人脐带间充质干细胞促进血小板血浆凝固的机制

doi:10.12307/2022.407

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (25): 4010-4015.doi: 10.12307/2022.407

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人脐带间充质干细胞促进血小板血浆凝固的机制

刘超1，2，张丽君1，杜心洁1，许茜3，吕红娟3，范冬梅3，田焕玲2，黄健2，黄玉香2

1临沂市妇女儿童医院，山东省临沂市 276000；2青岛奥克生物开发有限公司，山东省青岛市 266000；3青岛大学附属青岛妇女儿童医院，山东省青岛市 266011

收稿日期:2021-02-10 接受日期:2021-03-31 出版日期:2022-09-08 发布日期:2022-01-25
通讯作者: 黄玉香，博士，青岛奥克生物开发有限公司，山东省青岛市 266000
作者简介:刘超，山东省青岛市人，汉族，2017年安徽医科大学毕业，硕士，主要从事细胞生物学和分子生物学研究。张丽君，山东省兰陵县人，汉族，2000年山东大学毕业，主任医师，主要从事妇科肿瘤相关研究。
基金资助:
山东省重点研发计划项目(2018GSF118121)，项目负责人：张丽君

Mechanism of human umbilical cord mesenchymal stem cells to promote platelet plasma coagulation

Liu Chao1, 2, Zhang Lijun1, Du Xinjie1, Xu Qian3, Lü Hongjuan3, Fan Dongmei3, Tian Huanling2, Huang Jian2, Huang Yuxiang2

1Linyi Women and Children Hospital, Linyi 276000, Shandong Province, China; 2Allcare Biomedical Development, Qingdao 266000, Shandong Province, China; 3Qingdao Women and Children’s Hospital, Qingdao University, Qingdao 266011, Shandong Province, China

Received:2021-02-10 Accepted:2021-03-31 Online:2022-09-08 Published:2022-01-25
Contact: Huang Yuxiang, MD, Allcare Biomedical Development, Qingdao 266000, Shandong Province, China
About author:Liu Chao, Master, Linyi Women and Children Hospital, Linyi 276000, Shandong Province, China; Allcare Biomedical Development, Qingdao 266000, Shandong Province, China Zhang Lijun, Chief physician, Linyi Women and Children Hospital, Linyi 276000, Shandong Province, China Liu Chao and Zhang Lijun contributed equally to this work.
Supported by:
the Major Research & Development Project of Shandong Province, No. 2018GSF118121 (to ZLJ)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
血小板血浆：自体抗凝血液经离心后去除大部分细胞成分，保留血浆和血小板复合物，含有大量细胞因子，在激活凝血机制后血小板血浆能够凝固成凝胶样结构。
CD142：作为一种凝血因子辅酶，能够与凝血因子Ⅶ或Ⅶa形成复合体，启动凝血过程。由于CD142在转录过程中存在可变剪切，可以形成两种构型，一种定位于细胞膜外表面，另一种以分泌蛋白的形式游离于细胞外。

背景：随着间充质干细胞临床应用研究的深入，间充质干细胞的临床使用方法逐渐发生变化，为增强干细胞在局部组织发挥作用，临床中一般选择干细胞联合凝胶局部使用，而自体富血小板血浆是一种理想的凝胶替代材料。
目的：探讨人脐带间充质干细胞促进血小板血浆凝固的机制。
方法：①将人脐带间充质干细胞与抗凝血浆混匀，添加氯化钙刺激凝血，记录血浆凝血时间，分析人脐带间充质干细胞数量对血浆凝固时间的影响；②通过流式分析CD142凝血因子在人脐带间充质干细胞内的表达情况，使用CD142抗体预处理人脐带间充质干细胞，验证CD142在人脐带间充质干细胞促进凝血过程中是否发挥作用；③查找数据库分析人脐带间充质干细胞中CD142的表达调控模式，并通过WGCNA方法以及文献语义分析CD142在人脐带间充质干细胞中高表达的机制。
结果与结论：①人脐带间充质干细胞通过表达CD142加速血小板血浆凝固，人脐带间充质干细胞中CD142表达随细胞代次增加而增加；②CD142表达上调是人脐带间充质干细胞自分泌的结果；③CD142能够影响人脐带间充质干细胞趋化性以及定植能力。

https://orcid.org/0000-0001-7577-6178 (刘超)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 间充质干细胞, 脐带, 血小板血浆, 富血小板血浆, CD142, 凝血, 血浆凝固

