白细胞介素23/辅助性T17细胞轴与腰椎间盘突出症的相关性

doi:10.12307/2022.482

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (14): 2190-2195.doi: 10.12307/2022.482

• 骨组织构建 bone tissue construction • 上一篇下一篇

白细胞介素23/辅助性T17细胞轴与腰椎间盘突出症的相关性

杨洋1，刘佳佳1，薛建华1，刘云飞2，姚羽3

1南通大学附属医院创伤中心，江苏省南通市 226001；2南通大学，江苏省南通市 226001；3南通大学脊柱外科，江苏省南通市 226001

收稿日期:2020-11-12 修回日期:2021-01-16 接受日期:2021-08-23 出版日期:2022-05-18 发布日期:2021-12-21
通讯作者: 姚羽，硕士，副主任医师，南通大学脊柱外科，江苏省南通市 226001
作者简介:杨洋，男，1985年生，江苏省盐城市人，汉族，2011年南通大学毕业，硕士，主治医师，主要从事四肢创伤及脊柱退行性疾病研究。
基金资助:
南通市科技项目(MS12018057)，项目负责人：杨洋；南通市卫健委科技项目(MA2020023)，项目负责人：杨洋

Correlation between interleukin 23/helper T17 cell axis and lumbar disc herniation

Yang Yang1, Liu Jiajia1, Xue Jianhua1, Liu Yunfei2, Yao Yu3

1Trauma Center, Affiliated Hospital of Nantong University, Nantong 226001, Jiangsu Province, China; 2Nantong University, Nantong 226001, Jiangsu Province, China; 3Department of Spine Surgery, Nantong University, Nantong 226001, Jiangsu Province, China

Received:2020-11-12 Revised:2021-01-16 Accepted:2021-08-23 Online:2022-05-18 Published:2021-12-21
Contact: Yao Yu, Master, Associate chief physician, Department of Spine Surgery, Nantong University, Nantong 226001, Jiangsu Province, China
About author:Yang Yang, Master, Attending physician, Trauma Center, Affiliated Hospital of Nantong University, Nantong 226001, Jiangsu Province, China
Supported by:
the Nantong Municipal Scientific Program, No. MS12018057 (to YY); Science and Technology Project of Nantong Municipal Health Commission, No. MA2020023 (to YY)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
白细胞介素23：是一种共价连接异源二聚体细胞因子，由白细胞介素12p40“可溶性受体”亚基和与白细胞介素12p35相关的一个新的细胞因子样亚单位p19组成。白细胞介素23可以促进辅助性T17细胞产生大量炎症因子白细胞介素17，白细胞介素17 能够诱导促炎细胞因子(如白细胞介素6、肿瘤坏死因子α)、趋化因子和基质金属蛋白酶的表达，引起炎性细胞浸润和组织破坏，在加速椎间盘退变的同时导致腰背痛的发生。
辅助性T17细胞：是新近发现的一类CD4+辅助性T细胞亚群，它主要分泌白细胞介素17、白细胞介素6、白细胞介素21、白细胞介素23和肿瘤坏死因子α等。

背景：对于腰椎间盘突出症的发生，白细胞介素23促进辅助性T17细胞进一步分泌白细胞介素17，白细胞介素17协同肿瘤坏死因子α促进各种炎症递质产生，从而介导炎症反应和自身免疫反应，引起坐骨神经痛等症状。
目的：探讨白细胞介素23/辅助性T17细胞轴与腰椎间盘突出症的关系。
方法：选取38例髓核标本，其中30例取自腰椎间盘突出症患者，8例取自腰椎骨折患者，同时在入院时抽取两组患者的外周血样本。所有患者均收治于南通大学附属医院脊柱外科，根据临床症状、影像学检查及术中所见确诊。采用免疫组化法检测两组患者髓核组织中白细胞介素23的表达，采用ELISA法检测两组患者髓核组织和外周血中白细胞介素17、白细胞介素23、肿瘤坏死因子α水平，并进行Pearson相关性分析。
结果与结论：试验组髓核组织中白细胞介素23阳性表达率高于对照组(P < 0.01)；试验组髓核组织、外周血中白细胞介素17、白细胞介素23、肿瘤坏死因子α水平均明显高于对照组(P < 0.01)；试验组髓核组织中的3个细胞因子两两之间均呈显著正相关关系(r > 0.5，P < 0.01)。结果表明，腰椎间盘突出症与白细胞介素23/辅助性T17细胞轴炎症反应关系密切。

https://orcid.org/0000-0002-4086-5645 (杨洋)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 椎间盘突出症, 白细胞介素23, 白细胞介素17, 辅助性T17细胞, 肿瘤坏死因子α, 细胞因子, 炎症

