紫朱醇提取物对高糖高脂诱导血管内皮细胞损伤的保护作用

doi:10.12307/2023.434

中国组织工程研究 ›› 2023, Vol. 27 ›› Issue (26): 4132-4138.doi: 10.12307/2023.434

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紫朱醇提取物对高糖高脂诱导血管内皮细胞损伤的保护作用

王莉娟1，2，柳国斌2，韩秋琴1，赵志弘1，何金晶1，2，李文惠1，2

1上海健康医学院，上海市 201318；2上海中医药大学，上海市 201203

收稿日期:2022-04-25 接受日期:2022-06-17 出版日期:2023-09-18 发布日期:2023-01-20
通讯作者: 李文惠，博士，讲师，上海健康医学院，上海市 201318；上海中医药大学，上海市 201203
作者简介:王莉娟，女，1995年生，陕西省西安市人，上海中医药大学在读硕士，主要从事中医药治疗脑病方面研究。
基金资助:
国家自然科学基金青年项目(81804096)，项目负责人：李文惠；上海健康医学院师资人才百人库国内访学项目
(A3-0200-21-311007-12)，项目负责人：李文惠

Protective effect of ethanol extract of Zizhu on vascular endothelial cell injury induced by high glucose and high lipids

Wang Lijuan1, 2, Liu Guobin2, Han Qiuqin1, Zhao Zhihong1, He Jinjing1, 2, Li Wenhui1, 2

1Shanghai University of Medicine & Health Sciences, Shanghai 201318, China; 2Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China

Received:2022-04-25 Accepted:2022-06-17 Online:2023-09-18 Published:2023-01-20
Contact: Li Wenhui, MD, Lecturer, Shanghai University of Medicine & Health Sciences, Shanghai 201318, China; Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China
About author:Wang Lijuan, Master candidate, Shanghai University of Medicine & Health Sciences, Shanghai 201318, China; Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China (Youth Project), No. 81804096 (to LWH); Teacher Talent Bank Domestic Visiting Project of Shanghai University of Medicine & Health Sciences, No. A3-0200-21-311007-12 (to LWH)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

紫朱醇提取物：紫朱软膏(专利号 ZL201010186284.X)是已故上海市名中医奚九一教授名方，经临床应用有较好疗效，相关研究成果获得 2018 年中华中医药科学技术一等奖。紫朱软膏由黄芪、紫草、朱砂、龙血竭、阿胶、冰片6味中药组成，有清热解毒、祛腐生肌、补气益血的功效。紫朱醇提取物则是紫朱软膏按一定药物比例浓缩提纯而来。前期临床和动物研究已证实紫朱软膏对糖尿病溃疡具有促进血管生成和抑制炎症的作用。
血管生成：是指在原有血管的基础上长出新的血管，是机体生长发育等生理过程中必经阶段。血管生成的机制十分复杂，受到生长因子、细胞内信号和细胞外成分的动态调节，其中VEGF、Ang-2、SPRED1、PIK3R2等是目前研究最为广泛的调控血管生成的因子。

背景：紫朱软膏由黄芪、紫草、朱砂、龙血竭、阿胶、冰片6味中药组成，有清热解毒、祛腐生肌、补气益血的功效。前期临床和动物实验已证实其在糖尿病溃疡愈合过程中发挥抑制炎症、促进血管生成的作用。
目的：在细胞水平上探究紫朱醇提取物对高糖高脂诱导小鼠脑微血管内皮细胞(bEnd.3细胞)损伤的保护作用，并研究其对血管生成的影响。
方法：模拟高糖高脂环境，采用不同质量浓度的葡萄糖和棕榈酸诱导bEnd.3细胞损伤，给予不同质量浓度的紫朱醇提取物干预，用CCK-8法筛选出最合适的刺激物质量浓度和最佳给药质量浓度；然后通过划痕实验、血管生成实验观察紫朱醇提取物对bEnd.3细胞促血管生成的影响，采用AnnexinV/PI 凋亡试剂盒检测bEnd.3细胞凋亡率，采用Western blot和qRT-PCR法检测bEnd.3细胞中VEGFA、Ang-2、SPRED1、PIK3R2的蛋白和mRNA表达水平。

