骨髓间充质干细胞治疗慢性阻塞性肺疾病中的Wnt/β-catenin信号通路

doi:10.12307/2022.321

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (13): 1979-1984.doi: 10.12307/2022.321

• 骨髓干细胞 bone marrow stem cells • 上一篇下一篇

骨髓间充质干细胞治疗慢性阻塞性肺疾病中的Wnt/β-catenin信号通路

钟玉兰1，周湘乡1，淦鑫2

1江西省胸科医院，江西省南昌市 330006；2南昌大学第一附属医院呼吸与危重症医学科，江西省南昌市 330006

收稿日期:2020-10-19 修回日期:2020-10-22 接受日期:2020-12-14 出版日期:2022-05-08 发布日期:2021-12-18
通讯作者: 淦鑫，博士，主任医师，南昌大学第一附属医院呼吸与危重症医学科，江西省南昌市 330006
作者简介:钟玉兰，女，1992年生，江西省安远县人，汉族，2019年南昌大学毕业，硕士，医师，主要从事慢性阻塞性肺疾病与干细胞的研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目 (81660009，81260004)，项目负责人：淦鑫；江西省自然科学基金 (20192BAB215002)，项目参与人：淦鑫

Wnt/beta-catenin signaling pathway in the treatment of chronic obstructive pulmonary disease with bone marrow mesenchymal stem cells

Zhong Yulan1, Zhou Xiangxiang1, Gan Xin2

1Jiangxi Provincial Chest Hospital, Nanchang 330006, Jiangxi Province, China; 2Department of Respiratory and Critical Care Medicine, First Affiliated Hospital of Nanchang University, Nanchang 330006, Jiangxi Province, China

Received:2020-10-19 Revised:2020-10-22 Accepted:2020-12-14 Online:2022-05-08 Published:2021-12-18
Contact: Gan Xin, MD, Chief physician, Department of Respiratory and Critical Care Medicine, First Affiliated Hospital of Nanchang University, Nanchang 330006, Jiangxi Province, China
About author:Zhong Yulan, Master, Physician, Jiangxi Provincial Chest Hospital, Nanchang 330006, Jiangxi Province, China
Supported by:
National Natural Science Foundation of China, No. 81660009, 81260004 (to GX); Natural Science Foundation of Jiangxi Province, No. 20192BAB215002 (to GX)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
慢性阻塞性肺疾病：是一种累及气道、肺泡和微血管的进行性炎症性疾病，炎性细胞释放多种细胞因子和炎症递质，进一步破坏肺结构，导致肺气肿，外周气道炎症和水肿，黏液过度分泌和纤维化，引起气道狭窄，气流阻力增加。
肿瘤坏死因子α：主要是由脂多糖刺激巨噬细胞而分泌的具有多种生物活性的炎性细胞因子，肿瘤坏死因子α可促进炎性细胞黏附、游走和浸润，破坏溶酶体，释放水解酶，从而损伤肺泡上皮细胞，破坏肺组织结构。

背景：骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs)治疗呼吸系统疾病具有广泛的应用前景，近年来研究显示Wnt/β-catenin信号通路在调控BMSCs定向分化及促进旁分泌方面起重要作用。
目的：探讨激活Wnt/β-catenin信号通路对BMSCs移植治疗慢性阻塞性肺疾病的影响。
方法：采用全骨髓贴壁法提取大鼠BMSCs，用Wnt3a慢病毒转染大鼠BMSCs。采用气管内注入脂多糖联合烟熏法构建慢性阻塞性肺疾病大鼠模型，造模完成后经尾静脉植入BMSCs、GFP-BMSCs、Wnt3a-BMSCs，模型组和正常对照组经尾静脉注入PBS，分别在第7，14，28天处死各组大鼠，苏木精-伊红染色观察肺组织病理改变，ELISA 检测动脉血中白细胞介素10、肿瘤坏死因子α水平。
结果与结论：①苏木精-伊红染色病理结果显示：3个BMSCs移植组较模型组病理改变明显改善，其中Wnt3a-BMSCs组改善相对明显；②在相同时间点，3个BMSCs移植组动脉血中肿瘤坏死因子α水平低于模型组(均P < 0.05)，其中BMSCs组、GFP-BMSCs组差别不大，但Wnt3a-BMSCs组明显低于其他两组(P < 0.05)；3个BMSCs移植组动脉血中白细胞介素10水平高于模型组(均P < 0.05)，其中BMSCs组、GFP-BMSCs组差别不大，但Wnt3a-BMSCs组明显高于较其他两组(P < 0.05)；③结果表明，过表达Wnt3a(Wnt/β-catenin信号通路激活)的BMSCs植入慢性阻塞性肺疾病大鼠体内，可显著改善肺组织病理形态，提高抗炎因子白细胞介素10水平，降低促炎因子肿瘤坏死因子α水平，增强BMSCs的抗炎作用。
缩略语：骨髓间充质干细胞：bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs

https://orcid.org/0000-0002-2459-7150(钟玉兰)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 骨髓间充质干细胞, 慢性阻塞性肺疾病, Wnt3a, Wnt/? -catenin信号通路, 白细胞介素10, 肿瘤坏死因子α