Abstract: BACKGROUND: For lumbar disc herniation, interleukin-23 promotes the Th17 cells to secrete interleukin-17, and then interleukin-17 cooperates with tumor necrosis factor-α to produce inflammation mediators. It would aggravate inflammation and autoimmune response, and then cause some symptoms such as sciatica.
OBJECTIVE: To explore the association between interleukin-23/Th17 axis and lumbar disc herniation.
METHODS: Thirty-eight samples of nucleus pulposus were selected, of which 30 were taken from patients with lumbar disc herniation (trial group) and 8 from patients with lumbar vertebral fractures (control group). Peripheral blood samples were meanwhile taken from two groups of patients on admission. All patients, who were admitted to the Department of Spine Surgery, Affiliated Hospital of Nantong University, were diagnosed based on clinical symptoms, imaging examinations and intraoperative confirmation. Immunohistochemical method was used to detect the expression of interleukin 23 in the nucleus pulposus tissue, and ELISA assay was used to detect the levels of interleukin 17, interleukin 23, and tumor necrosis factor-α in the nucleus pulposus tissue and peripheral blood. Pearson correlation analysis was then performed.
RESULTS AND CONCLUSION: Immunohistochemistry detection showed that the expression of interleukin-23 was significantly higher in the trial group than the control group (P < 0.01). The levels of interleukin-17, interleukin-23 and tumor necrosis factor-α in the nucleus pulpous and peripheral blood all significantly increased in the trial group compared with the control group (P < 0.01). There was a significant positive correlation between these three cytokines in the nucleus pulposus tissue of the trial group (r > 0.5, P < 0.01). To conclude, lumbar disc herniation is closely related to interleukin-23/Th17 axis inflammatory response.

Key words: lumbar disc herniation, interleukin-23, interleukin-17, helper T17 cells, tumor necrosis factor-α, cytokine, inflammation

中图分类号:

杨洋, 刘佳佳, 薛建华, 刘云飞, 姚羽. 白细胞介素23/辅助性T17细胞轴与腰椎间盘突出症的相关性[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(14): 2190-2195.

Yang Yang, Liu Jiajia, Xue Jianhua, Liu Yunfei, Yao Yu. Correlation between interleukin 23/helper T17 cell axis and lumbar disc herniation[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(14): 2190-2195.

图/表（结果） 9

2.1 参与者数量分析按意向性处理，参加试验38例患者均进入结果分析。
2.2 两组基线资料比较见表1。

2.3 试验流程图见图1。

2.4 腰椎间盘髓核组织的苏木精-伊红染色观察结果对照组髓核周围胶原组织排列比较规则，软骨细胞有不规则软骨陷窝，髓核细胞多孤立位于软骨陷窝中。髓核细胞呈卵圆形，体积小，数目多，胞膜完整，胞质均匀，见图2A，C。试验组髓核周围胶原组织排列紊乱，髓核细胞形态不规则，体积较大，数目较少，胞膜不完整，细胞内有空泡，胞质不均匀，见图2B，D。

2.5 腰椎间盘髓核组织白细胞介素23免疫组化染色观察结果髓核组织中细胞胞浆内出现棕黄色或棕褐色为白细胞介素23阳性表达，浅棕黄色为弱阳性表达，细胞核为淡蓝色。对照组胶原组织排列规则，细胞多为淡蓝色阴性，偶尔可见棕黄色弱阳性表达，见图3A，C，试验组胶原组织可见大量裂隙，细胞多见棕黄色或棕褐色阳性甚至强阳性表达，见图3B，D。统计30例试验组和8例对照组标本中白细胞介素23阳性表达率，发现试验组白细胞介素23阳性表达率显著高于对照组，见图4。

2.6 两组髓核组织与外周血中白细胞介素17、白细胞介素23和肿瘤坏死因子α水平
2.6.1 白细胞介素17水平两组髓核组织中都含有白细胞介素17，试验组明显高于对照组，差异有显著性意义(P < 0.01)；两组外周血中都含有白细胞介素17，试验组明显高于对照组，差异有显著性意义(P < 0.01)，见图5。

2.6.2 白细胞介素23水平两组髓核组织中都含有白细胞介素23，试验组明显高于对照组，差异有显著性意义(P < 0.01)；两组外周血中都含有白细胞介素23，试验组明显高于对照组，差异有显著性意义(P < 0.01)，见图6。

2.6.3 肿瘤坏死因子α水平两组髓核组织中都含有肿瘤坏死因子α，试验组明显高于对照组，差异有显著性意义(P < 0.01)；两组外周血中都含有肿瘤坏死因子α，试验组明显高于对照组，差异有显著性意义(P < 0.01)，见图7。