结果与结论：①经CCK-8法检测细胞活力，最终选定25 mmol/L葡萄糖+200 μmol/L棕榈酸作用24 h作为模型组，500 mg/L紫朱醇提取物作用24 h作为紫朱醇提取物组给药方式；②与正常对照组相比，模型组bEnd.3细胞迁移和生成血管能力下降(P < 0.001，P < 0.05)，bEnd.3细胞凋亡率上升(P < 0.001)，VEGFA、Ang-2 mRNA和蛋白表达显著降低(P < 0.001)，SPRED1、PIK3R2 mRNA和蛋白表达显著增加(P < 0.001)；③与模型组相比，紫朱醇提取物组bEnd.3细胞迁移和血管生成能力上升(P < 0.05)，bEnd.3细胞凋亡率显著下降(P < 0.001)，VEGFA、Ang-2 mRNA和蛋白表达显著增加(P < 0.001)，SPRED1、PIK3R2 mRNA和蛋白表达显著降低(P < 0.001，P < 0.05)；④结果表明，紫朱醇提取物对高糖高脂诱导的bEnd.3细胞具有保护作用，能够促进细胞迁移和血管生成并减少细胞凋亡。

https://orcid.org/0000-0001-8087-5656 (李文惠)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 紫朱醇提取物, 高糖高脂, 小鼠脑微血管内皮细胞, 血管生成, 血管内皮生长因子

Abstract: BACKGROUND: Zizhu ointment is composed of Astragali Radix, Radix Arnebiae seu Lithospermi, Cinnabar, Resina Dracoins, Ejiao and Borneol, which has the effects of clearing heat and detoxifying, removing saprophyxia and strengthening muscles, invigorating qi and benefiting blood. Previous clinical and animal experiments have shown that it can inhibit inflammation and promote angiogenesis in the healing process of diabetic ulcer.
OBJECTIVE: To investigate the protective effect of ethanol extract of Zizhu on the injury of rat brain microvascular endothelial cells (bEend.3 cells) induced by high glucose and high lipids at the cellular level, and to study its effect on angiogenesis.
METHODS: bEnd.3 cells were induced with glucose and palmitic acid at different concentrations, and treated with different concentrations of ethanol extract of Zizhu. The optimum concentrations for modeling and administration were identified by cell counting kit-8 method. The effect of ethanol extract of Zizhu on angiogenesis of bEnd.3 cells was observed by scratch test and angiogenesis test. AnnexinV/PI apoptosis detection kit was used to detect the apoptosis rate of bEnd.3 cells under fluorescence microscope. The protein and mRNA expression levels of VEGFA, Ang-2, SPRED1, and PIK3R2 in bEnd.3 cells were determined by western blot and qRT-PCR, respectively.
RESULTS AND CONCLUSION: Cell viability was detected by cell counting kit-8 method. 25 mmol/L glucose+200 μmol/L palmitic acid for 24 hours was selected as the model group; treatment with ethanol extract of Zizhu 500 mg/L for 24 hours was performed as the way of administration in the ethanol extract of Zizhu group. Compared with the normal group, bEnd.3 cell migration and angiogenesis were decreased in the model group (P < 0.001, P < 0.05), bEnd.3 cell apoptosis rate was increased (P < 0.001), the mRNA and protein expressions of VEGFA and Ang-2 were significantly decreased (P < 0.001), and the mRNA and protein expressions of SPRED1 and PIK3R2 were significantly increased (P < 0.001). Compared with the model group, in the ethanol extract of Zizhu group, cell migration and angiogenesis of bEnd.3 cells were significantly increased (P < 0.05), bEnd.3 cell apoptosis rate was significantly decreased (P < 0.001), mRNA and protein expressions of VEGFA and Ang-2 were significantly up-regulated (P < 0.001), mRNA and protein expressions of SPRED1 and PIK3R2 were significantly down-regulated (P < 0.001, P < 0.05). All the experimental results show that the ethanol extract of Zizhu can protect bEnd.3 cells induced by high glucose and high lipid, promote cell migration and angiogenesis, and reduce cell apoptosis.