Abstract: BACKGROUND: Bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) have a wide application prospect for the treatment of respiratory diseases. In recent years, studies have shown that the Wnt/β-catenin signaling pathway plays an important role in regulating the directional differentiation of BMSCs and promoting paracrine function.
OBJECTIVE: To investigate the effect of Wnt/β-catenin signaling pathway activation on chronic obstructive pulmonary disease after transplantation with BMSCs.
METHODS: Whole bone marrow adherence method was used to extract rat BMSCs. Rat BMSCs were infected with Wnt3a lentivirus. The chronic obstructive pulmonary disease rat model was constructed by intratracheal infusion of lipopolysaccharide combined with smoking method. After model establishment, BMSCs, GFP-BMSCs, and Wnt3a-BMSCs were implanted through the tail vein. PBS was injected through the tail vein in the model and normal control groups. The rats in each group were sacrificed at 7, 14, and 28 days. The pathological changes of rat lung tissue were observed by hematoxylin-eosin staining. The levels of interleukin-10 and tumor necrosis factor alpha in arterial blood were detected by ELISA.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The pathological results of hematoxylin-eosin staining showed that the pathological changes of the three BMSCs transplantation groups were significantly improved compared with the model group, and the Wnt3a-BMSCs group improved significantly. (2) At the same time point, the arterial blood tumor necrosis factor alpha level was lower in the three BMSCs transplantation groups than that in the model group (all P < 0.05), and there was little difference between the BMSCs group and the GFP-BMSCs group. However, the level in the Wnt3a-BMSCs group was relatively lower than that in the other two groups (P < 0.05). Arterial blood interleukin-10 level was higher in the three BMSCs transplantation groups than that in the model group (all P < 0.05), among which there was little difference between the BMSCs group and the GFP-BMSCs group. However, the level in the Wnt3a-BMSCs group was significantly higher than that in the other two groups (P < 0.05). (3) The results show that transplantation of BMSCs overexpressing Wnt3a (after Wnt/β-catenin signaling pathway activation) into chronic obstructive pulmonary disease rats can significantly improve the pathological changes of lung tissue, increase the expression of anti-inflammatory factor interleukin-10 and reduce the expression of tumor necrosis factor alpha, and enhance the anti-inflammatory effect of BMSCs.

Key words: stem cells, bone marrow mesenchymal stem cells, chronic obstructive pulmonary disease, Wnt3a, Wnt/?-catenin signaling pathway, interleukin-10, tumor necrosis factor alpha

中图分类号:

钟玉兰, 周湘乡, 淦鑫. 骨髓间充质干细胞治疗慢性阻塞性肺疾病中的Wnt/β-catenin信号通路[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(13): 1979-1984.

Zhong Yulan, Zhou Xiangxiang, Gan Xin. Wnt/beta-catenin signaling pathway in the treatment of chronic obstructive pulmonary disease with bone marrow mesenchymal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(13): 1979-1984.

图/表（结果） 9

2.1 BMSCs的形态、鉴定和转染结果培养24 h后可见少量细胞贴壁，散在分布，大部分呈圆形，透亮，少量呈梭形，48 h后梭形细胞团状聚集，72 h后细胞呈向心性生长，7 d后细胞聚集呈现“漩涡状”，见图1。流式细胞学显示CD29(94.7%)、CD44(70.6%)高表达，而CD34(0.16%)、CD45(0.86%)表达量较低，见图2，表明采用全骨髓贴壁法提取的细胞为BMSCs。Wnt3a转染后在荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白表达，提示Wnt3a慢病毒成功转染BMSCs，见图3。

2.2 Western blot、qPCR检测转染后BMSCs中Wnt3a的表达 LV-GFP组、空白对照组无Wnt3a蛋白显影，而LV-Wnt3a组可见明显蛋白表达，见图4A，B。LV-GFP组、空白对照组Wnt3a mRNA表达量较低，而LV-Wnt3a组Wnt3a mRNA表达量较高，与其他两组比较差异有非常显著性意义(P < 0.01)，见图4C。

