点按脾经合穴对急性钝挫伤大鼠骨骼肌炎症因子及钙离子稳态的影响

doi:10.12307/2023.436

中国组织工程研究 ›› 2023, Vol. 27 ›› Issue (20): 3123-3128.doi: 10.12307/2023.436

• 肌肉肌腱韧带组织构建 tissue construction of the muscle, tendon and ligament • 上一篇下一篇

点按脾经合穴对急性钝挫伤大鼠骨骼肌炎症因子及钙离子稳态的影响

刘海潮1，王浩2，王诗忠2，林建平2，金京1，陈少清1

1福建中医药大学康复医学院，福建省福州市 350122；2福建医科大学健康学院，福建省福州市 350122

收稿日期:2022-06-13 接受日期:2022-07-21 出版日期:2023-07-18 发布日期:2022-11-19
通讯作者: 陈少清，博士，副教授，福建中医药大学康复医学院，福建省福州市 350122
作者简介:刘海潮，男，1995年生，福建省建瓯市人，汉族，福建中医药大学在读硕士，主要从事中医康复学研究。
基金资助:
国家自然科学基金青年项目(81904317)“基于内质网应激-自噬反应研究“脾主肌肉”理论下推拿脾经治疗骨骼肌损伤的作用机制”，项目负责人：林建平；国家自然科学基金面上项目(81973924)“基于外泌体miR-146a介导Akt/NF-κB通路探讨针刺委中穴治疗腰痛的作用机制”，项目负责人：陈少清

Effects of point-pressing of the spleen meridian on inflammatory factors and calcium homeostasis in the skeletal muscle of acute blunt contusion rats

Liu Haichao1, Wang Hao2, Wang Shizhong2, Lin Jianping2, Jin Jing1, Chen Shaoqing1

1Rehabilitation School of Medicine, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122, Fujian Province, China; 2School of Health, Fujian Medical University, Fuzhou 350122, Fujian Province, China

Received:2022-06-13 Accepted:2022-07-21 Online:2023-07-18 Published:2022-11-19
Contact: Chen Shaoqing, MD, Associate professor, Rehabilitation School of Medicine, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122, Fujian Province, China
About author:Liu Haichao, Master candidate, Rehabilitation School of Medicine, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122, Fujian Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China (Youth Project), No. 81904317 (to LJP); the National Natural Science Foundation of China (General Project), No. 81973924 (to CSQ)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

脾经合穴：即为阴陵泉穴，在古代文献记载与现代临床实践中均可用于治疗“筋伤”类疾病。且脾经气血在此汇合，使得阴陵泉穴本身具备“脾主肌肉四肢”与“脾主统血”的功效，对于四肢损伤具有较好疗效。
急性骨骼肌钝挫伤：指骨骼肌由一种非穿透性的、急剧的暴力损伤，使损伤部位肿胀、瘀血、肌纤维断裂，炎症反应现象明显，临床表现为疼痛、水肿以及活动受限。

