨：指来源于动物体的骨头，经过物理清洗、煅烧等方法处理，去除有机物，仅保留以羟基磷灰石为主的无机成分；具有良好的生物相容性、骨传导性、可吸收性等优点，是一种优秀的生物材料。
牙槽嵴保持：临床上将牙齿拔除后，由于生理刺激及牙周炎等原因，牙槽嵴会发生吸收，手术部位的骨量不足会导致后期种植手术的失败。为了避免牙槽嵴过度的吸收，需在拔牙窝内填充生物支架材料，避免牙槽嵴吸收的同时诱导机体成骨，保证手术部位的骨量充足。

背景：临床上常采用引导骨再生技术对骨缺损部位进行重建，即在骨缺损处植入支架材料，再采用生物屏障膜建立稳定的成骨环境，保证成骨细胞的增殖及血管的形成，取得了良好的效果。
目的：观察煅烧骨结合脱细胞真皮基质用于拔牙窝填充的成骨效果。
方法：采用高温煅烧法将牛松质骨制成煅烧骨，采用去表皮、脱细胞等方法将猪断层皮片制成脱细胞真皮基质，MTT法检测两种材料的细胞毒性。取9只比格犬，拔除下颚两侧第2，4前磨牙，拔牙窝内植入煅烧骨后用脱细胞真皮基质覆盖，分离颊舌侧牙龈并拉拢缝合，关闭拔牙创。术后1，3，6个月，采用锥形束CT、X射线片及组织学观察等方法评价成骨效果。实验由中国辐射防护研究院药物安全性评价中心伦理委员会审批，编号CIRP-IACUC-(R)2018081。
结果与结论：①两种材料浸提液分别培养L929小鼠成纤维细胞24 h后，倒置显微镜下可见细胞形态良好，无空泡、死亡现象，MTT法结果显示细胞存活率均在85%以上，无明显的细胞毒性；②动物实验下颌骨锥形束CT检测显示，随着愈合时间延长，植入部位的相对灰度值逐渐增高，拔牙创内的成骨量增加；③动物实验X射线片显示，术后1个月，植入部位成像均匀、无明显成骨；术后3个月，植入部位有部分成骨；术后6个月，植入部位有明显成骨；④动物实验苏木精-伊红染色显示，术后1个月，拔牙窝内有大量新形成的骨小梁结构，骨小梁排列均匀，煅烧骨部分被吸收；术后3个月，见粗大骨小梁结构，伴有大量软骨，残留少量的煅烧骨；术后6个月，拔牙创接近愈合，形成成熟骨组织，可见骨单元结构，已观察不到煅烧骨；⑤结果表明，煅烧骨复合脱细胞真皮基质用于拔牙窝的填充具有良好的成骨效果。

https://orcid.org/0000-0002-5503-1651 (李晶)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 材料, 煅烧骨, 脱细胞真皮基质, 拔牙窝填充, 引导骨再生

Abstract: BACKGROUND: In clinic, guided bone regeneration technology is often used to reconstruct the bone defect. That is, the scaffold material is implanted in the bone defect, and then the biological barrier membrane is used to establish a stable environment to ensure the proliferation of osteoblasts and the formation of blood vessels, which has achieved good results.
OBJECTIVE: To observe the osteogenic effect of true bone ceramic combined with acellular dermal matrix in tooth socket filling.
METHODS: Bovine cancellous bone was calcined to true bone ceramic. The acellular dermal matrix was prepared from split-thickness skin which the epidermis and cellular components have been extracted. Cytotoxicities of true bone ceramic and acellular dermal matrix were evaluated by MTT assay. The second and fourth premolars on both sides of the mandible were extracted in nine beagle dogs. The true bone ceramic was implanted into the socket and covered with acellular dermal matrix. The buccal and lingual gingivae were separated and sutured to close the extraction wound. At 1, 3, and 6 months after surgery, cone beam CT, X-ray and histology were used to evaluate the new bone formation. The experiment was approved by Drug Safety Evaluation Center in China Institute for Radiation Protection (approval No. CIRP-IACUC-(R)2018081).
RESULTS AND CONCLUSION: (1) L929 mouse fibroblasts were cultured with the two extracts for 24 hours. Under the inverted microscope, the cells were in good shape without vacuoles or death. MTT assay results showed that the cell survival rate was above 85%, without obvious cytotoxicity. (2) The results of cone beam CT showed that the relative gray value of the implant site increased gradually with the extension of healing time, and the amount of bone formation in tooth extraction wound increased. (3) The X-ray films showed that at 1 month after the operation, the imaging of the implanted site was uniform without obvious osteogenesis. At 3 months after the operation, there was partial osteogenesis. At 6 months after the operation, the implant site had obvious osteogenesis. (4) Hematoxylin-eosin staining showed that a large number of trabeculae were formed 1 month after operation, and the bone trabeculae was evenly arranged, and the true bone ceramic was partly absorbed. Coarse trabeculae structure with a large amount of cartilage and a small amount of calcined bone remained at 3 months after operation. The tooth extraction wound was nearly healed and mature bone tissue was formed, and the bone unit structure was visible; true bone ceramic could not be seen at 6 months after operation. (5) Results suggest that true bone ceramic combined with acellular dermal matrix show good bone formation for extraction socket filling.