2.3 各组BMSCs在肺组织中的定植肺组织冰冻切片可见BMSCs组、GFP-BMSCs组、Wnt3a-BMSCs组均可见CM-Dil染色和GFP荧光阳性，提示BMSCs移植后在肺部定植，见图5。

2.4 慢性阻塞性肺疾病造模结果及BMSCs移植后肺组织病理学改变正常对照组：肺泡大小均匀，肺泡壁无明显增厚，肺泡腔干净、匀称，周围未见明显炎细胞浸润及部分肺间隔断裂；模型组：肺泡间隔可见炎细胞浸润及部分肺间隔断裂，肺泡腔扩大且大小不一，相同视野内肺泡数目减少，小血管管壁增厚，见图6，说明造模成功；BMSCs组、GFP-BMSCs组、Wnt3a-BMSCs组：相同视野下，各组肺泡腔不规则扩大，仍有部分肺泡间隔断裂伴肺大疱形成，肺间质血管管壁及气管管壁仍有少数炎性细胞浸润。BMSCs组、GFP-BMSCs组之间无明显差异；与BMSCs组、GFP-BMSCs组比较，Wnt3a-BMSCs组病变较轻，见图7。

2.5 各组大鼠血清中肿瘤坏死因子α、白细胞介素10水平在相同时间点，BMSCs组、GFP-BMSCs组、Wnt3a-BMSCs组动脉血中白细胞介素10水平高于模型组，肿瘤坏死因子α水平低于模型组(均P < 0.05)；BMSCs组、GFP-BMSCs组动脉血中白细胞介素10、肿瘤坏死因子α水平差别不大，但Wnt3a-BMSCs组白细胞介素10水平高于BMSCs组、GFP-BMSCs组，肿瘤坏死因子α水平低于BMSCs组、GFP-BMSCs组，差异有显著性意义(均P < 0.05)；随着时间推移，BMSCs组、GFP-BMSCs组、Wnt3a-BMSCs组动脉血中白细胞介素10水平均升高，肿瘤坏死因子α表达水平降低，提示抗炎作用增强，见图8。

