脂多糖预处理活化星形胶质细胞来源细胞外囊泡可保护神经元

doi:10.12307/2022.322

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (13): 1985-1992.doi: 10.12307/2022.322

• 干细胞外泌体 Stem cell exosomes • 上一篇下一篇

脂多糖预处理活化星形胶质细胞来源细胞外囊泡可保护神经元

孙海涛1，黄永辉1，龚爱华2，曹兴兵1，李震1

1江苏大学附属医院，江苏省镇江市 212000；2江苏大学，江苏省镇江市 212000

收稿日期:2020-10-16 修回日期:2020-10-20 接受日期:2020-11-28 出版日期:2022-05-08 发布日期:2021-12-18
通讯作者: 黄永辉，硕士，主任医师，江苏大学附属医院，江苏省镇江市 212000
作者简介:孙海涛，男，1994年生，江苏省宿迁市人，汉族，江苏大学在读硕士。
基金资助:
镇江市科技项目 (SH2020053)，项目负责人：黄永辉

Protective effect of lipopolysaccharide-preconditioned astrocyte extracellular vesicles on neurons

Sun Haitao1, Huang Yonghui1, Gong Aihua2, Cao Xingbing1, Li Zhen1

1Affiliated Hospital of Jiangsu University, Zhenjiang 212000, Jiangsu Province, China; 2Jiangsu University, Zhenjiang 212000, Jiangsu Province, China

Received:2020-10-16 Revised:2020-10-20 Accepted:2020-11-28 Online:2022-05-08 Published:2021-12-18
Contact: Huang Yonghui, Master, Chief physician, Affiliated Hospital of Jiangsu University, Zhenjiang 212000, Jiangsu Province, China
About author:Sun Haitao, Master candidate, Affiliated Hospital of Jiangsu University, Zhenjiang 212000, Jiangsu Province, China
Supported by:
the Scientific Research Project of Zhenjiang City, No. SH2020053 (to HYH)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
细胞外囊泡：由细胞分泌或者从细胞膜上脱落的双层膜结构囊泡状小体，直径从数十到数百纳米不等，主要由微囊泡和外泌体组成，携带与其细胞来源相关的多种蛋白质、脂类、核酸等，参与细胞间通讯、细胞迁移、血管新生和免疫调节等过程。
半数抑制浓度：即IC50，也称半抑制浓度或半抑制率，指某物质能将细胞生长、病毒复制等抑制50%所需的浓度。

背景：中枢神经系统疾病往往与神经元凋亡密切相关。星形胶质细胞与神经元联系紧密，来源于星形胶质细胞特别是活化星形胶质细胞的细胞外囊泡能否抑制谷氨酸所致损伤神经元的凋亡，发挥神经保护作用，尚未见报道。
目的：探究星形胶质细胞胞外囊泡(astrocyte extracellular vesicles，AS-EVs)和脂多糖预处理的星形胶质细胞胞外囊泡(LPS-preconditioned astrocyte extracellular vesicles，LPAS-EVs)对谷氨酸诱导神经元损伤的作用及可能机制。
方法：体外培养星形胶质细胞，并利用脂多糖预处理建立诱导活化模型，收集上清，超离法提取细胞外囊泡并进行蛋白定量和鉴定。利用PC12细胞进行初步实验，先探究AS-EVs及LPAS-EVs对PC12细胞增殖的影响，再建立谷氨酸诱导的PC12细胞和原代神经元损伤模型，实验分4组：PBS组(与EVs组同体积的PBS处理24 h)、谷氨酸组(10 mmol/L谷氨酸处理24 h)、AS-EVs组(200 mg/L AS-EVs预处理24 h+10 mmol/L谷氨酸处理24 h)、LPAS-EVs组(200 mg/L LPAS-EVs预处理24 h+10 mmol/L谷氨酸处理24 h)。CCK-8法检测PC12细胞存活率，Western blot检测细胞凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2表达。
结果与结论：①成功提取星形胶质细胞并建立脂多糖诱导的星形胶质细胞活化模型；②成功提取AS-EVs及LPAS-EVs，经鉴定符合细胞外囊泡形态学标准，相关标志物表达阳性；③AS-EVs及LPAS-EVs对PC12细胞增殖无明显影响；④与谷氨酸组相比，AS-EVs和LPAS-EVs能够提高PC12细胞存活率，且LPAS-EVs作用强于AS-EVs(P均< 0.05，n=3)；⑤AS-EVs和LPAS-EVs能够抑制促凋亡蛋白Bax的表达，促进抗凋亡蛋白Bcl-2的表达(P均< 0.01，n=3)，从而抑制PC12细胞和原代神经元凋亡，发挥神经保护作用，且LPAS-EVs的作用强于AS-EVs(P均< 0.05)；⑥结果表明，星形胶质细胞所释放的细胞外囊泡能够抑制谷氨酸所致损伤神经元的凋亡，具有神经保护作用，并且在受到脂多糖刺激后，这种作用得到增强。
缩略语：星形胶质细胞胞外囊泡：astrocyte extracellular vesicles，AS-EVs；脂多糖预处理的星形胶质细胞胞外囊泡：LPS-preconditioned astrocyte extracellular vesicles，LPAS-EVs