Key words: material, true bone ceramic, acellular dermal matrix, extraction socket filling, guided bone regeneration

中图分类号:

李晶, 乔玮, 任晓琦, 石浩, 杨婷, 马绍英, 苏成忠, 李宝兴, 赵亚平. 煅烧骨结合脱细胞真皮基质用于犬牙槽嵴的保持[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(22): 3445-3449.

Li Jing, Qiao Wei, Ren Xiaoqi, Shi Hao, Yang Ting, Ma Shaoying, Su Chengzhong, Li Baoxing, Zhao Yaping. Calcined bovine bone combined with acellular dermal matrix for maintaining the alveolar ridge in dog[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(22): 3445-3449.

图/表（结果） 8

2.1 两种材料扫描电镜观察结果高温煅烧后的牛骨呈白色；喷金后用扫描电镜观察显示，煅烧骨由排列紧密、颗粒均匀的羟基磷灰石组成，见图2。

脱细胞真皮基质的乳突侧胶原纤维排列紧致，仅有少量孔隙，见图3A；真皮侧胶原纤维排列松散、纵横交错，形成网状结构，见图3B；横截面观察显示，脱细胞真皮基质由多层胶原层组成，且结构紧密，见图3C、D。

2.2 脱细胞真皮基质组织学观察结果脱细胞真皮基质呈乳白色，颜色均匀，表面平整，见图4A。对其进行苏木精-伊红染色后显微镜观察，真皮基质胶原纤维紧密排列，着色均一，无细胞成分残留，见图4B。

2.3 两种材料细胞相容性检测结果用两种浸提液分别培养细胞24 h后，倒置显微镜观察显示，不同实验组细胞形态良好，无空泡、死亡现象。MTT检测结果显示，与空白对照组相比，各实验组的细胞存活率均在85%以上，差异无显著性意义(P ? 0.05)，见表1。

根据《GB/T 16886.5-2017 医疗器械生物学评价第5部分：体外细胞毒性试验》附录C，“如存活率下降到?空白的70%则具有潜在的细胞毒性”，说明煅烧骨及脱细胞真皮基质均无细胞毒性。
2.4 动物实验锥形束CT评价拔牙窝成骨效果以下颚第3颗前磨牙牙槽中隔的灰度值为对照，计算植入部位的相对灰度比，见图5A。结果显示，术后1 d时，植入部位的相对灰度值为0.60；随着愈合时间越长，植入部位的相对灰度值逐渐增高，见图5B，C，表明随着时间的推移，拔牙创内生成新骨的量越多，术后1，3，6个月的相对灰度比分别为0.73，0.82，0.87，见图5D。

2.5 动物实验X射线片评价成骨效果 X射线片检查结果显示，术后1个月，植入部位成像均匀、无明显成骨，见图6A；术后3个月，植入部位有部分成骨，见图6B；术后6个月，植入部位有明显成骨，见图6C。

2.6 动物实验组织学评价拔牙窝成骨效果苏木精-伊红染色显示，术后1个月，拔牙窝内有大量新形成的骨小梁结构，骨小梁排列均匀，煅烧骨部分被吸收；术后3个月，见粗大骨小梁结构，有大量软骨，残留少量未被吸收的煅烧骨；术后6个月，拔牙创接近愈合，形成成熟骨组织，逐渐形成骨单元结构，不见煅烧骨残留，见图7。