2.6 生物相容性 BMSCs因其免疫抑制特性，具有良好的生物相容性。

参考文献

[1] REGAN EA, LYNCH DA, CURRAN-EVERETT D, et al. Clinical and Radiologic Disease in Smokers With Normal Spirometry. JAMA Intern Med. 2015;175(9):1539-1549.
[2] PIERÓG J, FYTIANOS K, TAMÒ L, et al. Stem cell secretome attenuates acute rejection in rat lung allotransplant. Interact Cardiovasc Thorac Surg. 2019;28(5):812-818.
[3] CAHILL EF, TOBIN LM, CARTY F, et al. Jagged-1 is required for the expansion of CD4+ CD25+ FoxP3+ regulatory T cells and tolerogenic dendritic cells by murine mesenchymal stromal cells. Stem Cell Res Ther. 2015;6(1):19.
[4] WANG K, LI Y, ZHU T, et al. Overexpression of c-Met in bone marrow mesenchymal stem cells improves their effectiveness in homing and repair of acute liver failure. Stem Cell Res Ther. 2017;8(1):162.
[5] CHEN X, ZHANG Y, WANG W, et al. Mesenchymal Stem Cells Modified with Heme Oxygenase-1 Have Enhanced Paracrine Function and Attenuate Lipopolysaccharide-Induced Inflammatory and Oxidative Damage in Pulmonary Microvascular Endothelial Cells. Cell Physiol Biochem. 2018;49(1):101-122.
[6] PIERÓG J, TAMO L, FAKIN R, et al. Bone marrow stem cells modified with human interleukin 10 attenuate acute rejection in rat lung allotransplantation. Eur J Cardiothorac Surg. 2018;53(1):194-200.
[7] KENNELLY H, MAHON BP, ENGLISH K. Human mesenchymal stromal cells exert HGF dependent cytoprotective effects in a human relevant pre-clinical model of COPD. Sci Rep. 2016;6:38207.
[8] CURLEY GF, HAYES M, ANSARI B, et al. Mesenchymal stem cells enhance recovery and repair following ventilator-induced lung injury in the rat. Thorax. 2012;67(6): 496-501.
[9] SHI Y, HU G, SU J, et al. Mesenchymal stem cells: a new strategy for immunosuppression and tissue repair. Cell Res. 2010;20(5):510-518.
[10] YANG J, JIA Z. Cell-based therapy in lung regenerative medicine. Regen Med Res. 2014;2(1):7.
[11] LIU AR, LIU L, CHEN S, et al. Activation of canonical wnt pathway promotes differentiation of mouse bone marrow-derived MSCs into type II alveolar epithelial cells, confers resistance to oxidative stress, and promotes their migration to injured lung tissue in vitro. J Cell Physiol. 2013;228(6):1270-1283.
[12] HOLLAND JD, KLAUS A, GARRATT AN, et al. Wnt signaling in stem and cancer stem cells. Curr Opin Cell Biol. 2013;25(2):254-264.
[13] FALCONI G, FABIANI E, FIANCHI L, et al. Impairment of PI3K/AKT and WNT/β-catenin pathways in bone marrow mesenchymal stem cells isolated from patients with myelodysplastic syndromes. Exp Hematol. 2016;44(1):75-83.e1-4.
[14] 吴华拉,周湘乡,钟玉兰,等. 碱性成纤维细胞生长因子转染骨髓间充质干细胞移植治疗慢性阻塞性肺疾病的作用及机制[J].中国组织工程研究,2019, 23(21):3378-3385.
[15] CHANG C, GUO Z, SHEN N, et al. Dynamics of inflammation resolution and symptom recovery during AECOPD treatment. Sci Rep. 2014;4:5516.
[16] RABE KF, WATZ H. Chronic obstructive pulmonary disease. Lancet. 2017;389 (10082):1931-1940.
[17] CHEN M, HUANG Z, BI H, et al. Effects of bone marrow‑derived mesenchymal stem cell transplantation on chronic obstructive pulmonary disease/obstructive sleep apnea overlap syndrome in rats. Mol Med Rep. 2019;20(5):4665-4673.
[18] LI X, XU J, LI P. Rat bone mesenchymal stem cells exert antiproliferative effects on nicotine‑exposed T cells via iNOS production. Mol Med Rep. 2020;21(5):2267-2275.
[19] NAJAR M, BOUHTIT F, MELKI R, et al. Mesenchymal Stromal Cell-Based Therapy: New Perspectives and Challenges. J Clin Med. 2019;8(5):626.
[20] BLÁZQUEZ R, SÁNCHEZ-MARGALLO FM, ÁLVAREZ V, et al. Surgical meshes coated with mesenchymal stem cells provide an anti-inflammatory environment by a M2 macrophage polarization. Acta Biomater. 2016;31:221-230.
[21] LI Q, CHEN X, LI J. Marrow-derived mesenchymal stem cells regulate the inflammatory response and repair alveolar type II epithelial cells in acute lung injury of rats. J Int Med Res. 2020;48(4):300060520909027.
[22] LI X, AN G, WANG Y, et al. Targeted migration of bone marrow mesenchymal stem cells inhibits silica-induced pulmonary fibrosis in rats. Stem Cell Res Ther. 2018;9(1):335.
[23] TANG Y, CAI QH, WANG YJ, et al. Protective effect of autophagy on endoplasmic reticulum stress induced apoptosis of alveolar epithelial cells in rat models of COPD. Biosci Rep. 2017;37(6):BSR20170803.
[24] GENG L, CHEN Z, REN H, et al. Effects of an early intervention using human amniotic epithelial cells in a COPD rat model. Pathol Res Pract. 2016;212(11): 1027-1033.
[25] STEINHART Z, ANGERS S. Wnt signaling in development and tissue homeostasis. Development. 2018;145(11):dev146589.
[26] CAI SX, LIU AR, HE HL, et al. Stable genetic alterations of β-catenin and ROR2 regulate the Wnt pathway, affect the fate of MSCs. J Cell Physiol. 2014;229(6): 791-800.
[27] CAI SX, LIU AR, CHEN S, et al. Activation of Wnt/β-catenin signalling promotes mesenchymal stem cells to repair injured alveolar epithelium induced by lipopolysaccharide in mice. Stem Cell Res Ther. 2015;6(1):65.
[28] PHINNEY DG, PITTENGER MF. Concise Review: MSC-Derived Exosomes for Cell-Free Therapy. Stem Cells. 2017;35(4):851-858.
[29] 钟玉兰,淦鑫.间充质干细胞源外泌体在肺部疾病中的应用与作用[J].中国组织工程研究,2019,23(13):2121-2126.
[30] ALIOTTA JM, PEREIRA M, WEN S, et al. Exosomes induce and reverse monocrotaline-induced pulmonary hypertension in mice. Cardiovasc Res. 2016; 110(3):319-330.
[31] MACHIN M, AMARAL AF, WIELSCHER M, et al. Systematic review of lung function and COPD with peripheral blood DNA methylation in population based studies. BMC Pulm Med. 2017;17(1):54.
[32] MALAVIYA R, LASKIN JD, LASKIN DL. Anti-TNFalpha therapy in inflammatory lung diseases. Pharmacol Ther. 2017;180:90-98.
[33] YAO Y, ZHOU J, DIAO X, et al. Association between tumor necrosis factor-alpha and chronic obstructive pulmonary disease: a systematic review and meta-analysis. Ther Adv Respir Dis. 2019;13:1753466619866096.
[34] DOLGACHEV VA, YU B, SUN L, et al. Interleukin 10 overexpression alters survival in the setting of gram-negative pneumonia following lung contusion. Shock. 2014; 41(4):301-310.
[35] YAGI H, SOTO-GUTIERREZ A, PAREKKADAN B, et al. Mesenchymal stem cells: Mechanisms of immunomodulation and homing. Cell Transplant. 2010;19(6): 667-679.
[36] PEDROSA M, GOMES J, LARANJEIRA P, et al. Immunomodulatory effect of human bone marrow-derived mesenchymal stromal/stem cells on peripheral blood T cells from rheumatoid arthritis patients. J Tissue Eng Regen Med. 2020;14(1):16-28.
[37] HE QQ, HE X, WANG YP, et al. Transplantation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells (BMSCs) improves brain ischemia-induced pulmonary injury in rats associated to TNF-α expression. Behav Brain Funct. 2016;12(1):9.
[38] ZHU H, XIONG Y, XIA Y, et al. Therapeutic Effects of Human Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cells in Acute Lung Injury Mice. Sci Rep. 2017;7:39889.