Key words: ethanol extract of Zizhu, high glucose and high lipid, mouse brain microvascular endothelial cell, angiogenesis, vascular endothelial growth factor

中图分类号:

王莉娟, 柳国斌, 韩秋琴, 赵志弘, 何金晶, 李文惠. 紫朱醇提取物对高糖高脂诱导血管内皮细胞损伤的保护作用[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(26): 4132-4138.

Wang Lijuan, Liu Guobin, Han Qiuqin, Zhao Zhihong, He Jinjing, Li Wenhui. Protective effect of ethanol extract of Zizhu on vascular endothelial cell injury induced by high glucose and high lipids[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2023, 27(26): 4132-4138.

图/表（结果） 8

2.1 CCK-8法检测高糖高脂对bEnd.3细胞生长的影响 CCK-8检测发现，与正常对照组相比，正常糖浓度组的细胞存活率略有升高，高糖组和高糖高脂组对细胞有损伤，不利于细胞生长。根据细胞存活率确定造模方式为25 mmol/L葡萄糖+200 μmol/L棕榈酸作用24 h进行后续实验，见图1A。
2.2 紫朱醇提取物最佳干预方式的筛选 CCK-8检测发现，bEnd.3细胞存活率与药物质量浓度存在显著相关，药物质量浓度越高，毒性越高。根据bEnd.3细胞存活率确定给药质量浓度为500 mg/L作用24 h进行后期实验，见图1B。

2.3 紫朱醇提取物对bEnd.3细胞划痕愈合的影响高糖高脂处理会抑制bEnd.3细胞迁移，细胞死亡数随着造模时间增长而增多，迁移能力越来越低，24 h后正常对照组与模型组比较，细胞迁移能力由(71.2±0.02)%下降至(43.3±0.01)%(P < 0.001)，而紫朱醇提取物组的细胞迁移能力有明显升高，为(56.7±0.1)%(P < 0.05)，可见紫朱醇提取物可以促进bEnd.3细胞迁移，见图2，3。

2.4 紫朱醇提取物对bEnd.3细胞血管生成的影响血管生成实验是对血管内皮细胞的功能性评价，可以反映bEnd.3细胞在体外形成血管环的能力，与正常对照组相比，模型组小管数目减少，结构疏松，表明高糖高脂能抑制bEnd.3细胞的体外小管形成(P < 0.05)。与模型组相比，紫朱醇提取物组成管数显著增加(P < 0.05)，见图4，5。

2.5 紫朱醇提取物对bEnd.3细胞凋亡的影响在荧光显微镜下观察，Annexin V-FITC为绿色荧光，PI为红色荧光。凋亡细胞仅用绿色荧光染色，坏死细胞用绿色和红色荧光染色，正常细胞不用荧光染色。正常对照组、模型组、紫朱醇提取物组bEnd.3细胞凋亡率比较，差异有显著性意义。与正常对照组相比，模型组bEnd.3细胞凋亡率上升(P < 0.001)；与模型组相比，紫朱醇提取物组bEnd.3细胞凋亡率显著下降
(P < 0.001)，见图6。

2.6 紫朱醇提取物对bEnd.3细胞相关mRNA表达的影响与正常对照组相比，模型组VEGFA、Ang-2 mRNA表达显著减少(P < 0.001)，SPRED1、PIK3R2 mRNA 表达显著增加(P < 0.001)；与模型组相比，紫朱醇提取物干预后，VEGFA、Ang-2 mRNA表达显著增加(P < 0.001)，SPRED1、PIK3R2 mRNA 表达显著减少(P < 0.001)，见图7。

2.7 紫朱醇提取物对bEnd.3细胞相关蛋白表达的影响与正常对照组相比，模型组VEGFA、Ang-2的蛋白表达显著下降(P < 0.001)，SPRED1、PIK3R2的蛋白表达显著上升(P < 0.001)；与模型组相比，紫朱醇提取物干预后，VEGFA、Ang-2的蛋白表达显著上升(P < 0.001)，SPRED1、PIK3R2的蛋白表达下降(P < 0.05，P < 0.001)，见图8。

