浓缩生长因子与生物陶瓷材料iRoot  BP 体外对人牙髓细胞存活、
增殖和矿化的影响

doi:10.12307/2022.645

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (21): 3363-3368.doi: 10.12307/2022.645

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浓缩生长因子与生物陶瓷材料iRoot BP 体外对人牙髓细胞存活、增殖和矿化的影响

严崎方，谢翠柳，鄢国伟

西南医科大学口颌面修复重建与再生实验室，西南医科大学附属口腔医院牙体牙髓科，四川省泸州市 646000

收稿日期:2021-05-20 接受日期:2021-07-10 出版日期:2022-07-28 发布日期:2022-01-27
通讯作者: 鄢国伟，医师，西南医科大学口颌面修复重建与再生实验室，西南医科大学附属口腔医院牙体牙髓科，四川省泸州市 646000
作者简介:严崎方，女，1992年生，四川省泸州市人，汉族，硕士，主要从事牙体牙髓及根尖周疾病研究。

Effect of concentrated growth factor and bioceramic material iRoot BP on survival, proliferation and mineralization of human dental pulp cells in vitro

Yan Qifang, Xie Cuiliu, Yan Guowei

Oral & Maxillofacial Reconstruction and Regeneration Laboratory, Southwest Medical University, Department of Endodontics, The Affiliated Stomatology Hospital of Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China

Received:2021-05-20 Accepted:2021-07-10 Online:2022-07-28 Published:2022-01-27
Contact: Yan Guowei, Physician, Oral & Maxillofacial Reconstruction and Regeneration Laboratory, Southwest Medical University, Department of Endodontics, The Affiliated Stomatology Hospital of Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China
About author:Yan Qifang, Master, Oral & Maxillofacial Reconstruction and Regeneration Laboratory, Southwest Medical University, Department of Endodontics, The Affiliated Stomatology Hospital of Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
浓缩生长因子：为SACCO等通过自体外周血制备而成的新一代血小板浓缩制品，是一种富含高浓度生长因子、纤维蛋白及白细胞的自体生物活性材料，具有良好的生物相容性，能释放大量生物活性因子，在促进组织新生、再生及血管化、抗炎、抗感染等方面发挥着积极作用。
iRoot BP：是一种能诱导骨组织再生、促进生物矿化和牙髓牙周组织再生的新型生物活性陶瓷材料，具有极高生物相容性、生物活性及优良的抗菌性能，具有可塑性均匀膏剂和预混合单一针管输送系统，被广泛应用于根尖外科倒充填、根尖诱导成形术、根吸收及根管侧穿修补等。

背景：浓缩生长因子富含多种高浓度生长因子，可以诱导牙髓细胞增殖，促进局部牙本质的修复。
目的：对比浓缩生长因子及生物陶瓷材料iRoot BP在体外对人牙髓细胞存活、增殖及矿化的作用，进而评估浓缩生长因子用作直接盖髓材料的可行性。
方法：采集健康成年人外周血，离心提取浓缩生长因子。采用改良组织块酶消化法分离培养人牙髓细胞，分别采用浓缩生长因子膜片浸提液与iRoot BP材料浸提液处理细胞，采用CCK-8法检测细胞增殖。将人牙髓细胞分别接种于浓缩生长因子膜片与iRoot BP材料表面，检测细胞的碱性磷酸酶活性、细胞周期分布、细胞凋亡与成牙相关基因表达。
结果与结论：①CCK-8检测显示，浓缩生长因子膜片浸提液组处理1，3，7 d的细胞增殖快于iRoot BP材料浸提液组(P < 0.05)；②浓缩生长因子组处理3 d的细胞碱性磷酸酶活性高于iRoot BP组(P < 0.05)，两组处理1，7 d的碱性磷酸酶活性比较差异无显著性意义(P > 0.05)；③浓缩生长因子组处理1，3，7 d的S期细胞百分比均高于iRoot BP组(P < 0.05)，处理1，3，7 d的细胞凋亡率均低于iRoot BP组(P < 0.05)；④处理第7天的qRT-PCR检测显示，浓缩生长因子组Runx2、碱性磷酸酶、牙本质涎磷蛋白、骨钙素mRNA水平均高于iRoot BP组(P < 0.05)；⑤结果表明，浓缩生长因子可促进人牙髓细胞的存活、增殖及矿化，有望作为直接盖髓材料。

https://orcid.org/0000-0002-4455-6727 (严崎方)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 血小板, 浓缩生长因子, iRoot BP, 成牙分化, 直接盖髓, 牙髓细胞, 自体生物材料, 富血小板血浆