引言

材料方法

1.1 设计体外细胞培养体内移植实验，单因素方差分析及独立样本t检验。
1.2 时间及地点实验于2017年7月至2019年2月在南昌大学第一附属医院呼吸科重点实验室、病理科、实验动物科学部完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物选取6-8周龄健康雄性SD大鼠，体质量160-200 g，用于提取BMSCs；选取2月龄健康雄性SD大鼠160只，体质量200-230 g，随机取30只大鼠为正常对照组，其余130只大鼠采用气管内注入脂多糖联合熏烟的复合刺激法制备成慢性阻塞性肺疾病模型。实验动物均购买于南昌大学医学院实验动物科学部。
1.3.2 实验试剂 DMEM低糖培养基(Hyclone公司)；胎牛血清(美国Gibco公司)；Opti-MEM培养基(Gibco公司)；活细胞染色剂CM-Dil(美国Life Technologies公司)；兔抗大鼠Wnt3a抗体(美国Abcam公司)；流式抗体：抗大鼠CD34、CD29、CD45、CD90(美国eBioscience公司)；白沙牌香烟；特制烟箱(50 cm×40 cm×40 cm，侧壁有2个烟孔)；Western blot显色试剂盒(北京全式金)；Wnt3a慢病毒及阴性对照病毒(上海诺佰生物公司构建)。
1.4 实验方法
1.4.1 BMSCs的体外分离培养和鉴定依据课题组前期实验研究方法获取SD大鼠股骨骨髓混悬液[14]，24 h半换液，48 h全换液去除悬浮细胞、杂质，取第3代贴壁生长细胞，0.25%Trypsin-0.04%EDTA消化，4℃条件下1 000 r/min离心5 min，PBS清洗细胞2次，转入流式管中，各管分别加入单克隆抗体CD34、CD29、CD45、CD90，避光孵育30 min，离心弃去未结合的抗体，再用1 mL PBS清洗残留的抗体，1 000 r/min离心5 min后弃上清液，各管加入1 mL PBS重悬后转移至流式管中，送至南昌大学第一附属医院烧伤科流式仪上机检测。