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引言

糖尿病是一种全身代谢紊乱的疾病，有资料表明全世界目前有4.2亿的人口都患有糖尿病，2040年这一数字将达到6.4亿，糖尿病给无数患者和家庭带来了巨大的经济和心理负担[1]。糖尿病溃疡是糖尿病最严重的并发症之一[2-3]，因其反复发作，导致创面难以正常愈合。在创面愈合过程中，损伤部位的新生血管减少，导致皮肤愈合过程中营养物质的缺乏，是糖尿病创面无法愈合的主要原因[4-5]。其中，血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和血管生成素2(AngiotensinⅡ，Ang-2)在血管生成过程中起到非常重要的作用[6]。既往研究表明，VEGF可以通过激活一系列通路，完成血管的重构，而SPRED1和PIK3R2作为负调节因子，起到抑制血管生成的作用[7]。目前已有一些新的治疗方法用于治疗糖尿病溃疡，例如生长因子治疗、干细胞治疗、基因治疗等[8-9]，但是这些方法对血管内皮细胞都有一定损伤，并不适用于临床上大多数患者。中医药作为传统的治疗手段，在治疗糖尿病溃疡方面独具特色[10-11]。近年来许多研究表明中医药可以明显促进新生血管的生长与成熟，加快创面的血液循环，有效促进创面的愈合[12-13]。
紫朱软膏是上海中医药大学附属曙光医院中医血管外科通过长期临床实践总结的治疗糖尿病溃疡的经验方[14]，由朱砂、紫草、黄芪、血竭、阿胶、冰片6味中药组成。全方以朱砂、紫草为君药，朱砂具有解毒生肌的功效，现代药理学研究表明朱砂外用能抑制皮肤细菌的生长[15]；紫草具有活血凉血的功效，用于治疗热血壅盛的疮疡、湿疹，现代药理学认为其具有抗炎、解热、抗病原微生物等作用[16]。黄芪味甘性微温，为补气生肌之要药，阿胶为补血滋阴之品，血竭为治疮疡久溃不敛之要药，三者共为臣药，发挥补血生肌之功效。一味冰片为佐药，清热解毒之品。全方六药，共奏清热解毒、祛腐生肌、补气益血之功。通过前期众多临床和动物研究发现紫朱软膏可以促进创面愈合，治疗糖尿病溃疡[17-18]。韩强等[19-20]研究表明紫朱软膏可以降低溃疡创面的炎症反应，增加创面血管内皮生长因子的表达，促进血管新生。但其研究对紫朱软膏如何促进糖尿病状态下血管生成的影响机制未阐述清楚，故该研究采用高糖高脂刺激bEnd.3细胞模拟糖尿病血管损伤模型，探究紫朱醇提取物对血管生成的影响及其可能的作用机制。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计体外细胞学实验，多组间比较采用单因素方差分析。
1.2 时间及地点实验于2021年9月至2022年1月在上海健康医学院协同科研中心实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 细胞 bEnd.3细胞是一种人工培养的、具有脑微血管内皮细胞特性的细胞株。bEnd.3细胞(BNCC337672)购自北纳生物技术有限公司。
1.3.2 药物紫朱醇提取物：取中药朱砂350 g、紫草150 g、龙血竭300 g、黄芪150 g、阿胶250 g及冰片50 g，加入10倍体积分数为80%乙醇浸润24 h后，武火加热至沸腾，改文火加热1 h，连接回流提取装置后抽滤2 h，滤液保存于烧杯。重复第2次，药物残渣继续加入10倍体积的体积分数80%乙醇浸泡过夜后，同前处理。合并所有滤液，于旋转蒸发仪浓缩至无醇味，得到紫朱醇提取物。冷藏避光保存，使用时用0.22 μm微孔滤膜过滤除菌备用。
1.3.3 试剂葡萄糖和棕榈酸(Sigma，美国)；DMEM高糖培养液、胎牛血清(美国Gibco公司)；磷酸盐缓冲液(PBS)(美国Gibco公司)；CCK-8细胞毒性检测试剂盒(江苏凯基生物有限公司)；SDS-PAGE凝胶制备试剂盒；0.25%胰蛋白酶(碧云天生物科技有限公司)；AnnexinV/PI凋亡检测试剂盒(瑞士Roche 公司)；一抗SPRED1、PIK3R2、β-actin等(Abcam公司)；抗小鼠二抗(上海翊圣生物科技有限公司)；反转录试剂盒(Takara日本)；SYBR Green实时荧光定量PCR试剂盒(日本Takara公司)；显影液(上海冠龙照相器材公司)；BCA蛋白含量检测试剂盒(江苏凯基生物有限公司)等。
1.3.4 仪器酶标仪(Thermo公司)；荧光定量PCR仪(Applied Biosystems 公司)；DM2500 荧光显微镜(德国徕卡显微系统)；二氧化碳恒温培养箱(美国Thermo公司)；高速低温台式离心机(德国Eppendorf公司)；精密天平仪(浙江凯丰集团有限公司)；电热恒温水浴锅(上海博迅实业有限公司)；96孔细胞培养板、细胞培养皿(Corning公司)等。
1.4 方法