https://orcid.org/0000-0002-3821-2995(孙海涛)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 星形胶质细胞, 细胞外囊泡, 脂多糖, PC12细胞, 神经元, 凋亡

Abstract: BACKGROUND: Central nervous system diseases are often closely related to neuronal apoptosis. Astrocytes are closely related to neurons. It remains poorly understood whether extracellular vesicles, which are derived from astrocytes, especially activated astrocytes, may inhibit glutamate-induced neuronal apoptosis, thereby exerting neuroprotective effect.
OBJECTIVE: To investigate the role and possible mechanism of astrocyte extracellular vesicles (AS-EVs) and lipopolysaccharide-preconditioned astrocyte extracellular vesicles (LPAS-EVs) in glutamate-induced neuronal injury.
METHODS: Astrocyte was cultured in vitro and induced activation model was established by lipopolysaccharide. The supernatant of cells of two groups was collected and extracellular vesicles were extracted by hypervelocity centrifuges, and then identified. PC12 cells were used for preliminary experiments. First, we investigated the effects of AS-EVs and LPAS-EVs on PC12 cell proliferation, and then established the PC12 cells and primary neurons injury model induced by glutamate. Experiment was divided into four groups: PBS group (PBS of the same volume as EVs groups, 24 hours), glutamate group (10 mmol/L glutamate, 24 hours), AS-EVs group (200 mg/L AS-EVs, 24 hours + 10 mmol/L glutamate, 24 hours), and LPAS-EVs group (200 mg/L LPAS-EVs, 24 hours + 10 mmol/L glutamate, 24 hours). The survival rate of PC12 cells was determined by CCK-8 assay. Western blot assay was used to detect the expression of apoptosis related proteins Bax and Bcl-2.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Astrocyte was extracted and lipopolysaccharide-induced astrocyte activation model was established successfully. (2) AS-EVs and LPAS-EVs were successfully extracted, which met the morphological standards of extracellular vesicles and showed positive expression of related markers. (3) AS-EVs and LPAS-EVs had no significant effect on PC12 cells proliferation. (4) Compared with glutamate group, AS-EVs and LPAS-EVs could improve the survival rate of PC12 cells, and the effect of LPAS-EVs was stronger than that of AS-EVs (all P < 0.05, n=3). (5) AS-EVs and LPAS-EVs could inhibit the pro-apoptotic protein Bax expression and promote the expression of anti-apoptotic protein Bcl-2 (all P < 0.01, n=3), and then inhibited apoptosis of PC12 cells and primary neurons, thus playing a neuroprotective role, and the effect of LPAS-EVs was stronger than that of AS-EVs (all P < 0.05). (6) The results conclude that extracellular vesicles derived from astrocytes can inhibit the apoptosis of neurons injured by glutamate, which has a neuroprotective effect, and this effect is enhanced after being stimulated by lipopolysaccharide.

Key words: astrocytes, extracellular vesicles, lipopolysaccharide, PC12 cells, neurons, apoptosis

中图分类号:

孙海涛, 黄永辉, 龚爱华, 曹兴兵, 李震. 脂多糖预处理活化星形胶质细胞来源细胞外囊泡可保护神经元[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(13): 1985-1992.

Sun Haitao, Huang Yonghui, Gong Aihua, Cao Xingbing, Li Zhen. Protective effect of lipopolysaccharide-preconditioned astrocyte extracellular vesicles on neurons[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(13): 1985-1992.