Abstract: BACKGROUND: With the in-depth study of clinical application of mesenchymal stem cell, the clinical use of mesenchymal stem cell has gradually changed. To enhance the role of mesenchymal stem cell in local tissues, stem cell is generally used in combination with local injection of gel, and autologous platelet-rich plasma is an ideal gel replacement material.
OBJECTIVE: To explore the mechanism of human umbilical cord mesenchymal stem cells to promote platelet plasma coagulation.
METHODS: (1) Stem cell was mixed with anticoagulated plasma. Calcium chloride was used to stimulate coagulation. Clotting time was recorded. The effect of the number of human umbilical cord mesenchymal stem cells on the clotting time of plasma was analyzed. (2) CD142 expression in stem cell was analyzed by flow cytometry. CD142 antibody was used to pretreat human umbilical cord mesenchymal stem cells and to ensure if CD142 was one of the most important factors to improve plasma coagulation. (3) CD142 expressing model and regulation model were analyzed by checking on database. WGCNA and text mining were used to achieve the result why CD142 gene expression level was high in human umbilical cord mesenchymal stem cells.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Platelet plasma coagulation could be accelerated by CD142 expression of human umbilical cord mesenchymal stem cells. CD142 expression was enhanced as the increase in mesenchymal stem cell passage. (2) CD142 upregulation was a result of mesenchymal stem cell autocrine. (3) CD142 could affect the ability of cell chemotaxis and colonization in human umbilical cord mesenchymal stem cells.

Key words: stem cells, mesenchymal stem cells, umbilical cord, platelet plasma, platelet-rich plasma, CD142, coagulation, plasma coagulation

中图分类号:

刘超, 张丽君, 杜心洁, 许茜, 吕红娟, 范冬梅, 田焕玲, 黄健, 黄玉香. 人脐带间充质干细胞促进血小板血浆凝固的机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(25): 4010-4015.

Liu Chao, Zhang Lijun, Du Xinjie, Xu Qian, Lü Hongjuan, Fan Dongmei, Tian Huanling, Huang Jian, Huang Yuxiang. Mechanism of human umbilical cord mesenchymal stem cells to promote platelet plasma coagulation[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(25): 4010-4015.

图/表（结果） 5

2.1 脐带间充质干细胞促进血小板血浆凝固血小板血浆形成凝胶样的过程，本质上是凝血反应，其过程由一系列凝血因子共同发挥作用，通过激活凝血酶原将可溶的纤维蛋白原转变成不可溶纤维蛋白，最终交联的纤维蛋白形成凝胶样结构[18]，其中Ca2+作为凝血因子Ⅳ在凝血过程中发挥重要作用。体外采集的血小板血浆，在肝素钠、EDTA等抗凝剂的作用下，血浆一般不会发生凝固现象，通过向血浆中添加一定比例的Ca2+可以重新激活凝血反应。利用血小板血浆凝固的这一个特性，可以作为干细胞使用过程的凝胶支持材料。实验过程中发现，将脐带间充质干细胞添加至血小板血浆中，血浆和脐带间充质干细胞都可以稳定保存，但是在CaCl2刺激下，含有脐带间充质干细胞的血浆能够更快地凝固，实验数据表明含有脐带间充质干细胞的血浆凝固速度是单纯血浆组凝固速度的10倍左右，见图1A。通过设置血浆中不同梯度的干细胞数量，发现血小板血浆凝胶形成时间与脐带间充质干细胞数量呈现相关性，见图1B。基于以上实验数据表明，脐带间充质干细胞能够加速血小板血浆的凝固过程。