1.4.1 细胞培养小鼠脑微血管内皮细胞bEnd.3细胞培养于DMEM完全培养基(含体积分数为10%胎牛血清，100 mg/L青霉素+100 mg/L链霉素)，置于37 ℃、体积分数为5%CO2细胞恒温培养箱中，每天观察细胞生长状态，隔日更换培养液。显微镜下观察细胞汇合达到80%-90%时，按照1∶2或1∶4进行传代，并取对数生长期细胞进行实验。
1.4.2 高糖高脂对bEnd.3细胞损伤的浓度筛选利用葡萄糖及棕榈酸模拟高糖高脂环境，将棕榈酸溶解于NaOH-BSA复合溶液中，以溶剂作为溶剂对照(S)。常规培养bEnd.3细胞，隔天换培养液，培养细胞至三四代。取第3代对数生长期bEnd.3细胞接种于12孔板，每孔1 mL，约2×104个细胞，放到37 ℃、体积分数为5%CO2培养箱中培养。当细胞达到理想的汇合度70%-90%后，进行以下分组：①正常对照组(普通培养基，CON)；②正常糖浓度组(5.5 mmol/L葡萄糖，NG)；③高糖组(25 mmol/L葡萄糖，HG)；④高糖溶剂组(25 mmol/L葡萄糖+溶剂S，HG+S)；⑤高糖高脂组(25 mmol/L葡萄糖+200，400，600 μmol/L棕榈酸，HG+PA200，400，600)；分别处理12，24，48 h后，加入100 μL CCK-8，放入培养箱孵育2 h，移入96孔板中，每组6个复孔，通过酶标仪在450 nm条件下测试吸光度并计算细胞存活率，根据结果确定最佳造模方式。
1.4.3 CCK-8法观察紫朱醇提取物对bEnd.3细胞存活率的影响 bEnd.3细胞在10 cm培养皿中培养，隔天换液，按照1∶2或1∶4进行传代，培养至第3代，取对数生长期的细胞，接种于96孔板，每孔100 μL，约2 000个细胞，放到37 ℃、体积分数为5%CO2培养箱中培养，24 h后开始给药干预。以紫朱醇提取物终质量浓度为0，50，100，200，500，1 000 mg/L作用于bEnd.3细胞，每组6个复孔，通过CCK-8法检测药物作用12，24，48 h的细胞存活率，确定最佳中药复方干预质量浓度和干预时间。
1.4.4 创伤愈合实验(划痕实验) bEnd.3细胞常规培养至第3代，取对数生长期的细胞进行实验。细胞计数后接入6孔板，并在6孔板背面中线处用Marker笔均匀划线。细胞贴壁后分3组：正常对照组(无处理，BC)，模型组(25 mmol/L葡萄糖+ 200 μmol/L棕榈酸，BM)，紫朱醇提取物组(25 mmol/L葡萄糖+ 200 μmol/L棕榈酸+500 mg/L紫朱醇提取物，BZ)，放到37 ℃、体积分数为5%CO2培养箱中培养。24 h后选择无弯曲、孔径一致、尖头无缺损的200 μL枪头垂直于孔板沿着划线处制造细胞划痕，尽量保证各个划痕宽度一致。吸去细胞培养液，用PBS冲洗孔板3次，洗去划痕产生的细胞碎片，加入无血清DMEM培养基，拍照记录，培养箱内培养约24 h再次拍照，计算划痕愈合率以评价细胞迁移修复过程。划痕愈合率(%)=(初始划痕宽度-24 h划痕宽度)/初始划痕宽度×100%。
1.4.5 血管生成实验准备基质胶和实验用品放入4 ℃冰箱，过夜缓慢融化基质胶。常规培养第3代bEnd.3细胞在10 cm培养皿中，取对数生长期的细胞平铺在6孔板中，每孔1 mL培养基，细胞密度5×104个/孔；第2天分组给药干预，分为正常对照组、模型组(25 mmol/L葡萄糖+200 μmol/L棕榈酸)、紫朱醇提取物组(25 mmol/L葡萄糖+200 μmol/L棕榈酸+500 mg/L紫朱醇提取物)，放置培养箱中培养24 h；第3天，在预冷的96孔板中，每孔加入50 μL融化的Matrigel 基质胶溶液，注意枪头垂直于孔的正上方，37 ℃培养40 min，等待胶凝固，然后每孔加入上述分组处理的bEnd.3细胞于凝胶上，注意保持枪头垂直在孔上方，不要接触孔下方的凝胶，在37 ℃、体积分数为5% CO2培养箱中继续培养24 h，观察成管情况并拍照。
1.4.6 细胞凋亡检测常规培养第3代bEnd.3细胞，取对数生长期的细胞种植在6孔板中，细胞密度为5×104个/孔，将细胞分为正常对照组、模型组(25 mmol/L葡萄糖+200 μmol/L棕榈酸)、紫朱醇提取物组(葡萄糖25 mmol/L+200 μmol/L棕榈酸+500 mg/L紫朱醇提取物)，放置培养箱中培养24 h，胰酶消化细胞，轻轻吹打收集细胞，1 000×g离心5 min，用PBS重悬并计数。取1×105个的细胞，加入100 μL 1×Binding Buffer重悬细胞，加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI染色液，轻轻混匀，避光、室温反应10 min，加入400 μL 1×Binding Buffer，混匀后，放置冰上。滴1滴用Annexin V-FITC/PI双染的细胞悬液于载玻片上，并用盖玻片盖上细胞，然后在荧光显微镜下观察图像。