背景：既往研究表明，推拿可促进骨骼肌损伤的修复，但其具体机制尚不明确。
目的：探讨点按脾经合穴对急性钝挫伤大鼠骨骼肌修复过程中炎症和钙离子稳态的影响。
方法：将32只雄性SD大鼠随机分为空白组、模型组、点按非穴组、点按穴位组，除空白组外，其余3组均建立急性腓肠肌钝挫伤模型。点按非穴组取阴陵泉同一水平线与胆经和膀胱经中线的相交点穴；点按穴位组取“阴陵泉”穴，均1次/d，连续治疗7 d。干预结束后采用Catwalk小动物步态分析系统观察各组大鼠运动情况，苏木精-伊红染色法观察骨骼肌形态变化，ELISA法检测炎症因子水平和内质网钙ATP酶的活性，钙含量显色法检测骨骼肌组织钙浓度的变化，TUNEL法检测骨骼肌组织内细胞凋亡水平。
结果与结论：①与模型组比较，点按穴位组的平均支撑时相显著增大(P < 0.01)；与点按非穴组比较，点按穴位组平均支撑时相显著增大(P < 0.05)；②点按穴位组炎性细胞和红细胞聚集情况减少，且骨骼肌修复情况优于点按非穴组；③与模型组相比，点按穴位组肿瘤坏死因子α、白细胞介素6的质量浓度显著降低(P < 0.01)，SERCA活性显著提高(P < 0.01)；与点按非穴组比较，点按穴位组肿瘤坏死因子α质量浓度显著降低(P < 0.01)，白细胞介素6的变化无显著差异(P > 0.05)，SERCA的活性显著提高(P < 0.01)；④与模型组比较，点按穴位组Ca2+浓度显著降低(P < 0.01)；与点按非穴组相比，点按穴位组Ca2+的浓度显著降低(P < 0.05)；⑤与模型组比较，点按非穴组与点按穴位组细胞凋亡率显著降低(P < 0.01)；与点按非穴组比较，点按穴位组细胞凋亡率显著降低(P < 0.05)；⑥提示点按脾经合穴可有效改善骨骼肌损伤大鼠运动功能，促进骨骼肌修复，其机制可能与降低炎症因子、促进钙泵功能、维持钙内环境稳态、从而减少细胞凋亡相关。
https://orcid.org/0000-0002-7052-7778(刘海潮)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 骨骼肌, 钝挫伤, 钙稳态, 钙泵, 炎症因子, 细胞凋亡, 点按, 脾主肌肉

Abstract: BACKGROUND: Previous studies have shown that tuina can promote the repair of skeletal muscle injuries, but the specific mechanism is unclear.
OBJECTIVE: To investigate the effect of point-pressing of the spleen meridian on inflammation and calcium homeostasis in skeletal muscle repair in rats with acute blunt contusion injuries.
METHODS: Thirty-two male Sprague-Dawley rats were randomly divided into blank group, model group, non-acupoint percussion group, and acupoint percussion group. Except for the blank group, animal models of acute gastrocnemius blunt contusion were established in the other three groups. In the non-acupoint pressing group, the intersection point of the same horizontal line of Yinlingquan acupoint (SP 9) and the midline of the gallbladder and bladder meridians was taken for percussion. In the acupoint pressing group, percussion was performed at the Yinlingquan acupoint. Point-pressing in the two groups was done once a day, for 7 consecutive days. Catwalk small animal gait analysis system was used to observe locomotor activity of rats. Hematoxylin-eosin staining was performed to observe the skeletal muscle morphology changes. ELISA method was used to detect the levels of inflammatory factors and the activity of sarcoplasmic/endoplasmic reticulum Ca2+ATPase (SERCA). Calcium concentration in the skeletal muscle was measured using the calcium assay. The level of apoptosis in the skeletal muscle was detected by TUNEL method.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the model and non-acupoint pressing groups, the average support phase was significantly increased in the acupoint pressing group (P < 0.01, P < 0.05). Aggregation of inflammatory cells and red blood cells was reduced in the acupoint percussion group, and skeletal muscle repair was also better in the acupoint percussion group than the non-acupoint pressing group. Compared with the model group, the levels of tumor necrosis factor α and interleukin-6 were significantly decreased in the acupoint pressing group (P < 0.01), and the SERCA activity was significantly increased (P < 0.01). Compared with the non-acupoint pressing group, the level of tumor necrosis factor α was significantly decreased (P < 0.01), the level of interleukin-6 changed insignificantly (P > 0.05), and the activity of SERCA was significantly increased in the acupoint pressing group (P < 0.01). Compared with the model and non-acupoint pressing groups, the concentration of Ca2+ was significantly decreased in the acupoint pressing group (P < 0.01, P < 0.05). Compared with the model group, the apoptotic rate was significantly reduced in the two point-pressing groups (P < 0.01). The apoptotic rate in the acupoint percussion group was significantly lower than that in the non-acupoint pressing group (P < 0.05). To conclude, percussion of the spleen meridian can effectively improve the motor function of rats with skeletal muscle injury and promote skeletal muscle repair. Its mechanism may be related to reducing inflammatory factors, promoting calcium pump function, maintaining calcium homeostasis, and thereby reducing cell apoptosis.