1.4.2 载Wnt3a基因重组慢病毒转染BMSCs 第3代BMSCs以1×105/cm2密度接种至6孔板，待融合度达80%左右、细胞活力佳、生长状态较好时，可进行慢病毒转染，根据前期预实验确定慢病毒转染最佳感染复数值(MOI)为50，按MOI=50加入含体积分数为10%胎牛血清的低糖DMEM培养基和病毒量，设置LV-Wnt3a组和LV-GFP组(空病毒组)、MOCK组(空白对照组)。慢病毒转染4 h后每孔加入1 mL含体积分数为10%胎牛血清的低糖DMEM培养基，以减弱聚凝胺的细胞毒性，转染12 h后更换为含体积分数为10%胎牛血清的低糖DMEM培养基，48 h及72 h后在荧光显微镜下观察EGFP荧光表达。
1.4.3 Western blot法检测慢病毒转染后Wnt3a蛋白表达第3代BMSCs以1×105/孔接种于6孔板并随机分为3组，按上述实验步骤转染。转染后72 h，PBS洗涤3次，加入RIPA细胞裂解液(含蛋白酶抑制剂，两者比例为100∶1)，提取细胞蛋白，并按照BCA 法测定蛋白浓度，按照试剂盒说明配置10%分离胶，5%浓缩胶，蛋白样品以40 μg/孔加样，电泳后加入PVDF膜，转膜后再放至5%脱脂奶粉中封闭，置于摇床上室温1 h；封闭后加入抗鼠β-actin抗体孵育，置于4 ℃冰箱摇床上过夜，TBST洗涤后加入兔抗鼠Wnt3a抗体室温孵育1 h，TBST洗涤3次，按试剂盒说明配置曝光液(A液500 μL+B液500 μL+C液1 μL)，将膜放在保鲜膜上，将曝光液均匀涂在膜上放入曝光机，调节曝光时间即可。采用Image J软件分析条带灰度值，以目的条带与内参β-actin条带灰度值的比值表示目的蛋白的表达水平。实验重复3次。
1.4.4 qPCR检测慢病毒转染后Wnt3a mRNA表达第3代BMSCs以1×105/孔接种于6孔板并随机分为3组，按上述实验步骤转染。转染后72 h，加入TRIZOL进行裂解，提取RNA，检测RNA浓度，配置反转录反应体系，Rat β-actin正链：5'-CAC GAT GGA GGG GCC GGA CTC ATC -3'；反链：5'- TAA AGA CCT CTA TGC CAA CAC AGT -3'。Rat Wnt3a正链：5'-GAG TCA GCC TTT GTC CAT GC-3'；反链：5'- GCC TCA TTG TTG TGA CGG TT-3'，反转录得到cDNA后置于-80 ℃保存。按照实时荧光定量PCR反应配置体系，50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，40 cycles进行扩增。绘制熔解曲线，最终数据以2-ΔΔCt进行分析。
1.4.5 慢性阻塞性肺疾病大鼠模型的构建及实验分组选取健康2月龄SD大鼠160只，随机取30只大鼠为正常对照组，不做任何干预，正常饲养，其余130只大鼠采用脂多糖联合熏烟的复合刺激法制备成慢性阻塞性肺疾病模型，分别在第1，14天时将大鼠用0.3%戊巴比妥(10 mL/kg)腹腔注射麻醉后，将其固定于大鼠固定板上，暴露声门，缓慢注入1 g/L脂多糖0.3 mL，补入少量空气，随后将大鼠左右旋转，使脂多糖均匀分布两肺；第2-30天(除第14天)将大鼠放入自制的熏烟箱内，点燃白沙牌香烟，2次/d，间隔8 h，每次40 min。造模结束后随机抽取5只造模大鼠，腹腔麻醉法处死，取出肺组织，在甲醛溶液中固定24-48 h，送至病理科进行肺组织包埋、切片及苏木精-伊红染色。
将造模成功慢性阻塞性肺疾病大鼠分为4组：模型组、BMSCs组、GFP-BMSCs组、Wnt3a-BMSCs组，每组30只。上述分组后(包括正常对照组)立即进行下列干预，期间正常喂养。①正常对照组：健康SD大鼠经尾静脉注射1 mL PBS；②模型组：慢性阻塞性肺疾病模型大鼠经尾静脉注射1 mL PBS；③BMSCs组：造模后经尾静脉注入1×106(1 mL) CM-Dil标记的第3代BMSCs；④GFP-BMSCs组：造模后经尾静脉注入1×106(1 mL)CM-Dil标记的第3代GFP-BMSCs；⑤Wnt3a-BMSCs组：造模后经尾静脉注入1×106(1 mL)CM-Dil标记的第3代Wnt3a-BMSCs。干预后7，14，28 d收集动脉血进行血清炎性因子水平检测，处死动物取肺组织进行病理检查，每个时间点10只大鼠。
1.4.6 ELISA检测血清中炎性因子水平大鼠麻醉后暴露胸部，将肋骨剪断暴露心脏，用一次性采血针插入心脏，外接一次性采血管，收集的血液标本在室温下离心可见上清为淡黄色液体，超净台内移至EP管，按照ELISA试剂盒说明书配置试剂，加入各组样品反应结束后用酶标仪测定吸光度值。
1.4.7 BMSCs在肺部的定植留取的大鼠肺组织标本送至南昌大学第一附属医院制备冰冻组织切片，切片厚度约为5 μm，在荧光显微镜下观察CM-Dil染色情况。
1.4.8 大鼠肺组织病理检测留取的肺组织进行包埋、切片、苏木精-伊红染色等处理，显微镜下观察各组肺组织病理改变。
1.5 主要观察指标 ①BMSCs过表达Wnt3a的鉴定结果；②ELISA检测动脉血中白细胞介素10、肿瘤坏死因子α水平；③在荧光显微镜下观察冰冻切片CM-Dil染色阳性细胞分布情况；④大鼠肺组织病理改变。
1.6 统计学分析采用SPSS 24.0统计软件，计量数据以x±s表示，两组间均数使用独立样本t检验，检验水平为α=0.05，多组间均数采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，P < 0.05为差异有显著性意义，P < 0.01为差异有非常显著性意义。