Abstract: BACKGROUND: Concentrated growth factors are rich in a variety of high-concentration growth factors, which can induce the proliferation of dental pulp cells and promote the repair of local dentin.
OBJECTIVE: To compare the effects of concentrated growth factor and bioceramic material iRoot BP on the survival, proliferation and mineralization of human dental pulp cells in vitro, and then evaluate the feasibility of concentrated growth factor as a direct pulp capping material.
METHODS: The peripheral blood of healthy adults was collected and centrifuged to extract and concentrate growth factors. The modified tissue mass enzymatic digestion method was used to isolate and culture human dental pulp cells. The cells were treated with concentrated growth factor membrane extract and iRoot BP material extract. Cell proliferation was detected by the CCK8 assay. Human dental pulp cells were separately inoculated on the surface of the concentrated growth factor membrane and iRoot BP material to detect the alkaline phosphatase activity, cell cycle distribution, apoptosis and gene expression related to odontogenesis.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) CCK8 assay showed that cell proliferation of the concentrated growth factor patch extract group was faster than that of the iRoot BP material extract group for 1, 3, and 7 days (P < 0.05). (2) The alkaline phosphatase activity of the cells of the concentrated growth factor group treated for 3 days was higher than that of the iRoot BP group (P < 0.05), and there was no significant difference in alkaline phosphatase activity between the two treatments for 1 and 7 days (P > 0.05). (3) The percentage of S-phase cells in the concentrated growth factor group treated for 1, 3, and 7 days was higher than that in the iRoot BP group (P < 0.05), and the apoptosis rate of cells on days 1, 3, and 7 was lower than that in iRoot BP group (P < 0.05). (4) The qRT-PCR test on the 7th day of treatment showed that the mRNA levels of Runx2, alkaline phosphatase, dentin sialophosphoprotein and osteocalcin in the concentrated growth factor group were higher than those in the iRoot BP group (P < 0.05). (5) The results show that concentrated growth factors can promote the survival, proliferation and mineralization of human dental pulp cells, and it is expected to be used as a direct pulp capping material.

Key words: platelets, concentrated growth factors, iRoot BP, odontogenic differentiation, direct pulp capping, dental pulp cells, autologous biological materials, platelet-rich plasma

中图分类号:

严崎方, 谢翠柳, 鄢国伟. 浓缩生长因子与生物陶瓷材料iRoot BP 体外对人牙髓细胞存活、增殖和矿化的影响[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(21): 3363-3368.

Yan Qifang, Xie Cuiliu, Yan Guowei. Effect of concentrated growth factor and bioceramic material iRoot BP on survival, proliferation and mineralization of human dental pulp cells in vitro[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(21): 3363-3368.

图/表（结果） 10

2.1 牙髓细胞的形态在从健康恒牙中获取牙髓组织后，利用酶消化法分离培养牙髓细胞，首先为原代培养，用时5 d，倒置显微镜下观察确定组织块边缘是否有细胞排出，观察细胞形态及生长状况，了解其贴壁状态。继续进行培养，观察细胞生长情况，当生长汇合至80%时开始传代培养，此时细胞形态发生了改变，呈放射状或漩涡状排列，见图1。

2.2 牙髓细胞鉴定结果利用流式细胞仪对所培养的牙髓细胞进行检测，其中CD34、CD73、Cd90呈高表达，CD146呈弱阳性表达， CD45呈阴性表达，见图2。

2.3 细胞增殖检测结果随着培养时间的延长，两组细胞增殖数量增加，其中浓缩生长因子浸提液组处理1，3，7 d的细胞组增殖快于iRoot BP浸提液组(P < 0.05)，见图3。

2.4 细胞碱性磷酸酶活性检测结果浓缩生长因子组处理3 d的细胞碱性磷酸酶活性高于iRoot BP组(P < 0.05)，两组处理1，7 d的碱性磷酸酶活性比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见图4。

2.5 细胞周期检测结果两组细胞周期流式细胞仪检测结果见图5；浓缩生长因子组处理1，3，7 d的S期细胞百分比均高于iRoot BP组(P < 0.05)，见图6。