2.2 脐带间充质干细胞随着传代次数的增加高表达CD142 为进一步研究脐带间充质干细胞促进血小板血浆凝固的机制。将凝血机制中已经报道的凝血因子逐个调查，分析发现CD142(Symbol名称F3)作为凝血因子的辅助因子，能够结合凝血因子Ⅶa从而促进凝血过程，通常情况下血管内不含有CD142，当血管破损组织中的CD142进入血管中，进而启动凝血过程。由于CD142 RNA存在可变剪切，可以产生细胞外可溶蛋白和跨膜蛋白这两种蛋白形式，这两种蛋白均具有凝血因子辅酶作用，其中CD142的跨膜蛋白是目前已知的唯一一种定位于细胞膜的凝血因子[19]。由此猜想脐带间充质干细胞可能通过CD142促进凝血。通过流式细胞术检测到脐带间充质干细胞的膜表面表达CD142，见图2。

并且当脐带间充质干细胞处于较低代次时，不同人来源间充质干细胞表达CD142存在较大的个体差异，间充质干细胞从P0代到P1代CD142的表达有一个激增过程，之后随着干细胞传代次数增加，干细胞表面的CD142也逐渐趋于稳定高表达，见图2，提示脐带间充质干细胞表达的CD142有可能参与到凝血过程。
2.3 人脐带间充质干细胞表面CD142是加速血小板血浆凝固的主要机制为验证人脐带间充质干细胞表面的CD142是否是加速血小板血浆凝固的主要原因。在实验中选择CD142抗体靶向人脐带间充质干细胞膜表面的CD142蛋白，由于抗体与CD142蛋白结合，通过空间位阻可能抑制CD142发挥促凝血的功能，实验结果表明CD142单抗可以显著延长人脐带间充质干细胞促进血小板血浆的凝固时间，见图3，由此推测CD142是人脐带间充质干细胞促进血小板血浆凝固的一个主要机制。

2.4 人脐带间充质干细胞CD142表达调控模式通过上述研究了解到，人脐带间充质干细胞表达CD142并随着细胞传代而增加，那么体外培养的人脐带间充质干细胞为何趋向于表达CD142，需要进一步研究。
许多研究表明CD142在许多肿瘤中高表达，主要机制是由于肿瘤处于厌氧环境，这种条件能够刺激CD142的转录因子表达[20]，但是相对于体内2%-8%的氧分压[21]，在体外正常培养的细胞处于一种高氧环境。为探究人脐带间充质干细胞CD142的表达调控模式，检索GEO数据库发现GSE119987数据收集了4例脐带间充质干细胞(男2例，女2例)[22]，表达矩阵经过背景矫正以及去除批次效应，剔除未收集足量RNA用于检测的样品P1代和P13代数据，根据表达量和代次拟合回归曲线，可以观察到细胞随着传代次数增加，CD142在基因表达水平整体呈现上调趋势，从P8代开始CD142快速上调，见图4A，这与人脐带间充质干细胞CD142蛋白水平的表达趋势基本一致。
为进一步分析人脐带间充质干细胞表达CD142对干细胞的影响，研究过程选择GEO数据中CD142高表达的P10，P11，P12代次样品，进行WGCNA分析，找到与CD142表达相似的基因集，见图4B，并对模块内的基因集合做GO注释，通过注释发现模块内的基因主要与受体激活以及细胞趋化性相关，见图4C。

使用CyEVEX(http://evexdb.org/)提供的文献语义分析工具检索CD142调控方式，可以发现白细胞介素1等炎症因子以及血管内皮生长因子都能引起CD142的表达[23-25]，这些细胞因子在人脐带间充质干细胞的培养基上清液中均可检测到[26-27]，并且人脐带间充质干细胞能够表达相应因子的受体，因此，体外培养的人脐带间充质干细胞能够逐渐增强CD142的表达，可能是由于人脐带间充质干细胞自分泌细胞因子产生的结果，并且CD142的表达可能影响人脐带间充质干细胞对配体的响应以及细胞的趋化性。