Key words: skeletal muscle, blunt contusion, calcium homeostasis, calcium pump, inflammatory factor, apoptosis, point-pressing, the main muscles of the spleen

中图分类号:

刘海潮, 王浩, 王诗忠, 林建平, 金京, 陈少清. 点按脾经合穴对急性钝挫伤大鼠骨骼肌炎症因子及钙离子稳态的影响[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(20): 3123-3128.

Liu Haichao, Wang Hao, Wang Shizhong, Lin Jianping, Jin Jing, Chen Shaoqing. Effects of point-pressing of the spleen meridian on inflammatory factors and calcium homeostasis in the skeletal muscle of acute blunt contusion rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2023, 27(20): 3123-3128.

图/表（结果） 6

2.1 实验动物数量分析采用SD大鼠32只，实验分为4组，所有造模大鼠均满足中度挫伤标准。
2.2 各组大鼠行为学分析见图1。与空白组比较，模型组的平均摆动速度和平均支撑时相显著减小(P < 0.01)；与模型组比较，点按非穴组的平均摆动速度和平均支撑时相无显著变化(P > 0.05)，点按穴位组的平均摆动速度和平均支撑时相显著增大(P < 0.05，P < 0.01)；与点按非穴组比较，点按穴位组平均支撑时相显著增大(P < 0.05)。

2.3 各组大鼠腓肠肌形态学分析见图2。空白组肌纤维排列整齐，组织间隙正常，没有出现断裂，结构完整清晰，未见炎性细胞及红细胞聚集；模型组红细胞与炎性细胞大量聚集，肌纤维排列不齐，结构不清，局部出现断裂现象，肌肉损伤较为明显；点按非穴组损伤现象有所好转，未出现肌纤维断裂现象，但肌纤维排列仍未致密，炎性细胞仍有少量聚集；点按穴位组损伤基本恢复，整体结构较为整齐，未见红细胞和炎性细胞聚集现象，但肌纤维排列仍未致密。

2.4 各组大鼠受损骨骼肌肿瘤坏死因子α、白细胞介素6和SERCA表达水平见图3。与空白组比较，模型组肿瘤坏死因子α、白细胞介素6的质量浓度显著升高(P < 0.01)，SERCA的活性显著降低(P < 0.01)；与模型组相比，点按非穴组肿瘤坏死因子α、SERCA的活性变化差异无显著性意义(P > 0.05)，白细胞介素6的表达显著降低(P < 0.01)；与模型组相比，点按穴位组肿瘤坏死因子α、白细胞介素6的质量浓度显著降低(P < 0.01)，SERCA活性显著提高(P < 0.01)；与点按非穴组比较，点按穴位组肿瘤坏死因子α浓度显著降低(P < 0.01)，白细胞介素6质量浓度变化差异无显著性意义(P > 0.05)，SERCA的活性显著提高(P < 0.01)。

2.5 各组大鼠骨骼肌Ca2+浓度与空白组比较，模型组与点按非穴组Ca2+的浓度显著升高(P < 0.01，P < 0.05)；与模型组比较，点按非穴组的Ca2+浓度无显著变化(P > 0.05)，点按穴位组Ca2+浓度显著降低(P < 0.01)；与点按非穴组比较，点按穴位组的Ca2+浓度显著降低(P < 0.05)，见表1。

2.6 点按脾经合穴抑制急性钝挫伤腓肠肌组织细胞凋亡如图4所示，与空白组相比，模型组绝大多数细胞核中存在棕色颗粒，即多数细胞都已凋亡；与模型组相比，点按非穴组阳性细胞减少；点按穴位组阳性细胞显著减少。通过 Image J 软件对细胞计数后计算各组腓肠肌细胞凋亡率并进行统计分析。与空白组相比，模型组细胞凋亡率显著增加(P < 0.01)；与模型组相比，点按非穴组与点按穴位组细胞凋亡率显著性降低(P < 0.01)；与点按非穴组组比较，点按穴位组细胞凋亡率显著降低 (P < 0.05)，见图5。