2.6 细胞凋亡检测结果两组细胞凋亡流式图见图7；浓缩生长因子组处理1，3，7 d的细胞凋亡率均低于iRoot BP组(P < 0.05)，见图8。

2.7 qRT-PCR检测结果浓缩生长因子组、iRoot BP材料组的Runx2、碱性磷酸酶、牙本质涎磷蛋白、骨钙素mRNA水平均高于对照组(P < 0.05)，浓缩生长因子组Runx2、碱性磷酸酶、牙本质涎磷蛋白、骨钙素mRNA水平均高于iRoot BP材料组(P < 0.05)，见图9。

2.8 材料细胞相容性由CCK8实验与细胞凋亡检测结果可知，浓缩生长因子具有良好的细胞相容性。

参考文献

[1] ISOBE K, WATANEBE T, KAWABATA H, et al. Mechanical and degradation properties of advanced platelet-rich fibrin (A-PRF), concentrated growth factors (CGF), and platelet-poor plasma-derived fibrin (PPTF). Int J Implant Dent. 2017;3(1):17.
[2] TAKEDA Y, KATSUTOSHI K, MATSUZAKA K, et al. The Effect of Concentrated Growth Factor on Rat Bone Marrow Cells In Vitro and on Calvarial Bone Healing In Vivo. Int J Oral Maxillofac Implants. 2015; 30(5):1187-1196.
[3] RODELLA L F, FAVERO G, BONINSEGNA R, et al. Growth factors, CD34 positive cells, and fibrin network analysis in concentrated growth factors fraction. Microsc Res Tech. 2011;74(8):772-777.
[4] SHI S, BAO ZF, LIU Y, et al. Comparison of in vivo dental pulp re-sponses to capping with iRoot BP Plus and mineral trioxide aggre-gate. Int Endod J. 2016;49(2):154-160.
[5] 何飞,谭颖徽,张纲.人牙髓干细胞的体外培养和鉴定[J].华西口腔医学杂志,2005,23(1):75-78.
[6] LIU S, WANG S, DONG Y. Evaluation of a Bioceramic as a Pulp Capping Agent In Vitro and In Vivo. J Endod. 2015;41(5):652-657.
[7] 韩永战,汪平,史俊南.活髓保存治疗的生理和病理学基础―牙本质-牙髓复合体的防御和修复再生能力[J].牙体牙髓牙周病学杂志, 2006,16(11):658-661.
[8] OKAMOTO M, TAKAHASHI Y, KOMICHI S, et al. Novel evaluationmethod of dentin repair by direct pulp capping using high-resolution micro-computed tomography. Clin Oral Investig. 2018;22(8):2879-2887.
[9] 梅雪,谢俐萍,金幼虹,等.iRoot BP Plus直接盖髓后比格犬牙髓的反应性变化[J].口腔医学研究,2016,32(12):1234-1239.
[10] 吴剑波,殷丽,耿发云,等. iRoot BP、MTA封闭根管上段在年轻恒牙牙髓血运重建术中的应用价值[J]. 全科口腔医学电子杂志,2019, 6(2):126-127.
[11] MASUKI H, OKUDERA T, WATAN EB ET , et al. Growth factor and pro-inflammatory cytokine contents in platelet-rich plasma (PRP), plasma rich in growth factors (PRGF), advanced platelet-rich fibrin (A-PRF), and concentrated growth factors (CGF). Int Dent J. 2016;2(1):19.
[12] TIAN S, WANG J, DONG F, et al. Concentrated growth factor promotes dental pulp cells proliferation and mineralization and facilitates recovery of dental pulp tissue. Med Sci Monit. 2019;25:10016.
[13] HONG S, LI L, CAI W, et al. The potential application of concentrated growth factor in regenerative endodontics. Int Endod J. 2019;52(5): 646.
[14] ERAMO S, NATALI A, PINNA R, et al. Dental pulp regeneration via cell homing. Int Endod J. 2018;51(4):405-419.
[15] MASUKI H, OKUDERA T, WATANEBE T, et al. Growth factor and pro-inflammatory cytokine contents in platelet-rich plasma (PRP), plasma rich in growth factors (PRGF), advanced platelet-rich fibrin (A-PRF), and concentrated growth factors (CGF). Int Dent J. 2016;2(1):19.