2.7 腰椎间盘突出髓核组织中白细胞介素23、白细胞介素17和肿瘤坏死因子α水平的相关性分析 ELISA法测定试验组髓核组织中3种因子水平，两两进行比较，白细胞介素23与白细胞介素17的相关系数为0.735 5，白细胞介素23与肿瘤坏死因子α的相关系数为0.585 6，白细胞介素17与肿瘤坏死因子α的相关系数为0.672 2，且差异均有显著性意义(P < 0.01)，说明3种因子的表达两两之间呈显著正相关关系。绘制两两之间的散点图，可见基本呈正相关趋势，见图8。

参考文献

[1] 彭丽丽,余凤娇,王青.康复护理干预对腰椎间盘突出症患者的生活质量影响[J].实用临床医药杂志,2016,20(16):207-209.
[2] 曾祥宏,刘兵.腰椎间盘突出症的病因及其机制分析[J].长江大学学报(自然科学版),2010,7(3):72-73.
[3] LICHAWSKA-CIESLAR A, KONIECZNY P, SZUKALA W, et al. Loss of keratinocyte Mcpip1 abruptly activates the IL-23/Th17 and Stat3 pathways in skin inflammation. Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 2021;1868(1):118866.
[4] LECCESE G, BIBI A, MAZZA S, et al. Probiotic Lactobacillus and Bifidobacterium Strains Counteract Adherent-Invasive Escherichia coli (AIEC) Virulence and Hamper IL-23/Th17 Axis in Ulcerative Colitis, but Not in Crohn’s Disease. Cells. 2020;9(8):1824.
[5] EGEBERG A, GISONDI P, CARRASCOSA JM, et al. The role of the interleukin-23/Th17 pathway in cardiometabolic comorbidity associated with psoriasis. J Eur Acad Dermatol Venereol. 2020;34(8):1695-1706.
[6] PLAVEC TV, KUCHAŘ M, BENKO A, et al. Engineered Lactococcus lactis Secreting IL-23 Receptor-Targeted REX Protein Blockers for Modulation of IL-23/Th17-Mediated Inflammation. Microorganisms. 2019;7(5):152.
[7] HASAN Z, KOIZUMI SI, SASAKI D, et al. JunB is essential for IL-23-dependent pathogenicity of Th17 cells. Nat Commun. 2017;8:15628.
[8] PUNKENBURG E, VOGLER T, BÜTTNER M, et al. Batf-dependent Th17 cells critically regulate IL-23 driven colitis-associated colon cancer. Gut. 2016;65(7):1139-1150.
[9] REVU S, WU J, HENKEL M, et al. IL-23 and IL-1β Drive Human Th17 Cell Differentiation and Metabolic Reprogramming in Absence of CD28 Costimulation. Cell Rep. 2018;22(10):2642-2653.
[10] 张海平,张烽,姚羽.腰椎间盘突出髓核的自身免疫性[J].中国组织工程研究,2012,16(48):8931-8937.
[11] ANITUA E, PADILLA S. Biologic therapies to enhance intervertebral disc repair. Regen Med. 2018;13(1):55-72.
[12] 赵才勇,何东,刘淼,等.腰椎间盘表观弥散系数与肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-6的相关性研究[J].功能与分子医学影像学(电子版), 2016,5(3):34-37.
[13] 张潇潇,姜宏,张志刚,等.肿瘤坏死因子与腰椎间盘退变的相关性研究进展[J].中国中医骨伤科杂志,2017,25(12):79-82.
[14] 王亮,张照宏.趋化因子CXCL10(IP-10)、MMP-1及TNF-α与腰椎间盘突出症的相关性研究[J].山东医学高等专科学校学报,2015, 37(6):445-447.
[15] 安志辉,丁文元,张剑刚,等.退变性腰椎侧凸TNF-α基因多态性和蛋白表达水平的相关研究[J].中国骨与关节杂志,2012,1(4):381-387.
[16] 朱书涛,刘洋,张明辉,等.去卵巢大鼠骨组织中肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β及白细胞介素6水平与骨质疏松的关系[J].中国组织工程研究,2016,20(15):2206-2211.
[17] 孙中仪,田纪伟.白细胞介素与椎间盘退变的研究进展[J].中国矫形外科杂志,2014,22(3):249-252.
[18] SPILIOPOULOU I, KOROVESSIS P, KONSTANTINOU D, et al. IgG and IgM concentration in the prolapsed human intervertebral disc and sciatica etiology. Spine (Phila Pa 1976). 1994;19(12):1320-1323.
[19] GEISS A, LARSSON K, RYDEVIK B, et al. Autoimmune properties of nucleus pulposus: an experimental study in pigs. Spine (Phila Pa 1976). 2007;32(2):168-173.
[20] MABUCHI T, KOJIMA H, ABE T, et al. Membrane-associated prostaglandin E synthase-1 is required for neuropathic pain. Neuroreport. 2004;15(9): 1395-1398.
[21] ZAKA M, ABBASI BH, DURDAGI S. Novel tumor necrosis factor-α (TNF-α) inhibitors from small molecule library screening for their therapeutic activity profiles against rheumatoid arthritis using target-driven approaches and binary QSAR models. J Biomol Struct Dyn. 2019; 37(9):2464-2476.