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引言

骨骼肌损伤是运动医学领域的常见疾病之一，有超过60%属于急性钝挫伤[1]，损伤部位多见于股四头肌与腓肠肌[2]。骨骼肌急性钝挫伤多由非穿透性的、急剧的暴力所致，其主要病理表现为损伤部位肿胀、瘀血，甚至肌纤维断裂，临床表现为疼痛、水肿以及活动受限[3]。骨骼肌本身具有一定的修复能力，但修复时间多长达2个月之久，且极易形成瘢痕组织[4]，因此寻找一个有效促进骨骼肌修复过程的干预方式是运动医学领域的研究热点和难点。骨骼肌损伤属于中医“筋伤”“足痹”范畴，推拿作为传统中医外治法，以其“通经活络，活血化瘀”的功效广泛应用于此类疾病的治疗。不同于以往对推拿手法治疗骨骼肌损伤的研究，此次研究结合中医经典理论对推拿治疗骨骼肌损伤进行探讨[5-6]。中医理论认为，脾主统血，对血液运行具有固摄作用，可使离经之血减少，从而缓解“气滞血瘀”的程度[7]。此外，“脾主肌肉四肢”，四肢肌肉疾病都可责之于脾；骨骼肌的损伤修复需要大量营养物质，而“脾为后天之本，气血生化之源”，可为骨骼肌修复提供大量“精微物质”[8]。阴陵泉作为脾经合穴，除调节局部气血的功能外，还具备“脾主统血”与“脾主肌肉”的功效，在古代文献记载与现代临床实践中均可用于治疗“筋伤”类疾病[9-11]。
目前，推拿治疗骨骼肌损伤的机制研究以炎症反应最为常见，主要探讨炎症反应对肌卫星细胞的激活以及骨骼肌纤维化等方面的影响[12]。但有研究表明，炎症反应与“钙泵”即内质网钙ATP酶(sarcoplasmic/endoplasmic reticulum Ca2+ATPase，SERCA)的关系十分密切，“钙泵”作为Ca2+稳态的调节器，已成为多种疾病的治疗靶点[13-15]。Ca2+稳态是细胞发挥正常生理功能必不可少的条件之一，近年来Ca2+稳态与细胞凋亡关系的研究增多，普遍认为钙稳态失衡导致骨骼肌细胞凋亡是骨骼肌损伤的重要诱因[16]。基于此，此次研究通过观察点按脾经合穴后大鼠运动情况、腓肠肌组织形态改变，以及肿瘤坏死因子α、白细胞介素6、SERCA、Ca2+浓度与细胞凋亡数的变化，探讨点按脾经合穴减少急性骨骼肌损伤的作用机制，为临床治疗提供实验依据。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验，采用t检验或单因素方差分析。
1.2 时间及地点实验于 2022年3月在福建医科大学实验动物中心进行造模及干预，2022年4-5月在福建中医药大学康复产业研究院完成实验检测工作。
1.3 材料
1.3.1 实验动物选用SPF级SD雄性大鼠32只，体质量260-280 g，由福建医科大学动物实验中心提供，许可证号：SCXK(闽)2016-0002。实验动物按照国家实验动物饲养和使用标准，模拟昼夜交替，自由饮食和饮水。此次实验获得福建医科大学动物伦理委员会批准，伦理批号：FJMUIACUC 2020-0038。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。
1.3.2 主要试剂及仪器苏木精-伊红染色试剂盒(G1003，Servicebio公司)，肿瘤坏死因子α ELISA Kit(EK0526，武汉博士德生物工程有限公司)，白细胞介素6 ELISA Kit(EK0412，武汉博士德生物工程有限公司)，SERCA ELISA Kit(E02S0463，上海碧云天生物技术公司)，钙离子显色检测试剂盒(S1063S，海碧云天生物技术公司)。
光学透射显微镜(Nikon H550S，日本尼康仪器有限公司)，步态分析系统(Noldus 荷兰 CatWalk XT 10.0)，Epoch酶标检测仪(Epoch、BioTeK公司，德国)，Bio-rad伯乐小型垂直电泳槽(Bio-rad，美国)，自制大鼠固定器(专利号：ZL202120268993.6，发明人：林建平)，推拿压力传感器(MY 2801，苏州能斯达电子科技有限公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 动物分组 32只 SD 大鼠按随机数字表法随机分为4组，即空白组、模型组、点按非穴组以及点按穴位组，每组8只。