[16] BONAZZA V, HAJISTILLY C, PATEL D, et al. Growth Factors Release From Concentrated Growth Factors: Effect of beta-Tricalcium Phosphate Addition. Craniofac Surg. 2018;29(8):2291-2295.
[17] 宦俊,窦磊,严崎方,等.浓缩生长因子促人脐静脉血管内皮细胞成血管化作用研究[J].华西口腔医学杂志,2018,36(3):247-251.
[18] QIAO J, AN N, OUYANG X. Quantification of growth factors in different platelet concentrates. Platelets. 2017;28(8):774-778.
[19] FAROKHI-SISAKHT F, FARHOUDI M, SADIGH-ETEGHAD S, et al. Cognitive Rehabilitation Improves Ischemic Stroke-Induced Cognitive Impairment: Role of Growth Factors. J Stroke Cerebrovasc Dis. 2019;28(10):104299.
[20] KAO CH. Use of concentrate growth factors gel or membrane in chronic wound healing: Description of 18 cases. Int Wound J. 2020;17(1):158-166.
[21] WANG SZ, CHANG Q, LU J, et al. Growth factors and platelet-rich plasma: promising biological strategies for early intervertebral disc degeneration. Int Orthop. 2015;39(5):927-934.
[22] YAN QF, DOU L, HUAN J, et al. The Effect of Concentrate Growth Factors on the Survival, Proliferation and Differentiation of Human Dental Pulp Cells. Sichuan Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban. 2018;49(5):716-719.
[23] ZHAO QM, GAO J, HUANG XX, et al. Concentrated Growth Factors Extracted from Blood Plasma Used to Repair Nasal Septal Mucosal Defect After Rhinoplasty. Aesthetic Plast Surg. 2020;44(2):511-516.
[24] CHEN J, JIANG H. A Comprehensive Review of Concentrated Growth Factors and Their Novel Applications in Facial Reconstructive and Regenerative Medicine. Aesthetic Plast Surg. 2020;44(3):1047-1057.
[25] LIN X, TANG F, JIANG S, et al. A Biomimetic Approach toward Enhancing Angiogenesis: Recombinantly Expressed Domain V of Human Perlecan Is a Bioactive Molecule That Promotes Angiogenesis and Vascularization of Implanted Biomaterials. Adv Sci (Weinh). 2020;7(17):2000900.
[26] CHEN S, GALUSKOVÁ D, KAŇKOVÁ H, et al. Electrospun PCL Fiber Mats Incorporating Multi-Targeted B and Co Co-Doped Bioactive Glass Nanoparticles for Angiogenesis. Materials (Basel). 2020;13(18):4010.
[27] MATLOUB AA, AGLAN HA, MOHAMED EL SOUDA SS, et al. Influence of bioactive sulfated polysaccharide-protein complexes on hepatocarcinogenesis, angiogenesis and immunomodulatory activities. Asian Pac J Trop Med. 2016;9(12):1200-1211.
[28] DURMULAR MC, BALLI U, DEDE FN, et al. Histological Evaluation of the Effect of Concentrated Growth Factor on Bone Healing. Craniofac Surg. 2016;27(6):1494.
[29] HUANG FM, YANG SF, ZHAO JH, et al. Platelet-rich Fibrin Increases Proliferation and Differentiation of Human Dental Pulp Cells. J Endod. 2010;36(10):1628-1632.
[30] ZHANG S, YANG X, FAN M. BioAggregate and iRoot BP Plus optimize the proliferation and mineralization ability of human dental pulp cells. Int Endo J. 2013;46(10):923-929.