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引言

干细胞是一种具有分化潜能的细胞，根据分化能力可以将其分为全能干细胞、多能干细胞和单能干细胞，在临床应用较多的是多能干细胞，其中间充质干细胞在成体内分布广泛，并且具有良好的免疫调节能力，在2020年新型冠状病毒肺炎治疗中，使用间充质干细胞应对机体因子风暴取得了显著的临床疗效[1-2]。目前已有多个干细胞药物产品上市，例如2015年日本批准通过骨髓源间充质干细胞药品上市，该药品用于治疗急性移植物抗宿主病[3]，说明干细胞有巨大的临床应用前景。
目前间充质干细胞的临床应用方式主要以注射液为主，通过静脉注射经循环系统将干细胞分散至身体各处，对于全身性的免疫系统疾病具有良好效果，但是对于局部炎症作用的效果被削弱。在动物实验中，BARBASH等[4]使用同位素标记干细胞，发现尾静脉注射能够显著影响干细胞在组织内的分布，大部分干细胞在肺部滞留。为提高干细胞对局部炎症、损伤的治疗效果，有研究基于羊膜的微载体技术或者干细胞微球技术[5-6]，通过外用的方式在小鼠皮肤损伤模型中取得显著成效，还有许多基础研究应用干细胞结合凝胶在局部注射使干细胞在局部发挥疗效，目前已经报道的凝胶材料有水凝胶[7]、胶原蛋白[8]、透明质酸等[9]，但是这些材料的生物相容性、生物毒性等方面，都限制凝胶材料的应用。富血小板血浆已经在外科、皮肤科等临床领域应用非常成熟[10]，由于富含血小板能够释放大量细胞因子[11-12]，起到促进组织损伤修复的作用，并且在凝血机制的刺激下血小板血浆能够发生凝固，形成凝胶样结构，这种凝胶结构取材于人体本身，与干细胞和人体具有很好的生物相容性，因此血小板血浆是一种理想的凝胶替代物。
干细胞与血小板血浆联合应用已有相关报道，2019年HERSANT等[13]研究发现富血小板血浆联合脂肪间充质干细胞能够加快小鼠的伤口愈合。在血小板血浆联合干细胞的研究中发现，体外采集的抗凝血小板血浆，在Ca2+形成的凝血机制刺激下，脐带间充质干细胞能够缩短血小板血浆的凝固时间，该研究主要讨论脐带间充质干细胞促进血小板血浆凝固的机制，以及干细胞在临床中局部注射使用的可行性，希望通过相关研究拓展间充质干细胞临床应用方式，提高间充质干细胞临床适应证的疗效。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计细胞学实验，组间差异显著性使用t检验方法。
1.2 时间及地点实验于2017-03-12/2020-01-20在青岛(奥克)区域细胞制备中心和临沂妇女儿童医院完成。
1.3 材料
1.3.1 脐带组织脐带组织采集自青岛大学附属医院足月剖宫产的健康产妇，采集之前对产妇及其家属宣读知情同意书，在签署知情同意书后，由产科医生完成组织采集，使用无菌瓶加入细胞培养基密封后4 ℃低温运输，组织分离培养在6 h内完成。
1.3.2 成人血浆采集成人血浆前宣读知情同意书，在签署知情同意书后，由医护人员完成血液采集，用肝素钠抗凝管保存运输血液，并于6 h内完成处理。血液首先经1 200 r/min离心后取上层血浆，获取含有血小板的血浆，将血浆分装后保存于-20 ℃备用。
1.3.3 实验试剂及仪器注射用氯化钙(规格10 mL：0.5 g，国药准字H51023149)；胎牛血清(Gibico公司，货号：16000044)；无血清添加物(Helios公司，货号：HPCPLCRL50)；干细胞基础培养基(达科为公司)；PE标记的鼠抗人CD142(BD公司)；CO2培养箱(Thermo公司)；流式细胞仪(Beckman公司)；荧光倒置显微镜(Olympus公司)；离心机(Beckman公司)。
1.4 实验方法