讨论

慢性阻塞性肺疾病的主要特征为肺气肿、气道纤维化和慢性支气管炎，由环境和吸烟等多种因素引起，同时与个体的遗传易感性有关。慢性阻塞性肺疾病急性加重期是症状持续加重和肺功能下降的主要原因，反映了发病阶段广泛的炎症过程，是高死亡率和发病率的主要原因[15-16]，目前包括抗炎剂和支气管扩张剂在内的治疗虽然暂时缓解了患者的症状并延缓疾病的进展，但是至今没有一种方法可逆转慢性阻塞性肺疾病。
近年来，BMSCs移植治疗肺部疾病逐渐成为研究热点[17-19]。多数研究表明BMSCs移植对肺损伤的保护体现在2个方面：①植入的干细胞可以分化为主要的肺细胞(肺泡上皮细胞和血管内皮细胞)，在修复受损组织中发挥作用；②植入的干细胞发挥抗炎作用，并能保护和维持肺细胞完整性[20-22]。该实验研究了BMSCs在慢性阻塞性肺疾病大鼠体内对肺损伤的修复作用，参照文献[23-24]通过气管内注入脂多糖联合烟熏法制备慢性阻塞性肺疾病模型，肺组织苏木精-伊红染色显示肺泡壁断裂、肺气肿、周围炎症细胞浸润，符合慢性阻塞性肺疾病病理改变，表明造模成功。BMSCs移植有效改善了肺泡破坏，BMSCs在体内抑制促炎因子肿瘤坏死因子α的产生，促进抗炎因子白细胞介素10生成，表明BMSCs通过抑制炎症减轻了慢性阻塞性肺疾病大鼠肺损伤并改善了肺功能，并且Wnt3a的过表达加强了这种作用。
经典Wnt途径是调节细胞和生物体发育、分化和其他生理功能的基本途径。经典Wnt配体与卷曲蛋白(Fz)共受体和低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP)5或6结合，随后导致破坏复合物糖原合成酶激酶3β的合成下降、胞质中β-连环蛋白合成增加，然后转移到细胞核中以调节靶基因表达[25]，因而Wnt配体被认为是经典Wnt途径的关键信号启动因子。CAI等[26]研究证实了慢病毒载体转染可构建长期稳定表达Wnt基因的BMSCs。Wnt3a是Wnt家族中重要的一种配体，为了获得具有Wnt3a稳定且长期表达的BMSCs，该研究采用Wnt3a慢病毒载体转染大鼠BMSCs，Western blot及PCR检测表明Wnt3a慢病毒转染BMSCs后可显著增加Wnt3a的表达。研究表明，激活经典Wnt/β-连环蛋白途径促进肺组织修复，改善肺组织病理变化，并且增加了移植细胞在肺中的定植，促进了间充质干细胞向肺泡Ⅱ型上皮细胞的分化[27]。与此研究结果一致，该研究结果显示Wnt3a-BMSCs组大鼠肺部病理较BMSCs组、GFP-BMSCs组明显改善，表明Wnt3a基因激活经典Wnt信号通路有助于提高BMSCs对慢性阻塞性肺疾病大鼠肺组织的修复作用。然而，越来越多的证据表明BMSCs通过旁分泌作用修复受损细胞，已有学者提出间充质干细胞衍生的外泌体具有与其亲本细胞相似的功能而对受体细胞产生影响[28-30]，课题组前期实验结果表明BMSCs与慢性阻塞性肺疾病大鼠肺组织悬液共培养可诱导BMSCs向肺泡上皮细胞分化(实验数据暂未公开发表)，因此，经典Wnt通路激活提高BMSCs的修复能力是因为促进了BMSCs向肺泡上皮细胞分化，还是因为增加了BMSCs的旁分泌功能(如携带更多的蛋白质、miRNA等)，亦是两者皆有？需要完善下一步实验进行研究。
慢性阻塞性肺疾病的特征在于气道、肺实质和肺血管的慢性炎症，在这个过程中，活化的炎症细胞释放多种细胞因子和炎症递质，它们进一步破坏肺的结构和/或促进炎症[31]。
据报道，白细胞介素10可以通过抑制干扰素γ、白细胞介素2、白细胞介素12和白细胞介素18的产生来抑制巨噬细胞的活性，而炎症反应的调节对于维持免疫系统的平衡至关重要。肿瘤坏死因子α主要由巨噬细胞和单核细胞产生，可在感染和损伤部位刺激白细胞积聚，启动氧化应激，使细胞凋亡，也可能导致慢性阻塞性肺疾病患者最终出现恶病质[32-34]。一些研究发现BMSCs能广泛调节免疫细胞的活性、分泌多种抗炎细胞因子，如前列腺素E2、白细胞介素10、诱导型一氧化氮合酶和吲哚胺-2,3-双加氧酶[35]。此外，BMSCs通过T淋巴细胞抑制肿瘤坏死因子α的产生，改善肺功能，抑制急性肺损伤小鼠巨噬细胞的炎症反应，并通过增强白细胞介素10表达从而抑制炎症反应[36-38]。该研究已前述研究一致，BMSCs移植后可增加抗炎因子白细胞介素10水平，并降低促炎因子肿瘤坏死因子α的表达，进而抑制慢性阻塞性肺疾病大鼠体内的炎症反应，Wnt3a在BMSCs中的过表达加强了这种作用。然而，潜在的机制仍然不明确，需要进一步探索。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