引言

生物活性材料是近些年的研究热点，被许多领域所关注，由于其组织相容性较好、生物活性相对较高，因此成为了盖髓材料的首选目标。随着对血小板浓缩制品研究的逐渐深入，其生物学作用受到各界广泛关注，越来越多的功能被开发出来，应用广泛。血小板是血液重要的组成部分，一旦被激活就可能释放多种生物活性因子，发挥有效的抗炎抗感染作用，有效促进组织愈合。血小板浓缩制品具有较高的生物学活性，满足盖髓材料的要求，因此在这一领域将会有更好发展。纵观目前血小板浓缩制品，主要以如下几种为主[1]：①富血小板血浆：含有种类相对较多的高浓度生长因子，在损伤修复方面具有一定优势，但也存在一定的问题，虽然应用后可促进牙本质钙化桥形成，但相对不完整、稳定性较差，安全性难以保障，导致疗效大打折扣，目前并未得到全面肯定。②富血小板纤维蛋白：由于不存在外源性添加物的影响，因此安全性较高，不会发生免疫排斥反应，不会带来交叉感染等问题[2]。浓缩生长因子则更具有优势，由于离心程序得到优化，因此所获得的活性因子浓度更高[3]。
iRoot BP作为新型生物陶瓷材料是近些年的研究热点，应用广泛，在盖髓治疗中优势显著[4]。iRoot BP为一种膏状体，方便进行操作，操作时间较短，没有金属成分，因此使用后不易使牙体变色，适应证广泛；以糊剂应用可以起到局部抑菌的效果，达到理想的封闭性，避免固化收缩，技术敏感性较低，可操作性较强，优势较为明显，但该昂贵的价格限制了其临床应用。浓缩生长因子则不存在上述问题，由于来自自体组织，因此生物相容性较高，相对iRoot BP更易获得、也更为便捷。实验检测浓缩生长因子对人牙髓细胞存活、增殖及矿化的影响，同时设立iRoot BP对照组，探讨浓缩生长因子作为直接盖髓材料的可行性。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计材料干预细胞体外实验，组间数据比较采用t检验。
1.2 时间及地点实验于2019年5月至2020年12月在西南医科大学口颌面实验室修复重建与再生实验室完成。