[22] JAHID M, REHAN-UL-HAQ, JHA PK, et al. Tumor necrosis factor-α -308 polymorphism in North Indian rheumatoid arthritis patients and association with mRNA and serum TNF-α. Clin Rheumatol. 2017;36(10): 2209-2216.
[23] DAI ZH, XU XT, RAN ZH. Associations Between Obesity and the Effectiveness of Anti-Tumor Necrosis Factor-alpha Agents in Inflammatory Bowel Disease Patients: A Literature Review and Meta-analysis. Ann Pharmacother. 2020;54(8):729-741.
[24] FARSI F, HESHMATI J, KESHTKAR A, et al. Can coenzyme Q10 supplementation effectively reduce human tumor necrosis factor-α and interleukin-6 levels in chronic inflammatory diseases? A systematic review and meta-analysis of randomized controlled trials. Pharmacol Res. 2019;148:104290.
[25] EVANS HG, ROOSTALU U, WALTER GJ, et al. TNF-alpha blockade induces IL-10 expression in human CD4+ T cells. Nat Commun. 2014;5:3199.
[26] TAKAHASHI H, SUGURO T, OKAZIMA Y, et al. Inflammatory cytokines in the herniated disc of the lumbar spine. Spine (Phila Pa 1976). 1996; 21(2):218-224.
[27] 赵太茂,刘淼,赵文,等. TNF-α、IL- 1β在腰椎间盘突出症中致痛作用的研究[J].颈腰痛杂志,2010,31(3):174-176.
[28] ZIELINSKI CE, MELE F, ASCHENBRENNER D, et al. Pathogen-induced human TH17 cells produce IFN-gamma or IL-10 and are regulated by IL-1beta. Nature. 2012;484(7395):514-518.
[29] MAGGI E, BISWAS P, DEL PRETE G, et al. Accumulation of Th-2-like helper T cells in the conjunctiva of patients with vernal conjunctivitis. J Immunol. 1991;146(4):1169-1174.
[30] 张海平.腰椎间盘突出症与TH细胞极化的相关性研究[D].南通:南通大学,2010:1-48.
[31] AGGARWAL S, GHILARDI N, XIE MH, et al. Interleukin-23 promotes a distinct CD4 T cell activation state characterized by the production of interleukin-17. J Biol Chem. 2003;278(3):1910-1914.
[32] LANGRISH CL, CHEN Y, BLUMENSCHEIN WM, et al. IL-23 drives a pathogenic T cell population that induces autoimmune inflammation. J Exp Med. 2005;201(2):233-240.
[33] PARK H, LI Z, YANG XO, et al. A distinct lineage of CD4 T cells regulates tissue inflammation by producing interleukin 17. Nat Immunol. 2005; 6(11):1133-1141.
[34] PARHAM C, CHIRICA M, TIMANS J, et al. A receptor for the heterodimeric cytokine IL-23 is composed of IL-12Rbeta1 and a novel cytokine receptor subunit, IL-23R. J Immunol. 2002;168(11):5699-5708.
[35] HARRINGTON LE, HATTON RD, MANGAN PR, et al. Interleukin 17-producing CD4+ effector T cells develop via a lineage distinct from the T helper type 1 and 2 lineages. Nat Immunol. 2005;6(11):1123-1132.
[36] MELNIKOV M, SHARANOVA S, SVIRIDOVA A, et al. The influence of glatiramer acetate on Th17-immune response in multiple sclerosis. PLoS One. 2020;15(10):e0240305.
[37] KORN T, BETTELLI E, OUKKA M, et al. IL-17 and Th17 Cells. Annu Rev Immunol. 2009;27:485-517.
[38] ZHANG H, TAI H, MA Y, et al. Postoperative Serum Levels of Interleukin-1β (IL-1β), Interleukin-17 (IL-17), and Tumor Necrosis Factor-α (TNF-α) in Patients Following Hip Replacement Surgery for Traumatic Fractured Femoral Neck: A Retrospective Study. Med Sci Monit. 2019;25:6120-6127.
[39] LEGRAND A, FERMOR B, FINK C, et al. Interleukin-1, tumor necrosis factor alpha, and interleukin-17 synergistically up-regulate nitric oxide and prostaglandin E2 production in explants of human osteoarthritic knee menisci. Arthritis Rheum. 2001;44(9):2078-2083.