图/表（结果） 6

2.1 星形胶质细胞的培养和鉴定如图1A-C所示，提取培养的星形胶质细胞呈典型不规则星状，并随着培养时间的延长，培养皿底部背景逐渐干净，细胞数量逐渐增多，纯度逐渐增高。如图1D-I所示，经免疫荧光检测，提取的细胞高表达星形胶质细胞特异标志胶质纤维酸性蛋白，且细胞纯度达到(96.11±1.52)%以上，达到后续实验的细胞纯度要求。

2.2 成功建立星形胶质细胞脂多糖活化模型脂多糖预处理24 h后的星形胶质细胞，与PBS组相比细胞形态发生了较为明显的变化，细胞呈现扁平状，细长突起增多，见图2A，B；qRT-PCR结果所示，脂多糖组星形胶质细胞的胶质纤维酸性蛋白和硫酸软骨素蛋白聚糖表达量较PBS组增高(P均< 0.01，n=3)，见图2C；Western blot结果也证实了这一结论(P均< 0.001，n=3)，见图2D，E。故使用200 μg/L脂多糖处理星形胶质细胞 24 h，能够使其活化，并且其活化状态能维持48 h，这为后续提取细胞上清中的LPAS-EVs打下基础。

2.3 AS-EVs及LPAS-EVs的鉴定 BCA蛋白检测结果显示：PBS组和脂多糖组同体积上清提取物中，脂多糖组蛋白浓度高于PBS组，侧面反映脂多糖处理活化后的星形胶质细胞所释放的细胞外囊泡较未被活化的增多(P < 0.05，n=3)，见图3A。透射电镜显示AS-EVs和LPAS-EVs形态近似圆形或椭圆形杯状，直径20-200 nm，见图3B，C。动态光粒子散射仪显示AS-EVs直径10-400 nm，平均(115±4.55) nm(n=3)，LPAS-EVs直径20-300 nm，平均 (127.67±3.09) nm(n=3)，见图3D，E，LPAS-EVs直径略大于AS-EVs。透射电镜及动态光粒子散射仪结果显示所提取的2种星形胶质细胞胞外囊泡均符合细胞外囊泡形态学标准，且二者形态大小存在差异，提示二者在功能上存在差异。Western blot检测结果显示，细胞外囊泡标记蛋白CD9、CD63和Tsg101阳性，见图3F。

2.4 AS-EVs及LPAS-EVs对PC12细胞增殖和对谷氨酸损伤PC12细胞存活率的影响 CCK-8分析不同浓度AS-EVs和LPAS-EVs对PC12细胞增殖的影响，结果显示，PC12细胞并不随着AS-EVs和LPAS-EVs浓度增加而出现明显的细胞增殖抑制或促进现象，即AS-EVs和LPAS-EVs对PC12细胞增殖没有明显的影响，见图4A。在谷氨酸损伤PC12细胞模型中，CCK-8结果显示，与0 mmol/L相比，随着谷氨酸浓度的增加，PC12细胞存活率降低，呈一定浓度依赖性。在谷氨酸浓度达到10 mmol/L时，PC12细胞存活率(51.28±2.21)%，显著低于0 mmol/L组。因此，选用10 mmol/L谷氨酸进行后续实验，见图4B，后续实验结果显示，与PBS组相比，谷氨酸组PC12细胞存活率明显降低(P < 0.001，n=3)，而AS-EVs组和LPAS-EVs组细胞存活率高于谷氨酸组(P均< 0.05，n=3)，且LPAS-EVs组高于AS-EVs组(P < 0.05，n=3)，见图4C。这些结果表明AS-EVs和LPAS-EVs对PC12细胞存活率的影响是通过改善细胞活性而非促进增殖来实现，且LPAS-EVs的作用强于AS-EVs。

2.5 AS-EVs及LPAS-EVs对谷氨酸损伤PC12细胞凋亡的影响 Western blot检测结果显示，与PBS组相比，谷氨酸组Bax蛋白表达水平明显升高，而Bcl-2表达水平降低(P均 < 0.001，n=3)；与谷氨酸组相比，AS-EVs组和LPAS-EVs组Bax 蛋白表达水平降低(P均 < 0.001，n=3)，LPAS-EVs组略低于AS-EVs组(P < 0.05，n=3)，而Bcl-2表达水平升高(P均 < 0.001，n=3)，LPAS-EVs组略高于AS-EVs组(P < 0.05，n=3)，见图5。结果提示AS-EVs和LPAS-EVs能够增强PC12细胞的抗凋亡作用，且LPAS-EVs的作用强于AS-EVs。

2.6 AS-EVs及LPAS-EVs对谷氨酸所致损伤神经元凋亡的影响成功提取神经元并进行纯化和鉴定，见图6A-C，利用10 mmol/L谷氨酸制作神经元损伤模型并分组。Western blot检测凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2的表达，得到了与“2.5”相似的结果，见图6D-F，与PBS组相比，谷氨酸组Bax蛋白表达水平明显升高，而Bcl-2表达水平降低(P均 < 0.001，n=3)；与谷氨酸组相比，AS-EVs组和LPAS-EVs组Bax蛋白表达水平降低，LPAS-EVs组略低于AS-EVs组(P均< 0.001，n=3)，而Bcl-2表达水平升高，LPAS-EVs组略高于AS-EVs组(P均 < 0.001，n=3)。结果提示AS-EVs和LPAS-EVs能够增强神经元的抗凋亡能力，且LPAS-EVs的作用强于AS-EVs。