1.4.1 脐带间充质干细胞分离培养剪取2.0-3.0 cm长的脐带组织，用含有1%双抗的PBS冲洗，然后用手术剪沿脐带纵轴剖开剔除3条血管，获取脐带华通胶部分，剪碎成1.0-2.0 mm3大小的组织块，均匀分散在10 cm细胞培养皿中，放入37 ℃，体积分数为5%CO2培养箱静置1 h，使组织块牢固贴附于皿底，1 h后缓慢加入8 mL干细胞培养基培养，每3 d半量换液1次，直到细胞爬出组织块，细胞融合度超过90%时可以收获细胞。脐带间充质干细胞的培养以及鉴定参考之前相关研究[14]。细胞传代至11代，留取P0，P1，P3，P5，P7，P9，P11待检测分析。

1.4.2 血小板血浆凝血时间记录为避免不同人来源血浆凝血时间的差异，以及血浆中抗凝剂含量的差异，每次实验选择同一个人的血小板血浆，血浆的凝血时间检测方法如下：①-20 ℃冻存血浆室温融化后吹打混匀，单纯血浆组在1.5 mL EP 管中加入1 mL血浆，脐带间充质干细胞组预先使用无钙镁离子的PBS清洗脐带间充质干细胞1次，将离心后的脐带间充质干细胞沉淀使用1 mL血小板血浆重悬，设置0，1.2，2.5，5.0，10，20×108 L-1细胞浓度梯度；②在血浆中加入50 μL注射用CaCl2，立即吹打混匀，放置室温中并开始计时；③计时过程每10 s倒置EP管观察血浆是否有回流，记录血浆完全凝固时间，以倒扣EP管血浆不能回流为计时终点。
1.4.3 流式细胞术检测脐带间充质干细胞表面CD142的表达 ①使用0.2%胰酶消化贴壁培养的脐带间充质干细胞(P0代至P11代)，30 s后加入干细胞培养基中和胰酶，取1.0×106个细胞至15 mL离心管，1 000 r/min离心10 min收集细胞；②每管细胞加入10 mL PBS洗涤1次，1 000 r/min离心10 min收集细胞，加入适量PBS调整细胞浓度保持在1.0×109 L-1，取100 μL细胞悬液，加入流式抗体CD142或IgG1，在4 ℃避光条件下标记30 min；③标记完成后每管加入2 mL PBS，1 000 r/min离心10 min收集细胞，加入200 μL PBS重悬细胞，上流式细胞仪检测，使用Flowjo软件分析数据。
1.4.4 抗体预处理脐带间充质干细胞取1.0×105脐带间充质干细胞，细胞活力保存在95%以上，避免细胞过度死亡释放细胞质成分，使用无钙镁的PBS重悬并清洗细胞1次，1 000 r/min离心10 min收集细胞沉淀，使用200 μL血浆重悬细胞沉淀并轻柔吹打混匀，加入10 μL抗体(阴性对照添加IgG1或实验组添加CD142单抗)混匀，室温避光孵育40 min，检测脐带间充质干细胞促血小板血浆凝固时间。
1.5 主要观察指标 ①脐带间充质干细胞流式表型；②脐带间充质干细胞促凝血时间；③脐带间充质干细胞基因表达与调控网络。
1.6 统计学分析统计分析使用R语言(3.6.2版本)，差异显著性使用t检验方法，P < 0.05为差异有显著性意义，流式数据使用Flowjo(10.0.7版本)软件分析，加权基因共表达网络(WGCNA)分析使用R语言WGCNA包分析[15]，GO分析使用clusterProfiler[16]，网络图使用Cytoscape (3.7.2版本)[17]。