1.4.7 qRT-PCR 常规培养第3代bEnd.3细胞，取对数生长期的细胞以1×105个/孔接种于6孔板中，放置于37 ℃、体积分数为5%CO2培养箱中培养。24 h后，分为正常对照组、模型组(25 mmol/L葡萄糖+200 μmol/L棕榈酸)、紫朱醇提取物组(25 mmol/L葡萄糖+200 μmol/L棕榈酸+500 mg/L紫朱醇提取物)，分组给药后放置培养箱中，24 h后在6孔板中加入TRIzol试剂使细胞充分裂解，收集细胞裂解液转移至无菌的EP管中，加入TRIzol 1/5体积的氯仿，剧烈振荡，室温放置5 min后4 ℃下12 000 r/min离心15 min，取上层清液于另一套EP管中，加入TRIzol 1/2体积的异丙醇，均匀放置室温10 min后4 ℃下12 000 r/min离心10 min，再加入2次提前预冷的体积分数为75%乙醇1 mL，最后将其融入到DEPC水中，测RNA浓度。用反转录试剂盒将其变为cDNA，用DEPC水稀释5倍或10倍，然后使用SYBR Green PCR试剂盒，加入合成的PCR引物，对VEGFA、Ang-2、SPRED1、PIK3R2的基因序列进行RT-PCR扩增。使用 β-actin mRNA作为内部对照标准化数据，引物序列由擎科生物公司合成，见表1。