1.4.2 造模方法空白组大鼠仅模拟抓取，模型组、点按非穴组以及点按穴位组参照文献[17-18]的方法建立大鼠急性骨骼肌钝挫伤模型。大鼠经腹腔注射2%戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉后，使其右下肢被动伸膝、踝背屈90°，选取大鼠小腿内侧面[17]，距足跟1.5 cm处作为击打点，采用自制造模装置，底部带弹簧缓冲装置的直径0.5 cm圆钝型打击头，以170 g重物由70 cm高度自由落下，连续打击大鼠右侧腓肠肌3次。造模后按照于天水等[19]建立的中度挫伤标准，通过大体观察及触诊，将无骨折、皮肤无破损，且后肢肿胀，皮下可见瘀血扩大的大鼠入组，不符合条件的剔除。
1.4.3 干预方法空白组、模型组仅模拟抓取；点按穴位组和点按非穴组于造模成功后1 d开始干预，点按操作人员均经过专业训练，利用推拿压力传感器(MY 2801，苏州能斯达电子科技有限公司)进行干预，每次干预刺激力量为100-120 g，每次点按时长为10 s，其间间隔2 s，连续点按，每日共点按50次，连续干预7 d。干预时采用自制大鼠固定装置固定大鼠，点按穴位组点按右侧“阴陵泉”，非穴组取阴陵泉同一水平线与胆经和膀胱经的中线相交点[20-22]，其他操作同点按穴位组。
1.4.4 取材及样本制备干预结束后，大鼠腹腔注射2%戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉。待大鼠彻底麻醉后，取右侧腓肠肌
0.5 cm×0.5 cm×0.2 cm的组织块，将其投入40 g/L多聚甲醛溶液中固定，4 ℃过夜，后将其经过组织脱水，制作石蜡切片。
1.4.5 组织匀浆制备实验结束后，取20-50 mg的新鲜腓肠肌组织，每只取2个组织块，剪碎，用PBS洗净，其中一个组织块按照1∶10的比例倒入生理盐水，准备组织匀浆，待ELISA检测；另一个组织块按照钙含量显色检测法要求，按一定比例倒入特定样品裂解液，待钙浓度检测。
1.5 主要观察指标
1.5.1 Catwalk步态分析在模型制作前，将大鼠置于CatWalk步态分析仪中训练1周，使大鼠在实验时能匀速无停顿地通过步态分析仪通道，干预第7天结束后立即对大鼠进行步态分析，结果将自动生成一系列步态参数，次日取材。
1.5.2 苏木精-伊红染色腓肠肌组织切片经二甲苯脱蜡，苏木精染色，盐酸乙醇分化，伊红染色，苏木精染核，中性树胶封固，镜下观察各组大鼠腓肠肌形态结构变化。
1.5.3 ELISA法检测骨骼肌肿瘤坏死因子α、白细胞介素6和SERCA酶的表达量将制备好的骨骼肌匀浆根据试剂盒要求进行相应操作，并在反应终止5 min内用酶标仪在450 nm波长下，进行吸光度检测，记录吸光度值。计算标准品和样本的平均吸光度值，用标准曲线计算肿瘤坏死因子α、白细胞介素6以及SERCA的表达水平。
1.5.4 Ca2+浓度检测将腓肠肌组织切成细小碎片，用裂解液裂解组织，4 ℃ 14 000×g离心5 min，取上清液。稀释标准品，设置2个重复孔，96孔板中加入50 μL标准品或样品，每孔加入150 μL检测工作液，避光孵育10 min后，立即用酶标仪在575 nm的波长下，进行吸光度检测，制作标准曲线，计算每个测试孔中的钙含量，按照C=(A×n/V)/40的计算公式计算钙浓度，其中A为根据标准曲线确定的钙含量，n为样品稀释倍数，V为样品体积，40为钙的相对原子质量。
1.5.5 骨骼肌细胞凋亡检测根据 TUNEL 检测试剂盒，将标本常规切片，按照试剂盒说明书操作，DAB 显色，苏木精轻度复染，蒸馏水清洗、脱水、透明、封固。细胞核中有棕色颗粒者为 TUNEL 阳性细胞，即凋亡细胞。通过Image J 图像分析凋亡细胞和正常细胞数目，计算细胞凋亡率。
1.6 统计学分析采用SPSS 23.0软件进行统计分析，GraphPad Prism 8进行制图。数据符合正态分布且方差齐，采用t检验或单因素方差分析，方差不齐采用非参数检验；不符合正态分布的资料，组间比较采用秩和检验。P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