骨髓间充质干细胞治疗慢性阻塞性肺疾病中的Wnt/β-catenin信号通路

Wnt/beta-catenin signaling pathway in the treatment of chronic obstructive pulmonary disease with bone marrow mesenchymal stem cells

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 9

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	肖豪, 刘静, 周君. 脉冲电磁场治疗绝经后骨质疏松症的研究进展[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1266-1271.
[2]	王景, 熊山, 曹金, 冯林伟, 王信. 白细胞介素3在骨代谢中的作用及机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1260-1265.
[3]	安维政, 何萧, 任帅, 刘建宇. 肌源干细胞在周围神经再生中的潜力[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1130-1136.
[4]	范一鸣, 刘方煜, 张洪宇, 李帅, 王岩松. 脊髓损伤后室管膜区内源性神经干细胞反应的系列问题[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1137-1142.
[5]	张璟琳, 冷敏, 朱博恒, 汪虹. 干细胞源外泌体促进糖尿病创面愈合的机制及应用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1113-1118.
[6]	黄晨玮, 费彦亢, 朱梦梅, 李鹏昊, 于兵. 谷胱甘肽在干细胞“干性”及调控中的重要作用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1119-1124.
[7]	惠小珊, 白京, 周思远, 王阶, 张金生, 何庆勇, 孟培培. 中医药调控干细胞诱导分化的理论机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1125-1129.
[8]	田川, 朱向情, 杨再玲, 鄢东海, 李晔, 王严影, 杨育坤, 何洁, 吕冠柯, 蔡学敏, 舒丽萍, 何志旭, 潘兴华. 骨髓间充质干细胞调控猕猴卵巢的衰老[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 985-991.
[9]	胡伟, 谢兴奇, 屠冠军. 骨髓间充质干细胞来源外泌体改善脊髓损伤后血脊髓屏障的完整性[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 992-998.
[10]	侯婧瑛, 郭天柱, 于萌蕾, 龙会宝, 吴浩. 缺氧预处理通过激活MALAT1靶向抑制miR-195促进骨髓间充质干细胞的生存和血管形成[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1005-1011.
[11]	周颖, 张幻, 廖松, 胡凡琦, 易静, 刘玉斌, 靳继德. 去铁胺联合干扰素γ预处理对人牙髓干细胞的免疫调节作用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1012-1019.
[12]	梁学振, 杨曦, 李嘉程, 骆帝, 许波, 李刚. 补肾活血胶囊介导Hedgehog信号通路调控大鼠骨髓间充质干细胞成骨成脂分化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1020-1026.
[13]	王继芳, 鲍祯, 乔亚红. miR-206调控小细胞肺癌干细胞EVI1基因表达及细胞生物学行为[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1027-1031.
[14]	刘峰, 彭宇环, 罗良平, 吴本清. 植物源性碱性成纤维细胞生长因子维持人胚胎干细胞的生长与分化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1032-1037.
[15]	闻丹丹, 李强, 沈才齐, 纪哲, 金培生. 外用红色诺卡氏菌细胞壁骨架提高脂肪间充质干细胞活性修复糖尿病创面[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1038-1044.