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引言

随着人口的增加和老龄化，中枢神经系统疾病的发病率随之增长，所带来的治疗、康复和相关服务支出也日益增加[1]。神经元凋亡在中枢神经系统疾病，如脑梗死[2]、创伤性脊髓损伤[3]、阿尔茨海默病等疾病的发病中发挥着重要作用[4-5]。因此，抑制神经元凋亡、保护幸存神经元是预防和治疗中枢神经系统疾病的重要环节。
星形胶质细胞是中枢神经系统中数量最多、分布最广、体积最大的胶质细胞[6]，其分泌的多种物质参与调节中枢神经系统发育和稳态、突触发生以及认知功能等[7]。作为中枢神经系统，特别是神经元的营养支持细胞，星形胶质细胞能够通过乳酸穿梭[8-9]、谷氨酸-谷氨酰胺循环[10-11]、分泌细胞因子等途径[12-13]，直接或间接地与神经元建立密不可分的联系和信息交流，这使得其中一方状态发生变化，将会对另一方产生重要的影响[14]。星形胶质细胞在中枢神经系统中的重要地位及与神经元之间存在的联系和影响，为探究抑制神经元凋亡提供了切入点。
脑梗死、创伤性脊髓损伤、阿尔茨海默病等中枢神经系统疾病能够导致中枢神经系统发生急性或慢性炎症[2-4]，不仅加重了神经元的继发损伤，也会导致原本处于静息态的星形胶质细胞因炎症刺激发生适应性改变而被活化[15-16]。活化的星形胶质细胞通过上调胶质纤维酸性蛋白，分泌硫酸软骨素蛋白聚糖以及空间上相互缠结等形成胶质瘢痕[6]，限制局部炎症的早期扩散，并通过调节能量代谢、减轻兴奋性毒性、抗氧化应激等途径调控微环境而在神经组织修复中起到积极作用[17-18]。除此之外，活化后的星形胶质细胞能否通过其他途径抑制神经元的损伤凋亡，发挥神经保护作用，值得探究。
研究表明，炎症环境能够促进星形胶质细胞释放更多的细胞外囊泡[19]。细胞外囊泡是指从细胞膜上脱落或者由细胞分泌的双层膜结构的囊泡状小体，直径从数十到数百纳米不等。细胞外囊泡主要由微囊泡和外泌体组成，能够携带与细胞来源相关的多种蛋白质、脂类、核酸等，参与细胞间通讯、细胞迁移、血管新生和免疫调节等过程[20]，能够在中枢神经系统相关疾病修复中起到作用[21-22]。此外，由于细胞外囊泡来源母体细胞及母体细胞状态的不同，造就了细胞外囊泡的高度特异性，并在组织修复中起到不同的作用[23-24]。因此，来源于星形胶质细胞的细胞外囊泡 (astrocyte extracellular vesicles，AS-EVs)能否抑制神经元凋亡，特别是受炎症微环境影响而发生适应性变化的星形胶质细胞，其释放增多的细胞外囊泡对神经元是否具有保护作用值得探究。
该研究利用脂多糖诱导星形胶质细胞活化[25-26]，模拟炎症微环境下星形胶质细胞的激活，并获取脂多糖预处理诱导活化的星形胶质细胞来源细胞外囊泡(LPS-preconditioned astrocyte extracellular vesicles，LPAS-EVs)，然后利用PC12细胞和体外培养的原代神经元建立神经损伤模型[27-28]，以此来探究AS-EVs及LPAS-EVs对谷氨酸所致损伤神经元的作用及可能机制，为中枢神经系统疾病特别是高谷氨酸致神经元损伤相关疾病的抗神经元凋亡治疗提供新策略。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计体外细胞实验。
1.2 时间及地点实验于2019年3-10月在江苏大学医学院基础研究所2508实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验材料和试剂 PC12细胞(江苏大学医学院保存，原购于中国科学院细胞库)；RPMI 1640培养基、PBS(美国Hyclone公司)；青霉素-链霉素、胎牛血清(美国GIBCO公司)；0.25%胰蛋白酶(上海生兴公司)；DMEM/F-12培养基(以色列BI公司)；B27、谷氨酰胺、ECL发光液、PrimeScript RT试剂盒(美国Thermo Fisher Scientific公司)；L-多聚赖氨酸、牛血清白蛋白、脂多糖(美国SIGMA公司)；谷氨酸(美国Tocris Bioscience公司)；阿糖胞苷(上海麦克林生化科技有限公司)；TRIzol试剂(日本TaKaRa公司)；miScript SYBR Green PCR试剂盒(德国QIAGEN公司)；BCA试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)；CCK-8试剂盒(日本Dojindo Molecular