骨骼肌急性钝挫伤在中医中被称为“筋伤”，其病因较复杂，包括内因和外因，但病机总属“气滞血瘀”[23]。推拿自古以来就以其通筋调络、理气活血的功效，广泛应用于“筋伤”类疾病的治疗。如向勇等[24]发现，柔筋温通手法治疗慢性软组织损伤的疗效显著；彭春平等[25]发现，推拿手法可有效治疗划船运动员的扭挫伤。推拿作为祖国传统医学重要分支之一，其发展必然离不开中医传统理论的支撑。骨骼肌损伤发生后，会出现一系列病理变化如软组织结构破坏、皮下血管破裂，导致血溢脉外，出现了中医理论中的离经之血，离经之血聚集而成瘀血，通过激发“脾主统血”的功能，增强其对于血液的固摄作用，从而减少“气滞血瘀”的程度[26-27]。
此外，“脾主肌肉”理论认为，脾为后天之本，肌肉骨骼生长发育以及生理功能的维持皆有赖于脾输送的水谷精微[28]。因此，作者所在团队推测“从脾论治”具有促进骨骼肌修复的可能性。而阴陵泉在现代临床中虽常见于腹胀、腹泻、小便不利等内科疾病的治疗，但《动功按摩秘诀·腰肾足膝症》有云：“设有筋痛，可于阴陵泉穴掐五、七十度，擦五、七十度，兼静功。”且《针灸大成》中也记载阴陵泉穴可用以治疗四肢疾病，如《卷八·手足腰腋门》的“足麻痹”[29-30]。现代医家也常将其用于骨骼肌损伤类疾病的治疗，如肖祖伟等[31]
发现围刺阴陵泉穴可有效治疗鹅足区运动损伤；常新斗[32]发现针刺阴陵泉穴+拨穴通络推拿手法治疗肩周炎效果显著，故此次研究选取“阴陵泉”穴作为主要干预部位。
CatWalk是一种用高速摄像头捕捉大鼠步态，并生成一系列客观可视化参数来反映大鼠运动情况的检测装置，其中摆动速度和支撑时相可作为大鼠运动协调性评价的敏感指标[33]。大鼠的步态状况受疼痛、痉挛以及关节活动度等因素影响，当大鼠患侧肢体损伤，为平衡肢体健侧肢体往往代偿运动，导致其摆动速度变慢以及支撑时相变短。结合此次研究结果，模型组大鼠的摆动速度和支撑时相显著下降，说明急性骨骼肌钝挫伤可导致肢体运动能力下降。而点按干预后，点按非穴组与点按穴位组患肢支撑时相显著性增加，其原因可能为点按本身具有的功效，而点按穴位组患肢支撑时相显著优于点按非穴组，其原因可能为“阴陵泉”穴除了点按的一般效应外，还发挥“脾主肌肉”作用，更有利于骨骼肌运动功能的修复。
正常骨骼肌细胞形态完整，排列整齐；当其受到强烈的机械应力时，骨骼肌肌束会发生断裂，间隙增宽，毛细血管破裂，血液中的炎症细胞和细胞因子迅速进入损伤部位，吞噬受损组织，其典型特征为红细胞聚集和炎症细胞增多[34]。当骨骼肌开始修复时，炎症细胞以及红细胞大量减少，骨骼肌细胞形态逐渐完整清晰。骨骼肌形态的改变可通过苏木精-伊红染色显示，结合此次研究结果，空白组大鼠骨骼肌细胞表现为正常的组织结构；模型组大鼠肌纤维排列不齐，组织间隙增宽，部分肌纤维出现断裂现象，且可见大量红细胞和炎症细胞的聚集，组织周围出现边界不清的状况，说明造模成功。点按非穴组和点按穴位组的肌纤维结构、炎性细胞浸润以及红细胞聚集的情况明显改善，推测其原因可能是点按促进骨骼肌修复，并且降低了组织炎症表达水平。而点按穴位组的形态学表现优于点按非穴组，则可能发挥脾经“阴陵泉”穴的特殊效应，更好地增强局部的抗炎反应并促进骨骼肌的修复。