讨论

间充质干细胞与凝胶材料联合使用，既能够提高细胞局部存活能力，又可以增强干细胞在局部发挥的作用。目前在临床中应用的凝胶主要以胶原蛋白为主，由于胶原蛋白成凝胶对温度要求较高，并且凝胶材料不适合局部注射，因此一般以外用为主[8]。富血小板血浆中富含细胞因子，能够促进组织修复，在临床中已经广泛使用，由于凝血机制的存在，血浆中纤维蛋白原经过酶促反应变为不可溶的纤维蛋白，由此可以形成凝胶样结构，并且可以通过调控酶活性控制凝胶形成速度。血小板血浆凝胶材料既可以为干细胞提供营养支持，又可以为干细胞提供物理支撑，自体血浆不会引起过敏反应，同时干细胞能够在细胞基质中分泌蛋白酶[28-29]，可以促进纤维蛋白凝胶的降解，最终血小板血浆在人体内能被代谢吸收，是一种较为理想的凝胶替代材料。
在研究中发现人脐带间充质干细胞能加快Ca2+刺激的血浆凝血过程，CD142作为凝血因子辅酶，在凝血过程中可能发挥重要作用，人脐带间充质干细胞膜表面可以检测到CD142表达，并且随着细胞代次的增加而增加，使用CD142抗体竞争性抑制CD142酶活性，能够间接抑制干细胞的促凝血过程。在2013年TATSUMI等[30]发现小鼠注射过量脂肪间充质干细胞可以引发血栓，当敲除干细胞中CD142后可以降低血栓的风险。
由此推断，间充质干细胞CD142的表达是加快血小板血浆凝胶形成的一个主要机制。根据前人对CD142的研究，可以发现低氧、白细胞介素1α、血管内皮生长因子等因素都能够刺激CD142的表达。低氧条件对细胞CD142的调控机制存在一定的争议，在肿瘤研究中厌氧环境能够促进CD142表达[20]，但是在骨髓间充质干细胞中有报道低氧刺激能够降低CD142的表达[31]，低氧条件对间充质干细胞CD142的调控需要进一步研究。由于间充质干细胞能同时表达白细胞介素1α、血管内皮生长因子等因子及其受体，并且在2018年FOLCO等[24]发现使用白细胞介素1抗体中和白细胞介素1或白细胞介素1受体拮抗剂阻断白细胞介素1受体时能够抑制CD142的表达，因此，间充质干细胞表达CD142可能是细胞自分泌形成的结果。
既然细胞能够自分泌细胞因子，为何从组织分离的原代细胞中CD142的表达较低？有研究发现2D细胞培养相比较于3D细胞培养，干细胞对细胞因子的分泌以及因子的响应都发生巨大变化， 3D培养条件下细胞中白细胞介素1表达降低并且对白细胞介素1的刺激响应较弱[32]。
该实验结果发现脐带间充质干细胞中CD142的蛋白表达从原代分离的P0代细胞到2D扩增培养的P1代细胞有一个激增的过程，这同样提示细胞培养维度不同造成细胞特性的改变。当间充质干细胞处于血小板血浆环境内，干细胞特性同样会发生变化，有研究报道，血小板血浆释放的细胞因子与干细胞相互作用后，干细胞的增殖能力和分化能力都显著提高[33-34]，是否可以影响干细胞CD142的表达需要进一步研究，根据之前的研究，可以推测干细胞处于凝胶环境是一种类3D环境，CD142的表达可能会下调。因此，干细胞与微环境的相互作用可能是影响干细胞CD142表达的主要机制。
通过WGCNA分析进一步研究CD142表达调控模式，找到与CD142具有相同表达模式的基因，这些基因的主要功能与细胞因子激活和趋化性相关，这提示CD142表达上调标志着细胞定植分布的能力增强。
综上所述，间充质干细胞表达CD142对临床应用的影响是多方面的，一方面，CD142作为凝血过程的辅酶，细胞高表达CD142导致干细胞的血液相容性降低[35]，应当注意血栓风险，在实验中发现血浆的凝固时间与脐带间充质干细胞数量呈现负相关，因此降低干细胞静脉输入速度，避免血液中局部干细胞密度过高可以降低血栓风险。另一方面，由于凝血过程包括血小板的变形以及细胞因子释放，因此间充质干细胞中CD142的表达将有利于干细胞与血小板血浆相互作用，从而促进血小板内细胞因子的释放，同时CD142可以促进细胞定植分布，因此，间充质干细胞表达CD142促使临床中局部注射干细胞更具优势。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

人脐带间充质干细胞促进血小板血浆凝固的机制

Mechanism of human umbilical cord mesenchymal stem cells to promote platelet plasma coagulation

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