Technologies公司)；引物(中国南京金斯瑞公司)；兔抗大鼠胶质纤维酸性蛋白、硫酸软骨素蛋白聚糖、神经元特异性烯醇化酶、β-Tubulin、CD9、CD63、Tsg101、Bax、Bcl-2抗体、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG抗体 (武汉ABclonal公司)；Cy3或FITC标记荧光二抗(美国Abcam公司)；OptimaTM L-90K Ultracentrifuge超速离心机、AvantiTM J-30I Centrifuge超高速离心机、AllegraTM X-12R Centrifuge高速离心机、配套离心管(美国贝克曼公司)；PVDF膜、0.22 μm无菌过滤器(美国密理博公司)；外科手术器械(上海医疗器械有限公司)；细胞超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)；CO2细胞培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)；移液枪头、可调微量移液器(德国Eppendorf公司)；相差倒置显微镜和荧光倒置显微镜(Olympus公司)；Western电泳仪(美国Bio-Rad公司)；Tecnai 12透射电镜(荷兰Philips公司)；动态光粒子散射仪(美国Wyatt Technology公司)；200目滤网(美国Corning公司)。
1.3.2 实验动物 SD大鼠10只，1 d龄，雌雄不限，由江苏大学动物实验中心提供。
1.4 实验方法
1.4.1 细胞培养
(1)PC12细胞的培养：PC12细胞培养于含体积分数为10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素的RPMI1640培养基中，在37 ℃、体积分数为5%CO2条件下培养，每两三天传代1次。取对数生长期的细胞(细胞贴壁80%)用于后续实验，96孔板种板密度为每孔2 000个/100 μL(增殖实验)或每孔1×104个/100 μL(损伤实验)，6孔板种板密度为每孔2×106个/2 mL。
(2)星形胶质细胞的分离、原代培养及传代：新生SD大鼠用体积分数为75%乙醇浸泡5 min，无菌操作取出大脑皮质，清洗剪碎，加入含EDTA的0.125%胰蛋白酶消化后用管口稍过火钝化的1 mL移液器轻柔吹打20下左右，加入提前配制的星形胶质细胞培养基(DMEM/F-12培养基+体积分数为10%胎牛血清+1%青霉素-链霉素)终止消化，再次轻柔吹打混匀后用200目滤网过滤，去除较大的组织块，移至15 mL离心管(1 000 r/min，5 min)离心过滤液，并使用上述培养液重悬沉淀，将适当量细胞混合液接种于多聚赖氨酸包被的6 cm细胞培养皿中，在37 ℃、体积分数为5%CO2培养箱中培养24 h后，使用星形胶质细胞培养液进行半量换液，之后每两三天半量换液，约8 d细胞铺满皿底。将培养皿置于培养箱摇床，200 r/min速度摇晃4 h以去除小胶质细胞等进行纯化。当细胞铺满皿底85%时进行消化传代。选用第3代星形胶质细胞进行后续实验。
(3)原代神经元的分离及培养：前期操作步骤同提取星形胶质细胞，将细胞混合液接种于6孔及24孔培养板，使用星形胶质细胞培养基于37 ℃、体积分数为5%CO2培养箱中培养24 h后，使用含阿糖胞苷(5 μmol/L)的神经元培养液(DMEM/F-12培养基+2%B27+1%谷氨酰胺+1%青霉素-链霉素)进行全量换液，抑制星形胶质细胞的生长，24 h后使用神经元培养液进行全量换液，之后每两三天半量换液，约6 d后细胞可用于后续实验。
1.4.2 星形胶质细胞及神经元的免疫荧光鉴定将24孔板中的细胞用PBST浸洗3次，每次5 min；用40 g/L多聚甲醛固定细胞15 min，PBST洗3次，每次5 min；PBS配制的0.3% Triton X-100室温通透 20 min，PBS洗3次，每次5 min；3% BSA室温封闭1 h；吸掉封闭液，滴加已稀释好兔抗大鼠胶质纤维酸性蛋白或神经元特异性烯醇化酶 IgG一抗(1∶200)，4 ℃孵育过夜；PBST洗3次，每次5 min，暗处滴加稀释好的Cy3或FITC标记荧光二抗(1∶100)，暗盒37 ℃孵育1 h，后续操作均在暗处，PBST洗3次，每次5 min；滴加DAPI 避光孵育5 min进行染核，PBST洗3次，每次5 min；吸净皿底液体，甘油封固后在荧光显微镜下观察采集图像，随机选取5个视野用于计数细胞纯度。