引言

腰椎间盘突出症是引起下腰痛的常见病因，多见于青壮年，男性多于女性，具有反复发作、迁延不愈的特点[1]。腰椎间盘突出症患者临床症状通常表现为腰痛伴下肢放射痛，活动后加重，出现马尾症状者甚至会有尿便失禁。随着现代人们生活节奏的加快，该病的发病率还在增高，随之带来的腰腿痛已经严重影响了人们的工作和生活[2]。目前主要通过保守治疗或手术治疗缓解症状，但是保守治疗效果不佳，而手术治疗又存在费用高、风险大等缺点，因此为了探索其他有效的治疗手段，对该病引起的疼痛进行相关研究变得十分必要。
近些年，椎间盘突出的免疫学发病机制研究越来越受到人们的关注。白细胞介素23/辅助性T17细胞轴是近年来新发现的免疫轴，它已经被证实与银屑病、克罗恩病等自身免疫疾病的发病相关[3-9]。张海平等[10]研究发现具有自身免疫性的髓核组织一旦暴露于自身免疫系统中，髓核作为自身抗原可引起特异性自身免疫反应。另有研究发现辅助性T17细胞的特异性细胞因子白细胞介素17在退变的腰椎间盘组织中明显高于正常椎间盘组织，提示白细胞介素17 可能参与椎间盘退变的发病[11-17]。然而白细胞介素23/辅助性T17细胞炎症轴是否与腰椎间盘突出症的发生有密切关系，目前仍然不清楚。
该研究选取临床腰椎间盘突出患者、普通骨折患者的髓核样本以及两组患者的外周血样本，组织学检测髓核样本的炎症情况和白细胞介素23的表达，ELISA法检测髓核组织和外周血中细胞因子白细胞介素17、白细胞介素23、肿瘤坏死因子α水平，并进行Pearson相关性分析，探究脱出的髓核能否引起白细胞介素23和白细胞介素17的高表达，白细胞介素23/辅助性T17细胞轴是否参与腰椎间盘突出症的炎症反应和自身免疫反应，进而有助于深入探究腰椎间盘突出症的免疫学发病机制。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计体外原代细胞模型，组织标本数据分析采用两样本t检验及Pearson相关分析。
1.2 时间及地点实验于2019年1-10月在南通大学附属医院脊柱外科完成。
1.3 对象选取南通大学附属医院脊柱外科2019年1-10月收治确诊并手术的腰椎间盘突出症患者30例(试验组)，其中男16例，女14例；平均年龄48岁(37-66岁)；病程7个月-5年；L2/L3椎间隙1例，L3/L4椎间隙1例，L4/L5椎间隙15例，L5/S1椎间隙13例。所有患者均经过术前的临床、影像学检查确诊为腰椎间盘突出症，且有明确手术指征。
选取腰椎(L1-L5)骨折的年轻患者8例(对照组)，男5例，女3例；平均年龄28岁(18-35岁)。所有患者均有腰椎爆裂性骨折需行后路内固定加椎管减压植骨，手术时切除正常椎间盘组织，且术前经影像学检查证实椎间盘未退变，术中证实椎间盘组织含水丰富，无退变表现。
排除标准：①年龄在65岁以上，非妊娠或哺乳期妇女；②腰椎管狭窄伴腰椎滑脱或椎间盘纤维钙化；③合并有马尾神经损害；④肌力严重减退、足下垂者；⑤伴有严重的心脏病、糖尿病、高血压及肝、肾功能不全者；⑥伴有自身免疫性疾病、急慢性感染、全身代谢性疾病、肿瘤、精神类疾病。
根据国务院《医疗机构管理条例》规定，术前征得所有患者及家属同意并报医院伦理委员会批准。
1.4 实验试剂白细胞介素23兔抗人单克隆抗体(美国PLlabs公司)；HRP-Polymer anti-Mouse/Rabbit IHC Kit(福州迈新生物技术开发有限公司)；DAB-0031 DAB Kit(20×)(福州迈新生物技术开发有限公司)；96孔人白细胞介素17、白细胞介素23、肿瘤坏死因子α定量ELISA试剂盒(美国RapidBio Lab公司)。
1.5 方法
1.5.1 标本采集