1.4.8 蛋白质印迹法(Western blot) 常规培养第3代bEnd.3细胞，取对数生长期的细胞以1×105个/孔接种于6孔板中，放置于37 ℃、体积分数为5%CO2培养箱中培养。24 h后，分为正常对照组、模型组(25 mmol/L葡萄糖+200 μmol/L棕榈酸)、紫朱醇提取物组(25 mmol/L葡萄糖+200 μmol/L棕榈酸+500 mg/L紫朱醇提取物)，分组给药后放置培养箱中。24 h后收集细胞，在高速冷冻离心机上(3 000 r/min，5 min，4 ℃)离心，加入100 μL裂解液，在冰上反复吹打，使细胞充分裂解；BCA法测蛋白浓度，使用SDS-PAGE进行电泳，分离蛋白；随后进行转膜，转膜完成后用TBST洗1次后加入含有5%脱脂奶粉的封闭液，在4 ℃、60 r/min的低温摇床上封闭40 min；封闭结束后，用TBST洗3次，加入VEGFA、Ang-2、SPRED1、PIK3R2及β-actin(1∶2 000)一抗，在低温摇床上4 ℃、60 r/min过夜孵育，TBST洗3次，加入二抗孵育45 min，TBST洗3次后，用显影剂进行显影，采用Image J 软件分析条带灰度值。
1.5 主要观察指标 ①高糖高脂对bEnd.3细胞增殖的影响；②紫朱醇提取物对bEnd.3细胞存活率的影响；③紫朱醇提取物对高糖高脂诱导损伤bEnd.3细胞迁移和血管生成的影响；④紫朱醇提取物对高糖高脂诱导损伤bEnd.3细胞凋亡的影响；⑤紫朱醇提取物对高糖高脂诱导损伤bEnd.3细胞VEGFA、Ang-2、SPRED1、PIK3R2 mRNA转录的影响；⑥紫朱醇提取物对高糖高脂诱导损伤bEnd.3细胞VEGFA、Ang-2、SPRED1、PIK3R2蛋白表达的影响。
1.6 统计学分析所有数据运用SPSS 22.0软件进行统计分析，均用x±s表示，两组之间比较采用两独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，P < 0.05为差异有显著性意义，采用Graph Pad Prism 7.0进行作图。文章统计学方法已经通过上海健康医学院统计学专家审核。