2.7 材料的生物相容性由细胞毒性实验可知，煅烧骨与脱细胞真皮基质材料具有良好的细胞相容性。

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引言

材料方法

1.1 设计动物观察性实验。
1.2 时间及地点实验于2018年5月至2019年5月在山西奥瑞生物材料有限公司完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 1.5-2周岁的雄性比格犬9只，体质量10-15 kg，牙齿坚固且无牙周炎等口腔疾病，由南京三生生物技术有限公司提供，生产许可证号：SCXK(苏)2016-007。
1.3.2 主要细胞、仪器、试剂 L929小鼠成纤维细胞株(中国科学院上海细胞生物学研究所)；MEM培养基、胎牛血清(GIBCO公司，美国)；胰蛋白酶、SDS、MTT(北京索莱宝科技有限公司)；KH2PO4、Na2HPO4、NaCl、KCl、戊二醛、无水乙醇、异丙醇、过氧乙酸(天津市科密欧化学试剂有限公司)；戊巴比妥钠(北京化学试剂公司)；超声波清洗机(无锡市西爱斯电源模块有限公司)；箱式高温电阻炉(天津市莱玻特瑞仪器设备有限公司)；光学显微镜、倒置相差显微镜(Olympus公司，日本)；扫描电子显微镜、喷金仪(日本电子株式会社，日本)；CO2培养箱(Thermo公司，美国)；酶标仪(Bio-Rad公司，美国)；CS 9300型锥形束CT机(Carestrea公司，美国)；X射线机(石家庄华东医疗科技有限公司)；生物组织自动脱水机、包埋机(浙江省金华市科迪仪器设备有限公司)；石蜡切片机(Leica 公司，德国)。
1.4 材料制备
1.4.1 煅烧骨制备 24月龄鲁西黄牛宰杀后取新鲜脊柱骨(市售)，锯成松质骨小块，用纯化水超声清洗至无血液、脂质、细胞碎片等残留；粉碎后筛选粒径为1.0-2.0 mm骨小粒，选择(800±10) ℃高温煅烧3 h，自然冷却；大量纯化水清洗至白色，PBS调节pH值；70 ℃烘干至恒质量，辐照灭菌后备用。
1.4.2 脱细胞真皮基质制备 12月龄长白猪宰杀后取新鲜猪皮(市售)，清洗、脱毛，取厚度为0.5 mm的断层皮；选择0.25%胰蛋白酶溶液中震荡脱表皮，置于5倍体积的0.5% SDS溶液中，超声清洗(输出功率：2.4 kW)去除细胞；0.2%戊二醛溶液交联15 min；PE试剂(0.2%过氧乙酸，体积分数24%乙醇)病毒灭活30 min；大量纯化水清洗后冷冻干燥，辐照灭菌备用。
1.4.3 材料性状观察
扫描电镜观察：取制备的煅烧骨及脱细胞真皮基质，喷金后置于扫描电子显微镜下观察材料的显微结构。
组织学观察：制备的脱细胞真皮基质用体积分数10%甲醛溶液固定24 h，梯度乙醇脱水后石蜡包埋，制成厚4 μm的切片，苏木精-伊红染色，光学显微镜下观察胶原纤维形态、细胞及细胞碎片残留。
细胞相容性检测：每种材料各设3个平行样，将煅烧骨用含体积分数10%胎牛血清的MEM培养基按照每0.1 g加1 mL培养基的比例浸提；脱细胞真皮基质用含体积分数10%胎牛血清的MEM培养基按照每3 cm2加1 mL培养基的比例浸提；37 ℃浸提24 h，取上清浸提液备用。选择含体积分数10%胎牛血清的MEM培养基作为空白对照组[16]。

参照国家标准GB/T 16886.5-2017 附录C，采用MTT法进行细胞毒性实验[17]。将生长状态良好的L929细胞接种至96孔板，每孔约1×104个细胞。培养24 h，将培养基更换为上述浸提液，每份浸提液接至5个孔中，每孔200 μL。24 h后弃待测液，加入50 μL MTT工作液(1 g/L)继续培养3 h，弃上清，加150 μL 异丙醇溶解结晶，30 min后于570 nm处测量吸光度值。计算每组样品的平均吸光度值，按照下面的公式计算得出细胞相对存活率。

1.4.4 煅烧骨联合脱细胞真皮基质用于犬拔牙窝填充实验动物实验由中国辐射防护研究院药物安全性评价中心伦理委员会审批，编号CIRP-IACUC-(R)2018081。实验动物饲养1周后开始实验，静脉注射3%戊巴比妥钠(30 mg/kg)进行全身麻醉，将动物侧卧，固定头部，碘伏擦拭口腔消毒，手术部位注射盐酸利多卡因进行局部浸润麻醉；钝性分离牙龈，拔除双侧下颌第二、四前臼齿，清除拔牙窝内软组织，用牙科钻磨平牙槽中隔；将煅烧骨用生理盐水复水填充至拔牙窝内与牙槽嵴顶端平齐；将脱细胞真皮基质修剪成合适大小，覆盖在拔牙创及填充物上方，游离颊、舌侧牙龈，拉拢缝合关闭拔牙创面，见图1。术后连续3 d肌肉注射庆大霉素(8×104 U/只)防止感染，7 d后拆缝合线，15 d内喂软食。

取材：术后1，3，6个月，分别对3只比格犬实施安乐死，取完整下颌骨，体积分数4%甲醛溶液固定1周后进行相关检测。
锥形束CT评价：应用锥形束CT扫描标本，电压< 110 kV，电流< 15 mA，有效曝光时间< 5.4 s，体素0.18 mm ×0.18 mm ×0.18 mm。获得的数据导入CS 3D Imaging软件进行三维重建，用image-pro plus 6.0软件对重建图片进行分析，以临近的第三前磨牙牙根作为参照，计算植骨部位的相对灰度比。
X射线片评价：应用X射线机对标本进行拍摄(50-60 kV，6 mAs)，对获得的X射线片进行成骨评价。
组织学评价：固定后的标本，50%甲酸溶液脱矿2个月，脱水后石蜡包埋，制成厚度为4 μm的切片，苏木精-伊红染色，光学显微镜下观察，评价植入物的吸收及成骨效果。