(1)髓核标本的采集：均由经验丰富的脊柱外科医师主刀，行后路切开髓核摘除术。常规后正中入路，暴露相应节段的椎板及关节突关节。根据减压需要切除部分椎板或整块椎板，将硬膜囊及神经根牵开保护。试验组髓核组织标本为游离或脱出髓核组织；对照组髓核组织取自腰椎爆裂骨折需行椎间植骨融合节段的椎间盘。取得标本后生理盐水洗净血迹，剔除终板等杂质，留取纯粹的髓核组织。所有标本分为两部分，一部分用40 g/L多聚甲醛固定，待做苏木精-伊红染色和免疫组织化学染色用；另一部分装入冻藏管，编号后置于-80 ℃冰箱中保存，待做ELISA检测。
(2)外周血标本的采集：试验组及对照组患者确诊入院后未经输液等治疗前用抗凝管采集患者外周血5 mL，常温下静置，以3 000 r/min的速率离心15 min，取血清，与髓核标本对应编号，置于-80 ℃冰箱中保存待用。
1.5.2 石蜡切片、苏木精-伊红染色将髓核组织于40 g/L多聚甲醛固定24 h后取出，梯度乙醇脱水后石蜡包埋，切片厚度3.0-4.0 μm，切片于70 ℃烘箱烤片3 h，二甲苯脱蜡，各级乙醇水化，苏木精染色，PBS冲洗，伊红染色数秒，PBS冲洗，脱水，封固。光镜下观察髓核组织形态，拍照保存。
1.5.3 白细胞介素23免疫组织化学检测石蜡标本切片3.0-4.0 μm，37 ℃烘箱过夜，二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，PBS冲洗，滴加正常山羊血清封闭液，室温孵育10 min，滴加用PBS稀释的兔抗白细胞介素23一抗(稀释比例1∶50)，4 ℃冰箱过夜，隔日PBS清洗3次，滴加鼠抗兔IgG抗体-HRP(辣根过氧化酶)多聚体工作液，37 ℃水浴锅孵育2 h，PBS清洗3次，切片滴加DAB显色，苏木精染色，自来水充分冲洗，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固，显微镜下观察，拍照保存。
1.5.4 髓核制备匀浆 -80 ℃冰箱中取出髓核组织，室温下解冻，滤纸拭干后称质量。根据标本质量(单位：g)用移液管量取相应体积(单位：mL)的PBS(体积为组织质量9倍)于烧杯中。在烧杯中用眼科剪剪碎髓核组织，尽可能剪碎(于冰盒内进行)。将剪碎的组织倒入手动匀浆器反复研磨(于冰盒内进行)。研磨后液体使用超声粉碎机粉碎(注意避免温度过高)，并于微型漩涡混合仪上混匀，制备成匀浆。制备好的匀浆分装EP管后，在4 ℃下以10 000 r/min的速率离心5 min，取其上清液。
1.5.5 ELISA法检测髓核及血清中白细胞介素17、白细胞介素23和肿瘤坏死因子α水平两组患者等量髓核组织匀浆及血清，样本稀释5倍，设置标准品孔和样本孔，标准品孔逐个加不同浓度的标准品50 μL，样本孔加待测样本10 μL与样本稀释液40 μL，标准品孔和样本孔中每孔加入HRP标记的检测抗体100 μL，37 ℃恒温箱中放置1 h，反复洗涤5次，每孔加入底物A、B各 50 μL，37 ℃避光孵育15 min，每孔加终止液50 μL，在15 min内于450 nm波长下测定每孔吸光度值，反复测量3次。
1.6 主要观察指标 ①苏木精-伊红染色观察腰椎间盘髓核组织学形态；②免疫组化染色观察腰椎间盘髓核组织中白细胞介素23的表达；③ELISA法检测髓核组织和外周血中白细胞介素17、白细胞介素23及肿瘤坏死因子α水平；④退变髓核组织中白细胞介素17、白细胞介素23及肿瘤坏死因子α表达水平的相关性。
1.7 统计学分析原始数据输入SPSS 19.0统计软件包，采用两样本t检验比较两组髓核组织和外周血中白细胞介素17、白细胞介素23、肿瘤坏死因子α水平以及髓核组织中白细胞介素23阳性表达率，设定显著差异水平为P < 0.05，同时用Pearson相关检验进行退变髓核组织3种细胞因子表达的相关性分析。