1.4.3 星形胶质细胞脂多糖活化模型的建立将前述纯化后的星形胶质细胞分为PBS组和脂多糖组，参考国内外相关实验及课题组经验，脂多糖质量浓度为200 μg/L[29-30]。脂多糖预处理24 h后，PBS清洗2次，换用含体积分数10%胎牛血清(120 000×g超速离心16 h，不含细胞外囊泡)的星形胶质细胞培养液继续培养48 h。使用qRT-PCR及Western blot检测星形胶质细胞活化标志蛋白(胶质纤维酸性蛋白和硫酸软骨素蛋白聚糖)表达，以验证是否成功活化星形胶质细胞，以及其活化状态能否维持48 h，收集细胞上清。
1.4.4 细胞外囊泡的提取及鉴定收集1.4.3两组细胞上清液各150 mL，采用超速离心法提取AS-EVs和LPAS-EVs。所有离心步骤均在4 ℃条件下完成, 其他步骤均在冰上操作。具体步骤如下：使用高速离心机先500×g离心10 min去除细胞，后2 000×g离心15 min去除细胞碎片；再使用超高速离心机10 000×g离心30 min去除亚细胞碎片；上清经0.22 μm无菌滤器过滤后使用超速离心机100 000×g离心3 h提取细胞外囊泡；PBS重悬离心后的沉淀，重复超速离心1次；最后用100 μL PBS重悬沉淀，保存于-80 ℃备用。
使用BCA试剂盒检测细胞外囊泡的蛋白浓度。透射电镜观察获得的细胞外囊泡形态：取适量细胞外囊泡重悬液轻轻滴于电镜专用铜网，然后用2%磷钨酸负染5-10 min，将处理好的标本置于透射电镜下进行观察、拍照。利用动态光粒子散射仪检测所获得的囊泡粒径大小。采用Western blot检测被封装到细胞外囊泡中的特异性标记CD9、CD63和Tsg101的表达：于细胞外囊泡中加入5×SDS上样缓冲液充分混匀后，置入沸水中5 min至蛋白变性，随后进行蛋白质的分离转膜等。
1.4.5 细胞外囊泡对PC12细胞增殖影响将PC12细胞以每孔2 000个/100 μL密度接种于96孔板中，于37 ℃、体积分数为5% CO2培养箱培养，待细胞贴壁后，用PBS洗3遍，随后将其分为AS-EVs和LPAS-EVs两大组，设置0(PBS)，0.1，0.5，1 g/L 4个浓度梯度，分别添加相应浓度细胞外囊泡，48 h后使用CCK-8试剂盒检测细胞增殖能力。每孔培养液替换为100 μL的工作液(90 μL无血清RPMI 1640培养基+10 μL CCK-8试剂)，并设3个空白对照孔，避光孵育2 h后，用酶标仪测定450 nm波长处吸光度值，并计算细胞相对增殖率。细胞增殖率=(实验组吸光度值-空白组吸光度值)/(对照组吸光度值-空白组吸光度值)。
1.4.6 PC12及神经元谷氨酸损伤模型的建立与分组
(1)谷氨酸半数抑制浓度的选择：PC12细胞以每孔2×104个/100 μL密度种于96孔板，用含不同浓度的谷氨酸(0，1，5，10，15 mmol/L)无血清培养基处理PC12细胞24 h，用CCK-8试剂盒分析细胞存活率；当谷氨酸浓度为10 mmol/L时，PC12细胞存活率降低至50%左右，即谷氨酸对PC12细胞的半数抑制浓度为10 mmol/L。参考已有报道及课题组经验[31]，选择此浓度建立谷氨酸损伤模型进行下一步实验。
(2)实验分组：将PC12细胞及神经元分别分为4组：①PBS组：先用含10%去细胞外囊泡胎牛血清(120 000×g超速离心16 h获得)的RPMI1640培养基培养24 h，再换含去细胞外囊泡胎牛血清的RPMI1640培养基+与其他组对应体积PBS培养24 h；②谷氨酸组：先用含去细胞外囊泡胎牛血清的RPMI1640培养基处理24 h，再换含10 mmol/L 谷氨酸、去细胞外囊泡胎牛血清的RPMI1640培养基处理24 h；③AS-EVs组：先用含200 mg/L AS-EVs、去细胞外囊泡胎牛血清的RPMI1640培养基预处理24 h，再换含10 mmol/L 谷氨酸、去细胞外囊泡胎牛血清的RPMI1640培养基处理24 h；④LPAS-EVs组：先用含200 mg/L LPAS-EVs、去细胞外囊泡胎牛血清的RPMI1640培养基预处理24 h，再换含10 mmol/L 谷氨酸、去细胞外囊泡胎牛血清的RPMI1640培养基处理24 h。
1.4.7 CCK-8法检测PC12细胞存活率将PC12细胞以每孔1×104个/100 μL密度接种于96孔板中，于37 ℃、体积分数为5% CO2培养箱培养，待细胞贴壁后，用PBS洗3遍，按“1.4.6”分组处理细胞，随后使用CCK-8试剂盒对PC12细胞存活率进行检测。细胞存活率(%)=(实验组吸光度值-空白组吸光度值)/(对照组吸光度值-空白组吸光度值)×100%。