既往骨骼肌急性钝挫伤的研究多探讨炎症反应对卫星细胞、血管内皮生长因子以及胰岛素生长因子等方面的影响[35]。但Ca2+作为第二信使，也是骨骼肌中主要的调节因子和信号分子，对骨骼肌的健康同样具有重要作用。如马闯[36]研究发现，细胞内的钙稳态与骨骼肌疲劳相关；张耀[37]研究发现，大负荷离心运动损伤与Ca2+的兴奋收缩解偶联机制相关；CHANDRA等[38]认为，Ca2+稳态失衡不利于骨骼肌修复，但具体机制尚未明确。SERCA位于肌浆网膜，是调节骨骼肌细胞中Ca2+浓度的“钙泵”，当Ca2+浓度高于阈值，其利用ATP水解产生的能量逆浓度梯度将Ca2+转运到肌浆网膜中，以维持胞质中Ca2+的稳态。SERCA的活性决定了骨骼肌细胞摄取Ca2+的能力。目前有研究发现，炎症反应与SERCA的表达关系密切，如TONG等[39]研究发现，炎症条件下，SERCA蛋白的表达降低，其mRNA的半衰期缩短；KILICKAP等[40]发现肿瘤坏死因子α下调SERCA的表达，与肌肉异常松弛密切相关。当SERCA的浓度下降，内质网摄取以及储存Ca2+的能力下降，胞浆内Ca2+浓度超过阈值时，将导致细胞内Ca2+稳态失衡。实验证明，模型组大鼠炎症因子白细胞介素6的表达显著增高，SERCA表达下降，说明钝挫伤促进炎症，并降低了SERCA的表达；而与模型组对比，点按非穴组与点按穴位组肿瘤坏死因子α、白细胞介素6的表达显著降低，SERCA表达增高，说明点按干预起到抑制炎症和维护钙稳态的作用，且点按穴位组效果更优。与点按非穴组比较，点按穴位组白细胞介素6的表达没有显著性差异，但肿瘤坏死因子α的表达显著下降，SERCA的表达显著提高，说明点按穴位组可通过降低肿瘤坏死因子α表达，从而更好地维护钙稳态。近来研究表明，Ca2+稳态失衡与细胞凋亡关系密切，骨骼肌细胞凋亡也被认为是骨骼肌损伤的重要诱因，如有研究证实“损伤血瘀证”的本质是凋亡[41-43]。因此，减少骨骼肌细胞凋亡有利于减少骨骼肌损伤，从而促进骨骼肌损伤修复。研究证实，模型组大鼠细胞内钙离子浓度和细胞凋亡数量均显著增高，说明大鼠骨骼肌钝挫伤后钙稳态失衡并导致细胞凋亡；而与模型组对比，点按非穴组与点按穴位组Ca2+浓度和细胞凋亡数量显著降低，说明点按干预起到维护钙稳态并减少细胞凋亡的作用，且点按穴位组效果更优。
结论：综上所述，点按脾经合穴可有效改善急性骨骼肌钝挫伤大鼠的运动功能与肌肉病理形态，其作用机制可能与降低炎症因子、促进钙泵功能、维持细胞内Ca2+稳态、减少细胞凋亡、从而缓解骨骼肌损伤相关。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

点按脾经合穴对急性钝挫伤大鼠骨骼肌炎症因子及钙离子稳态的影响

Effects of point-pressing of the spleen meridian on inflammatory factors and calcium homeostasis in the skeletal muscle of acute blunt contusion rats

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