讨论

腰椎间盘突出症是临床常见腰椎退行性疾病，腰背痛和坐骨神经痛为最常见的临床症状。目前腰椎间盘突出症治疗方法主要遵循休息、牵引、药物治疗、微创治疗及减压融合手术等阶梯治疗方案。然而，上述治疗措施大多是通过解除神经根的压迫来实现的。众多研究表明，腰椎间盘突出的髓核组织周围发生自身免疫性炎症反应才是造成疼痛症状的主要原因[18-20]。
椎间盘包含髓核、纤维坏和终板，正常的髓核组织被包裹在椎间盘中心，缺少血管浸润，具备成为自身抗原的潜质。SPILIOPOULOU等[18]将接受手术的腰椎间盘突出症患者的髓核、血清和脑脊液作为研究样本，首次采用速率散色比浊法测定IgG和IgM抗体水平，结果发现突出椎间盘中IgG、IgM抗体水平明显升高，他认为这间接表明了突出的髓核和神经根之间发生了炎症反应，它们可能以某种方式引起坐骨神经痛。GEISS等[19]将猪自身的椎间盘装入钛笼后植入猪的皮下，并以空钛笼植入作为对照，数日后用免疫组织化学法和流式细胞仪检测发现，含有髓核的钛笼组织周围活化的T细胞和B细胞明显高于空钛笼组，结果说明髓核暴露时会引起T、B细胞的活化，这从另一个角度证明了髓核一旦暴露在自体免疫系统后会后生自身免疫反应。
MABUCHI等[20]敲除大鼠mPGES-1基因并切断L5神经来制作神经痛动物模型，超过1周发现大鼠没有表现出机械性痛觉过敏和热痛觉过敏，证实了mPGES-1产生前列腺素E2参与神经性疼痛。肿瘤坏死因子α是研究最早也是最多的一种重要的炎症因子，具有广泛的生物学活性[21-24]。EVANS等[25]发现肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β参与了多种人类炎症性疾病的发病过程。TAKAHASHI等[26]最早发现退变椎间盘组织纤维环和髓核中的软骨细胞可以分泌白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α等细胞因子。赵太茂等[27]将术中取得的腰椎间盘突出症患者椎间盘置于含肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β的培养液中培养72 h，结果发现培养液中前列腺素E2明显升高。他们认为TAKAHASHI等[26]的报道有误，肿瘤坏死因子α与腰椎间盘突出症患者的神经痛有关系。
CD4+辅助性T细胞在免疫应答和炎症中发挥着重要的作用。在自身免疫小鼠模型中诱导CD4+辅助性T细胞产生白细胞介素17，已被广泛研究[28]。1991年MAGGI等[29]证明了人和鼠一样，辅助性T细胞可以分为分泌干扰素γ、白细胞介素2和肿瘤坏死因子β促进细胞免疫的辅助性T1细胞，分泌白细胞介素4、白细胞介素5、白细胞介素6、白细胞介素10及白细胞介素13促进体液免疫的辅助性T2细胞。过去人们认为自身免疫反应是辅助性T1细胞和辅助性T2细胞之间的平衡被打破所导致的。有报道称，当髓核暴露在免疫系统中其作为自身抗原会促使其表面辅助性T细胞分化成以分泌白细胞介素4为主的辅助性T2细胞[30]。腰椎间盘突出症患者体内的辅助性T1细胞/辅助性T2细胞平衡被打破，呈向“辅助性T2细胞漂移”状态。辅助性T17细胞是新近发现的一类CD4+辅助性T细胞亚群，它主要分泌白细胞介素17、白细胞介素6、白细胞介素21、白细胞介素23和肿瘤坏死因子α等，而不产生干扰素γ和白细胞介素4[31-32]。辅助性T17细胞与辅助性T1细胞、辅助性T2细胞、调节性T细胞有着完全不同的分化和调节机制，有研究表明，辅助性T17细胞在分化和功能上可能与调节性T细胞相互抑制，维持平衡[33]。白细胞介素23是白细胞介素12家族的一个成员，由p40和p19亚基组成，结构上与白细胞介素12共用白细胞介素12 p40亚基，主要由活化的树突状细胞产生[34]。白细胞介素23在辅助性T17细胞数量扩增、存活以及免疫应答过程中是必需的[35-36]。白细胞介素23可以促进辅助性T17细胞产生大量白细胞介素17炎症因子，白细胞介素17 能够诱导促炎细胞因子、趋化因子和基质金属蛋白酶的表达，引起炎性细胞浸润和组织破坏[37]。有研究表明，白细胞介素17与肿瘤坏死因子α产生协同作用促进粒-巨噬细胞集落刺激因子、白细胞介素8、白细胞介素6 等产生，且这种协同作用远超过两者各自的作用[38-39]。
该研究中，由于考虑要获取绝对意义上正常的椎间盘组织比较困难，因此选取胸腰椎爆裂性骨折患者行后路植骨内固定术所摘除的髓核为对照组。结合前人的研究资料并通过影像学及病理学等手段证明这种髓核比较接近正常人的髓核，故可以作为对照组。前期实验通过对髓核组织行苏木精-伊红染色，发现髓核组织中普遍细胞密度低，分布不均，突出的髓核有炎症浸润。随后采用免疫组织化学法检测两组髓核组织白细胞介素23表达，发现试验组白细胞介素23阳性率明显高于对照组。因此，作者认为髓核突出后可以引起辅助性T17细胞分泌白细胞介素23，白细胞介素23可能参与腰椎间盘突出症的炎症反应和自身免疫反应。最后用ELISA法检测两组髓核组织和外周血中细胞因子白细胞介素17、白细胞介素23和肿瘤坏死因子α水平，结果发现试验组髓核组织及外周血中白细胞介素17、白细胞介素23和肿瘤坏死因子α水平均明显高于对照组。对3种因子进行相关性分析，发现它们两两均呈显著正相关，因此推测白细胞介素23/辅助性T17细胞轴可能与坐骨神经痛有关联。当髓核脱出暴露在免疫系统下，其作为自身抗原可能促使其表面辅助性T细胞分化成辅助性T17细胞，辅助性T17细胞产生细胞因子白细胞介素17、白细胞介素23、肿瘤坏死因子α等，白细胞介素23再促进辅助性T17细胞进一步分泌白细胞介素17、肿瘤坏死因子α等协同白细胞介素17促进各种炎症递质产生，从而介导炎症反应和自身免疫反应。即白细胞介素23/辅助性T17细胞轴很可能参与了腰椎间盘突出症的炎症反应和自身免疫反应，引起坐骨神经痛等症状。
总之，椎间盘突出的髓核与机体的免疫机制相接触，髓核基质中的一些成分便成为自身抗原，诱导静息辅助性T细胞分化，发生自身免疫反应、炎症反应等从而导致坐骨神经痛。设想是否可以通过抑制白细胞介素23/辅助性T17细胞轴改变或调节自身免疫发应，减少炎症产生，这或许可以为今后腰椎间盘突出症的免疫治疗提供一个思路。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