1.5 主要观察指标术后不同时间点比格犬拔牙窝的锥形束CT、X射线片及组织学观察结果。
1.6 统计学分析所有统计学数据均采用SPSS 20.0软件进行分析，实验结果以x±s表示，组间比较用t检验。

讨论

牙齿拔除后数小时内血管内皮细胞及胶原纤维便开始增殖，为创伤部位建立血运条件做准备；1周内，间充质干细胞分化成骨祖细胞，进而分化成软骨细胞，在7-10 d内达到峰值；第2周，随着软骨细胞分化成肥大软骨细胞，拔牙窝内的软骨基质开始矿化；术后6-8周，随着肥大软骨细胞的分化结束，便启动了矿化的软骨基质的吸收，破骨细胞和成骨细胞协同作用，使得矿化的软骨基质逐渐被具有小梁结构的编织骨替代，形成硬骨痂。此后，由于骨小梁结构的不规则性及骨细胞较多，还需多次的骨改建形成稳定的结构。骨改建过程由激活、吸收和生成3个过程循环进行，此过程一般可以持续数月甚至数年。牙齿拔除后，随着创口的愈合开始，牙槽骨的吸收也随之开始。为了对拔牙位点牙槽骨进行保存，临床上除了采用微创拔牙术以减少对牙槽窝骨壁的损伤外，还会选择翻瓣技术或转瓣技术对拔牙窝进行保护，但这两种方法都会对牙齿周边的软组织造成损伤。与上述两种方法相比，在拔牙窝植入填充材料及屏障膜则为更加安全及有效的做法。牛骨经过高温煅烧后的主要成分为无机成分羟基磷灰石，有机成分已经被全部去除[18]，前期研究表明煅烧骨具有良好的生物相容性[19]；有研究表明羟基磷灰石具有骨诱导活性，可在植入部位诱导间充质干细胞分化为成骨细胞[20]。脱细胞真皮基质的主要成分为Ⅰ型胶原蛋白，Ⅰ型胶原蛋白的组织相容性较好[21-23]，经过戊二醛交联后进一步降低了其免疫原性，基本不会引起免疫排斥反应[24-27]。
扫描电镜观察显示，天然煅烧骨具有大量的孔隙结构，脱细胞真皮基质粗糙面的胶原纤维也形成了大量的网状结构，此特点有利于细胞及胶原纤维的附着、血管的形成及间充质干细胞的聚集[28]。煅烧骨具有与人骨类似的天然孔隙结构，在引导新骨形成的同时其降解速率与成骨速度相匹配，有利于新骨的形成，增加手术部位的骨量。
脱细胞真皮基质应用于拔牙创的填充可促进拔牙创的愈合，有效增强拔牙窝的成骨效果[29]。将脱细胞真皮基质覆盖在填充物表面，一起到保护拔牙创的作用，避免拔牙创暴露于口腔环境中，防止发生干槽症[30]；二可以有效防止成纤维细胞及上皮细胞的入侵，为其下方成骨提供了稳定的条件；三网状结构有利于间充质干细胞等细胞成分的迁移。
对煅烧骨和脱细胞真皮基质进行细胞毒性检验，结果表明二者没有细胞毒性，具有良好的体外相容性。植入实验术后1个月用锥形束CT及X射线片对成骨效果进行观察，锥形束CT结果显示植入部位的相对灰度值有所增加，但X射线片没有观察到明显成骨，证明此时牙槽窝的成骨以软骨为主；组织学观察术后1个月，植入部位有大量的骨小梁结构，这些都与拔牙创愈合的特征相符合；术后3，6个月的锥形束CT及X射线片观察结果证明了植入部位的骨量在不断增加。组织学观察也显示了骨小梁结构在改建的过程中逐渐变粗，最后形成骨单元结构。实验将两种材料联合用于拔牙窝填充，结合了二者的优点，更有利于新骨的形成及结构的重建，为后期种植体的植入提供了良好的条件。
在动物实验术后1个月的成骨检查中，发现锥形束CT可以观察到手术部位相对灰度值已增加，而X射线片没有观察到成骨现象，原因是因为此时的成骨以软骨为主，尚未矿化，其密度低于周围的骨组织。所以，建议临床早期对手术部位成骨的评估方法宜选择锥形束CT而非X射线片。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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Calcined bovine bone combined with acellular dermal matrix for maintaining the alveolar ridge in dog

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