1.3 材料陶瓷材料 iRoot BP的理性特性，见表1。低速台式离心机(5810R，德国)；倒置相差显微镜 (Nikon，日本)；DMEM-F12 培养基(Hyclone，美国) ；碱性磷酸酶检测试剂盒(碧云天，上海)；CCK-8 试剂盒(同仁，日本)；细胞周期试剂盒(跃亚，苏州)；细胞凋亡试剂盒(BD，美国)；Medifuge离心机(Silfradent意大利，国械备20160684号)。

1.4 实验方法
1.4.1 人牙髓细胞的分离培养选取患者因正畸治疗需要拔除的健康恒牙(供者及其家属对实验知情同意，并签署了知情同意书)，采用改良酶消化组织块法分离培养人牙髓细胞[5]。固定所选用的健康恒牙，用金刚砂钻沿釉牙骨质界剖开，完整取出牙髓，用剪刀将组织剪碎成1 mm×1 mm，加入Ⅰ型胶原酶溶液(3 g/L)消化40 min，1 000 r/min 离心5min，将上清液去除，获取下层组织，用于后续实验。准备T25培养瓶，将离心后的下层组织置于其中，放入37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中孵育。观察牙髓细胞是否从组织块中爬出，以及细胞形态和生长情况。当细胞生长达到70%-80%汇合度时按1∶3传代。
1.4.2 牙髓细胞表面标志物鉴定取第3代生长良好的牙髓细胞，胰酶消化后离心，弃上清，加入含体积分数3%胎牛血清的PBS重悬细胞，获得1×106单细胞悬液。取EP管，每管加入100 μL细胞悬液，取CD34-PE、CD45-PE、CD90-PE、CD73-PE、CD146-PE 抗体分别加入到各EP管中，孵育1 h后进行流式细胞仪检测。
1.4.3 浓缩生长因子膜片的制备采用与Medifuge离心机匹配的真空采血管抽取自愿捐赠者静脉血(供者对实验知情同意，并签署了知情同意书)，设置为变速离心，应用浓缩生长因子特定制备程序，共用时13 min完成后血液分层，其中血清层位于最上层，色淡黄；红细胞层位于底层，二者之间为浓缩生长因子纤维蛋白层。后续实验在超净工作台中完成，首先将血清层弃去，分离中间层和底层，在此过程中需要使用无菌眼科剪，在二者之间剪开，并且将水分挤压出去，需要使用无菌纱布完成，获得最终产物，即为浓缩生长因子。再次对其进行挤压，使之成膜。取培养皿，将压制成膜的浓缩生长因子铺于底部待用。
1.4.4 细胞增殖检测将100 µL DMEM培养基加入至预铺浓缩生长因子膜片、iRoot BP的孔板中，振荡24 h，制备材料浸提液。
将第3代人牙髓细胞按107 L-1的细胞浓度接种于96孔板中，100 µL/孔，待细胞贴壁后分别加入浓缩生长因子膜片、iRoot BP浸提液各100 µL，置于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中培养。培养1，3，7 d，每孔加入10 µL CCK-8液，置于培养箱中培养4 h后，用酶标仪测定450 nm处吸光度值(A450)。实验重复5次，去除最高值和最低值后再取平均值。
1.4.5 细胞碱性磷酸酶活性检测将浓缩生长因子膜片、iRoot BP预铺在6孔板底壁，将第3代人牙髓细胞按108 L-1的细胞浓度接种于6孔板内，200 µL/孔，每孔加入2 mL成骨诱导培养基培养(含体积分数10%胎牛血清、10 mmol/L甘油磷酸钠、100 mmol/L地塞米松、0.05 mmol/L 维生素C的DMEM培养基)，置于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中培养。培养1，3，7 d，将培养板取出，弃去培养液，PBS反复冲洗3次。每孔加入200 µL碱性磷酸酶裂解液，置于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中培养4-6 h，取出振动30 min，将细胞核裂解液混合液收集起来，放入酶标仪测试450 nm处吸光度值。实验平行重复5次，将所获得的结果的最高和最低值去除，余下各值取平均数，即为最终结果。
1.4.6 细胞周期检测将浓缩生长因子膜片、iRoot BP预铺在6孔板底壁，将第3代人牙髓细胞按108 L-1的细胞浓度接种于6孔板内，200 µL/孔，每孔加入 DMEM 培养基2 mL，置于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中培养。培养1，3，7 d，胰酶消化细胞，PBS洗涤2次，收集悬浮细胞，室温下避光PI染液悬浮染色30 min。300目筛网过滤细胞，获取细胞组织，利用流式细胞仪检测细胞周期，记录最终结果。
1.4.7 细胞凋亡率检测将浓缩生长因子膜片、iRoot BP预铺在6孔板底壁，将第3代人牙髓细胞按108 L-1的细胞浓度接种于6孔板内，200 µL/孔，每孔加入 DMEM 培养基2 mL，置于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中培养。培养1，3，7 d，胰酶消化细胞，PBS洗涤2次；应用Staining buffer悬浮细胞，收集悬浮细胞，加入PE Annexin V避光孵育15 min，加入适量Staining buffer，300目筛网过滤细胞，获取细胞组织，利用流式细胞仪检测细胞凋亡率。
1.4.8 qRT-PCR检测成牙相关基因的表达将浓缩生长因子膜片、iRoot BP预铺在6孔板底壁，将第3代人牙髓细胞按108 L-1的细胞浓度接种于6孔板内，200 µL/孔，每孔加入 DMEM 培养基2 mL，置于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中培养。以单独培养的细胞为对照。培养第7天时，使用Trizol法分别提细胞总RNA，采用Thermo反转录试剂盒将mRNA反转成cDNA，取200 µL PCR管，配制20 µL反应体系，每个反转录产物配制3管。检测碱性磷酸酶、Runx2和牙本质涎磷蛋白、骨钙素基因的表达，引物设计，见表2。PCR扩增程序设置为： 95 ℃ 预变性10 min，40次循环，95 ℃、15 s→60 ℃、60 s；溶解曲线 75 ℃→95 ℃，每20 s升温1℃。计算目标基因与内参基因的相对Ct值，即ΔCt，组间同一基因相对表达水平利用2-ΔΔCt来表示。

1.5 主要观察指标浓缩生长因子及iRoot BP对人牙髓细胞存活、增殖及矿化的影响。
1.6 统计学分析使用SPSS 23.0 统计学软件及Graphpad prism作图工具，组间数据比较采用t检验，P < 0.05表明差异有显著性意义。