白细胞介素23/辅助性T17细胞轴与腰椎间盘突出症的相关性

Correlation between interleukin 23/helper T17 cell axis and lumbar disc herniation

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 9

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	项鑫健, 柳芳, 吴亮亮, 贾大平, 陶越, 赵政男, 赵宇. 高剂量维生素C促进大鼠自体脂肪移植成活[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1242-1246.
[2]	唐文静, 伍思源, 杨晨, 陶希. 炎症反应与卒中后抑郁[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1278-1285.
[3]	马超, 王飞, 刘晓民, 王子昀, 许奎, 杨文东, 冯伟. 应用体表地形图量化腰椎间盘突出症腰型客观化指标：下腰曲线弹性固定转折点的三维成角[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(6): 924-928.
[4]	何俊君, 黄泽灵, 洪振强. 阳和汤对早期膝骨关节炎模型兔滑膜炎症的影响[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(5): 694-699.
[5]	刘进, 李振, 郝慧琴, 王泽, 赵彩虹, 芦文静. 二妙散水提物调控胶原诱导性关节炎大鼠成纤维样滑膜细胞增殖、迁移和炎性因子的表达[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(5): 688-693.
[6]	刘伊依, 邱俊强, 衣龙燕, 周财亮. 接受抗阻训练中老年人白细胞介素6与C-反应蛋白变化的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(5): 804-812.
[7]	王楠, 钱宇章, 谢林. 不同针刺方法治疗腰椎间盘突出症的网状Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(5): 813-820.
[8]	耿元文, 林琴琴, 李若明, 唐韶慨, 王柏慧, 田振军. 一次性力竭运动模型促进大鼠肾脏NOD样受体蛋白3炎性小体的表达[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(2): 190-196.
[9]	李安安, 姜涛, 詹敏, 蔡宇宁, 宋敏, 李聪聪, 林文政, 张家媛, 刘文刚. 参苓白术散治疗膝骨关节炎作用机制的网络药理学和分子对接技术分析[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(2): 197-204.
[10]	李万海, 董宇航, 施超, 姜亦瑶, 刘戈, 刁文杰, 吴振. 川芎嗪呋咱拼合物保护肾缺血再灌注损伤模型小鼠的作用及机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(2): 205-210.
[11]	刘杰, 王敏. 程序性细胞坏死通路在根尖周炎小鼠模型发生发展中的变化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(14): 2179-2183.
[12]	胡益华, 阳春华, 卢圆圆, 孙德毅. 电针联合雷公藤红素干预膝骨关节炎模型小鼠滑膜和滑膜液中转化生长因子β的表达变化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(14): 2252-2258.
[13]	李传鸿, 俞兴, 杨永栋, 赵赫. 脊髓损伤中的小胶质细胞：M1/M2表型极化发挥神经毒性/神经保护作用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(14): 2265-2272.
[14]	钟玉兰, 周湘乡, 淦鑫. 骨髓间充质干细胞治疗慢性阻塞性肺疾病中的Wnt/β-catenin信号通路[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(13): 1979-1984.
[15]	赵吉玲, 彭漪, 彭智勇, 余国龙. 人脐血间充质干细胞分泌生物活性因子肿瘤坏死因子α-刺激基因-6蛋白对小鼠骨髓来源巨噬细胞亚型转化的影响[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(13): 2012-2019.