1.4.8 qRT-PCR检测使用TRIzol试剂从星形胶质细胞和脂多糖预处理活化后的星形胶质细胞中提取总RNA。使用PrimeScript RT试剂盒将RNA反转录为cDNA。使用miScript SYBR Green PCR试剂盒进行qRT-PCR。根据内参Gapdh的表达，使用2−ΔΔCT法计算相关mRNA的相对表达。引物序列见表1。

1.4.9 Western blot检测将接种于6孔板的PC12细胞和神经元按 “1.4.6”分组处理；利用现配的、预冷的蛋白裂解试剂(PMSF、蛋白酶磷酸酶抑制剂)冰上裂解10 min；刮取移致EP管中，4 ℃预冷离心机12 000×g离心15 min；按照2∶1比例加入2×上样缓冲液混匀，置于100 ℃金属浴煮10 min，再次12 000×g离心15 min；取适量蛋白质样品行SDS-PAGE，60 V电泳45 min后调至100 V继续电泳80 min，300 mA湿转150 min至PVDF膜；用含5% BSA的TBST封闭1 h，加入一抗于4 ℃孵育过夜，包括β-Tubulin抗体(1∶5 000)，CD9抗体、CD63抗体和Tsg101抗体(均1∶1 000)，胶质纤维酸性蛋白抗体、硫酸软骨素蛋白聚糖抗体、Bax抗体和Bcl-2抗体(均1∶1 000)；TBST洗膜3次，每次8 min；用HRP标记的二抗(1∶5 000)室温孵育1 h；TBST洗膜3次，每次8 min；最后对条带进行曝光显影。
1.5 主要观察指标 ①CCK-8法检测不同浓度AS-EVs和LPAS-EVs对PC12细胞增殖的影响；②CCK-8法检测AS-EVs和LPAS-EVs对谷氨酸所致损伤PC12细胞存活率的影响；③Western blot检测促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2在谷氨酸所致损伤PC12细胞及原代神经元中的表达。
1.6 统计学分析使用GraphPad Prism 7.0软件进行统计分析。计量资料以x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验，P < 0.05为差异有显著性意义，每个实验至少重复3次。