讨论

牙髓是牙齿最内部的组织结构，主要为疏松结缔组织，是牙齿新陈代谢中不可缺少的部分，用于维持内平衡和活力。健康牙髓的自我修复能力相对较强，可以在一定程度上起到保护作用；当牙齿遭受创伤时，外部结构被破坏，牙髓暴露出来，此时如果能够维持无菌环境，牙髓将会发挥有效的诱导作用，促进形成修复性牙本质，从而使牙齿能够得到有效的自我修复[6]。创伤造成牙髓暴露后如何保留活髓至关重要，往往会首选直接盖髓术进行处理，该方法成功与否与覆盖的生物材料性能密切相关，如果盖髓材料能有效促进牙本质形成，产生屏障效果来保护暴露的牙髓，那么将会促进牙齿修复 [7]。
修复材料直接覆盖于牙髓之上会与再生的牙髓直接接触，因此对盖髓材料的生物学功能有更高要求，必须适合牙髓的再生才能达到治疗效果，所以要满足一定的标准：首先要保证材料的有效性和安全性，选择生物相容性较好的材料，同时又不能具有细胞毒性；其次，材料的强度也有一定要求，牙齿担负着咀嚼功能，必然会对材料产生一定压力，因此后者要有一定的承受度；最后，还要考虑材料的冠部封闭情况，必须要满足一定要求，如果封闭效果不佳将会导致微生物进入，致使细菌在局部繁殖，造成牙髓空间感染。矿化三氧化物凝聚体近些年的应用也显著促进了牙髓治疗技术的提高，但是该材料也有一定问题，需要较长的固化时间、可操作性明显不足，同时会造成牙齿本身颜色发生变化，导致临床接受程度下降。生物陶瓷材料因此应运而生，弥补了上述材料的缺陷，开始被越来越多地应用于口腔领域当中。iRoot BP就是其中具有代表性的材料，也成为了矿化三氧化物凝聚体的替代品。LIU等[6]分别使用iRoot BP与矿化三氧化物凝聚体作为Wistar 大鼠上颌第一磨牙的盖髓材料，1周时的组织切片显示iRoot BP组出现硬组织沉积，矿化三氧化物凝聚体组未见该表现；4周时两组均有成牙本质样细胞生成，同时可见具有牙本质小管样结构的修复性牙本质出现，但矿化三氧化物凝聚体组牙本质桥不完全，可见炎症细胞。OKAMOTO等[8]分别使用iRoot BP与矿化三氧化物凝聚体作为Wsitar大鼠牙齿盖髓材料，4周后micro-CT显示iRoot BP组的牙本质矿物密度更高、牙本质体积更大，由此可见，两种材料诱导形成修复性牙本质的时间有所不同，iRoot BP相对更早，同时在质量上也更具有优势。SHI等[4]分别使用iRoot BP和矿化三氧化物凝聚体作为比格犬切牙盖髓材料，3个月后观察两组钙化桥皆已形成，牙髓炎症消失，但是矿化三氧化物凝聚体组盖髓1周后就出现了牙齿灰色变色情况，牙齿与修复材料接触处可见。梅雪等[9]分别使用iRoot BP和矿化三氧化物凝聚体作为比格犬牙齿盖髓材料，12周后可见两组均已出现钙化桥，无牙髓炎症，但是牙齿变色情况只发生于矿化三氧化物凝聚体组，该实验结果显示两种材料皆可用于盖髓治疗，但矿化三氧化物凝聚体会引起牙齿着色，使用上受到一定限制。吴剑波等[10]也针对两种材料的封闭效果进行了对比研究，结果显示iRoot BP更具有优势。
浓缩生长因子是一种有机生物材料，来自于自体全血，其生物学功能主要体现于含有的大量生物活性因子上[11]。准备全血标本，对其进行特定变速离心，完成后分为3层，浓缩生长因子位于中间层。对浓缩生长因子进行观察，了解其超微结构，主要包括细纤维蛋白和细纤维蛋白原，为多孔结构[12]。浓缩生长因子下部有大量细胞聚集，包括血液中各种有形成分，而三维纤维网络将其嵌入其中，与上部截然不同[13]。许多学者曾对浓缩生长因子进行研究，主要针对于其中的一些生物因子，探讨其各自对成牙本质细胞分化的诱导作用[14]，相对较为局限。细胞的增殖和分化往往受到多种因素的影响，与许多生物因子密切相关，彼此之间相互作用、相互影响，形成一个复杂的过程。浓缩生长因子来自于自体组织，富含多种生长因子，如血小板源性生长因子、转化生长因子β、类胰岛素生长因子、血管内皮生长因子和成纤维细胞生长因子等 [15-24]，这些生长因子发挥各自作用，可以诱导人牙髓细胞增殖，促进局部牙本质的修复。浓缩生长因子含有的生长因子呈现出多样性，因此其功效也较为全面，相对于单一生物学制剂具有明显优势，所产生的效果也较为理想。实验结果显示浓缩生长因子膜对人牙髓细胞增殖具有一定的促进作用，考虑与浓缩生长因子的三维结构密切相关，可以有效促进生长因子缓慢持续释放，能够更长久地发挥作用，从而有利于细胞增殖。在骨形成中碱性磷酸酶作为典型成骨标志物存在，发挥着不可替代的作用，同时和早期细胞成骨分化密切相关。当牙髓损伤后，生物活性因子能够有效发挥作用，促进血管再生[25-28]，同时影响机体免疫反应，发挥调节作用，促进牙髓组织修复[29]。实验结果显示浓缩生长因子本身具有一定的诱导作用，可以促进牙髓细胞的分化，提高牙本质基质的分泌，从而保证牙本质修复。作为盖髓材料iRoot BP的作用已经得到肯定，但因费用较高使其应用上受到一定限制[30]。浓缩生长因子因此受到关注，它可以有效促进牙髓细胞增殖、调节细胞分化、减少细胞凋亡，发挥有效的促修复作用，同时安全性较高，满足损伤修复材料的要求。此次实验结果也充分说明了这一点，该材料的组织相容性较高，能够促进牙髓细胞分化，可以作为直接盖髓材料应用，同时还可以用于牙髓根尖周疾病的治疗当中。目前对于该材料的研究尚不全面，还需进一步加以深入，获得更多的研究成果，为临床应用提供指导。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