讨论

糖尿病溃疡作为糖尿病众多并发症之一，因其反复发作，常给患者带来身心痛苦。糖尿病状态下的微血管会发生缺氧、缺血、炎症、血管血流减少、局部血管生成减少等病理变化，致使糖尿病溃疡无法愈合[21]。研究表明，血脂高低与糖尿病血管病变的发生发展及预后有明显的关系[22-23]。目前，仍没有较好的解决方法治疗糖尿病溃疡。研究表明，中药具有促进创面愈合、抗炎等作用[24]，其中中药复方更是发挥了巨大优势，相比单方其可以降低毒副作用[25]。紫朱软膏是以奚九一教授“补虚祛瘀生肌法”所制成的外用膏剂，已有研究表明其可以促进糖尿病溃疡的愈合，但其作用机制还不清楚[26-27]。故该研究将高糖高脂作用于bEnd.3细胞模拟糖尿病血管受损的环境，探索紫朱醇提取物对血管生成的影响及可能机制。
在皮肤溃疡愈合过程中，血管生成非常重要。血管生成是指血管内皮细胞经过血流流动到远处，长出新的血管，是细胞生长、迁移的基础。该研究引入了经典的划痕实验评价细胞迁移的速度，与正常对照组相比，高糖高脂作用下bEnd.3细胞的迁移速率明显下降，而紫朱醇提取物组可以在一定程度上减弱下降程度。另外，通过血管生成实验发现高糖高脂作用下bEnd.3细胞在基质胶中迁移的能力明显受到抑制，成管数量减少，而紫朱醇提取物干预后，可以促进bEnd.3细胞迁移，从而有效增加成管数量。
血管生成的机制十分复杂，其中VEGF、Ang-2、SPRED1、PIK3R2等是目前研究最为广泛的调节因子。VEGF被认为是最有效的促血管生成因子，通过促进内皮细胞的增殖、迁移，刺激血管的生成[28]。VEGFA是VEGF家族核心成员，通常VEGF即VEGFA。研究表明VEGFA是一种二聚糖蛋白，可有效促进血管内皮细胞增殖、迁移。在血管形成过程中，血管内皮细胞和周细胞的相互作用也是非常重要的，在二者共同的作用下分泌Ang-2，其可以促进血管的成熟和重构[29]。研究表明VEGFA与Ang-2对于血管的调节起协同作用[30]。紫朱醇提取物上调VEGFA、Ang-2 mRNA表达，可能是通过激活VEGF通路促进血管内皮细胞和周细胞之间的联系而发挥作用，从而增加血管生成。
VEGF也可以与受体结合而发挥促进血管生成的作用。VEGF与受体结合后，受体本身发生二聚化和磷酸化，激活PI3K，进一步使Akt磷酸化，从而激活PI3K/Akt通路[31]。PI3K/Akt是细胞内重要的信号通路，一方面可以促进内皮细胞增殖、迁移，与血管生成过程密切相关，另一方面可以调控相关凋亡蛋白，抑制细胞的凋亡[32]。研究表明，PIK3R2是PI3K/Akt信号通路的负调节因子，抑制PI3K/Akt的功能，发挥抗血管生成的作用[33]。在该研究中，采用 Annexin V-FITC /PI试剂盒对bEnd.3细胞进行凋亡检测，结果显示紫朱醇提取物组bEnd.3细胞凋亡率显著下降，说明紫朱醇提取物组在一定程度上保护血管内皮细胞受损，抑制细胞凋亡，这可能与PI3K/Akt通路的激活有关。此外，紫朱醇提取物干预后，PIK3R2 mRNA 表达显著下降，在蛋白表达上也得到了一致的结论。下调PIK3R2的表达可以促进血管生成，说明紫朱醇提取物可能是通过激活PI3K/Akt信号通路来发挥促血管生成的作用。
SPRED1在调控血管内皮细胞增殖和迁移方面起到重要作用。SPRED1是Ras/MAP激酶信号通路的细胞内抑制剂，对血管内皮细胞的增殖和迁移起到抑制作用。既往研究表明，Ras/MAP信号通路可以促进血管新生并提高血管结构的完整性[34]。因此，有研究者想要通过调控Ras/MAP信号通路的负调控因子SPRED1，来促进血管的新生。该实验结果表明，紫朱醇提取物可以通过降低SPRED1 mRNA和蛋白的表达量，促进血管生成，从而加速血管修复的过程。
综上所述，紫朱醇提取物能够保护高糖高脂诱导bEnd.3细胞的血管损伤，诱导血管内皮细胞的增殖、迁移，加快血管的生成。同时，紫朱醇提取物也可以通过对VEGF、Ang-2、SPRED1、PIK3R2的mRNA和蛋白表达调控血管生成过程。但实验还存在不足之处，其一：紫朱醇提取物下调PIK3R2蛋白表达量，发挥促进血管生成的作用机制可能与激活PI3K/Akt信号通路有关，但其通路较复杂，涉及多个蛋白，需要后续进一步证实；其二，紫朱软膏是中药复方，其机制仍不清楚，需要后续进一步探索其作用成分，以期给临床提供新的治疗思路。未来将会进一步研究，为紫朱软膏的临床应用提供更多的理论基础。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

紫朱醇提取物对高糖高脂诱导血管内皮细胞损伤的保护作用

Protective effect of ethanol extract of Zizhu on vascular endothelial cell injury induced by high glucose and high lipids

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