讨论

中枢神经系统疾病日益被认为是全世界死亡和残疾的主要原因[1]，而在中枢神经系统相关疾病的预防和治疗中，抑制神经元凋亡是其中非常重要的一步[32]。近年来，人们对抑制神经元凋亡进行了大量的研究，也取得了不少成果，但仍需对潜在的治疗策略进行探索，寻求更加有效的治疗手段。
星形胶质细胞作为中枢神经系统中数量最多的胶质细胞，不仅在生理状态下为神经元提供营养、支持和保护，也能够在中枢神经系统相关疾病中发挥神经保护作用[33]，其保护作用是否能够通过其所释放的细胞外囊泡来实现，值得进一步探究。在脊髓损伤、脑出血等相关中枢神经系统疾病发展过程中，由于急性或慢性炎症的刺激，星形胶质细胞能够发生适应性变化，通过限制炎症的扩散发挥神经保护作用[6，34-36]，并且有报道称炎症刺激后的星形胶质细胞释放出更多的细胞外囊泡[19]，这些提示通过释放具有神经保护功能的细胞外囊泡可能也是星形胶质细胞适应性变化的一方面。此外，有报道称乙醇能通过Toll样受体4促进星形胶质细胞释放细胞外囊泡[37]，且脂多糖也能够通过Toll样受体4激活星形胶质细胞，使其活化[38]。那么脂多糖预处理活化后的星形胶质细胞，是否也能够通过Toll样受体4途径增加细胞外囊泡的释放，并发挥神经保护作用，值得探究。
为了探究AS-EVs和LPAS-EVs能否抑制神经元的继发凋亡，该课题首先在体外提取星形胶质细胞，并利用脂多糖建立星形胶质细胞活化模型，利用超速离心法提取AS-EVs和LPAS-EVs，经鉴定符合要求后用于后续实验。
谷氨酸诱导PC12 细胞损伤模型目前已作为神经元凋亡体外研究的常用模型[28-29]。此外，促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2是目前已知的一对凋亡调控蛋白，两者形成二聚体对细胞凋亡起到调控作用[39]。该实验先探索了不同浓度AS-EVs和LPAS-EVs对PC12细胞增殖的影响，随后制作了谷氨酸损伤PC12细胞模型，并利用AS-EVs和LPAS-EVs进行干预。CCK-8结果显示，AS-EVs和LPAS-EVs对PC12细胞增殖无明显影响，但是能够提高谷氨酸所致损伤PC12细胞的存活率，且LPAS-EVs的作用强于AS-EVs。Western blot结果显示，AS-EVs和LPAS-EVs能够抑制促凋亡蛋白Bax的表达，促进抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，从而增强PC12细胞抗凋亡能力，且LPAS-EVs的作用略强于AS-EVs。以上结果表明，在谷氨酸所致PC12细胞损伤模型中，AS-EVs和LPAS-EVs能够通过增强细胞抗凋亡能力而非促进细胞增殖发挥细胞保护作用，且LPAS-EVs的作用强于AS-EVs。
该实验提取培养了原代神经元，经纯化鉴定后用10 mmol/L谷氨酸制作了神经元损伤模型，在AS-EVs和LPAS-EVs干预后，检测Bax和Bcl-2的表达，得到了与PC12细胞谷氨酸损伤模型相同的结果。
综合2个模型结果：首次证实AS-EVs和LPAS-EVs能够通过调控促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2的表达抑制谷氨酸致神经元凋亡，发挥神经保护作用，且LPAS-EVs的作用强于AS-EVs，即星形胶质细胞所释放的细胞外囊泡能够通过调控促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2的表达抑制谷氨酸所致神经元凋亡，具有神经保护作用，并且在受到脂多糖刺激后这种作用得到增强。
星形胶质细胞来源细胞外囊泡具有神经保护作用这一结论与部分报道是相一致性的[40-44]，但是在受到脂多糖刺激后，这一作用不仅没有消失或减弱反而得到增强的结论，似乎与活化的星形胶质细胞能够加重神经炎症，导致神经元凋亡等结论相悖[42]。课题组没有探究LPAS-EVs是否能够加重神经炎症，也许LPAS-EVs确实能够加重神经炎症，但是其所发挥的神经保护作用强于其所带来的神经炎症反应，总体表现出神经保护作用，或者存在其他的方式通过与炎症因子协同作用发挥抑制神经元凋亡。此外，AS-EVs和LPAS-EVs如何对Bax和Bcl-2进行调控，以及二者差异调控的内在因素是什么，是否通过递送如micRNA、lncRNA等物质进行相关调控等这些都有待后续研究[43-44]。该研究所获得的结果均为体外细胞学实验结果，缺乏体内干预研究的数据，未深入研究AS-EVs和LPAS-EVs两者通过何种物质或何种途径发挥了具有差别的抗凋亡作用。脂多糖活化星形胶质细胞模型，并不能完全模拟处于炎症微环境中星形胶质细胞所发生的变化，对于包含多种物质的细胞外囊泡来说，母细胞状态的轻微变化就可能会对囊泡本身带来功能上的巨大变化[23-24]，这些都需要在后续研究中不断探索完善补充。
综上所述，星形胶质细胞所释放的细胞外囊泡能够通过调控促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，抑制谷氨酸所致神经元凋亡，具有神经保护作用，并且在受到脂多糖刺激后，这种作用得到增强。深入了解来源于不同状态星形胶质细胞的细胞外囊泡内容物的组成和数量，以及靶向递送和作用机制，可为中枢神经系统疾病抑制神经元凋亡提供更好的治疗策略。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

脂多糖预处理活化星形胶质细胞来源细胞外囊泡可保护神经元

Protective effect of lipopolysaccharide-preconditioned astrocyte extracellular vesicles on neurons

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