浓缩生长因子与生物陶瓷材料iRoot BP 体外对人牙髓细胞存活、增殖和矿化的影响

Effect of concentrated growth factor and bioceramic material iRoot BP on survival, proliferation and mineralization of human dental pulp cells in vitro

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[1]	阚厚铭, 范利君, 陈学泰, 申文. 富血小板血浆在神经病理性疼痛中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1286-1292.
[2]	魏舟丹, 李文晋, 朱莉, 王瑜, 赵娇阳, 陈亚楠, 郭栋, 郝敏. 拔牙后富血小板血纤蛋白作为牙槽嵴位点保留材料可显著减少牙槽骨高度及宽度的吸收：一项Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(4): 643-648.
[3]	刘超, 张丽君, 杜心洁, 许茜, 吕红娟, 范冬梅, 田焕玲, 黄健, 黄玉香. 人脐带间充质干细胞促进血小板血浆凝固的机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(25): 4010-4015.
[4]	王宏阳, 李晓丰, 周助人, 李函频, 丛日娇, 李剑平. 沈阳地区血小板输注无效患者的抗体检测与交叉配型结果分析[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(24): 3875-3879.
[5]	李腾艳, 聂敏海, 刘旭倩. 浓缩生长因子与表皮生长因子干预口腔黏膜等效细胞的增殖和衰老[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(20): 3164-3172.
[6]	周俊丽, 王小俊, 王海焦, 李春. 新型医用敷料治疗糖尿病足溃疡疗效比较的网状Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(16): 2562-2569.
[7]	柴乐, 丁晓, 王斌, 陈旭, 郭甲瑞, 朱光普, 余进伟. 富血小板血浆联合生物陶瓷系统治疗ARCO Ⅱ期股骨头坏死[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(15): 2347-2351.
[8]	李世杰, 马立琼, 熊贤梅, 张严, 陈梓杰, 冯俊铭, 高怡加, 曾展鹏. 三七总皂苷对富血小板血浆促进兔骨缺损愈合的影响[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(14): 2155-2160.
[9]	高玺鑫, 王溪, 范戌辉, 崔怡, 杨威, 赵云转. 富血小板纤维蛋白联合诱导骨基质修复兔口腔种植体周围骨缺损[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(14): 2207-2213.
[10]	周颐, 刘笑言, 向柄彦. 组织修复和再生领域浓缩生长因子的应用优势[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(10): 1631-1640.
[11]	李璇, 孙一民, 李龙飙, 王振铭, 杨静, 汪成林, 叶玲. 纳米改性聚己内酯微球的构建及对牙髓细胞的生物学效应[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(10): 1530-1536.
[12]	张学磊, 罗干, 于圣会, 顾祖超, 彭旭, 何学令, 刘艳, 张晓梅. 脱细胞神经联合骨髓间充质干细胞及富血小板凝胶治疗股神经损伤[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(1): 27-32.
[13]	蒋红英, 朱亮, 余曦, 黄靖, 向小娜, 兰正燕, 何红晨. 富血小板血浆干预脊髓损伤患者压力性损伤的作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1149-1153.
[14]	吴训, 孟娟红, 张建运, 王亮. 浓缩生长因子修复兔髁突全层软骨损伤[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1166-1171.
[15]	李偲, 赵婷, 谭戈, 郑雨林, 张若男, 吴艳, 唐俊明. 血小板源生长因子BB可促进骨骼肌成肌细胞增殖、分化与迁移[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1050-1055.

浓缩生长因子与生物陶瓷材料iRoot BP 体外对人牙髓细胞存活、 增殖和矿化的影响

Effect of concentrated growth factor and bioceramic material iRoot BP on survival, proliferation and mineralization of human dental pulp cells in vitro

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