建立载脂蛋白E基因敲除小鼠骨髓髓源性生长因子缺失模型及鉴定

doi:10.12307/2022.483

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (14): 2196-2201.doi: 10.12307/2022.483

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建立载脂蛋白E基因敲除小鼠骨髓髓源性生长因子缺失模型及鉴定

丁燕1，2，向光大2，孟碧莹2，徐晓丽2，陈月富1

1湖南医药学院，湖南省怀化市 418000；2 中国人民解放军中部战区总医院，湖北省武汉市 430700

收稿日期:2021-02-03 修回日期:2021-02-03 接受日期:2021-04-12 出版日期:2022-05-18 发布日期:2021-12-21
通讯作者: 向光大，博士，主任医师，中国人民解放军中部战区总医院，湖北省武汉市 430700
作者简介:丁燕，女，1990年生，湖南省怀化市人，汉族，博士，医师，主要从事心血管、内分泌、基因敲除鼠的研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81870573)，项目负责人：向光大

Establishment and identification of a myeloid-derived growth factor deficiency model in apolipoprotein E knockout mice

Ding Yan1, 2, Xiang Guangda2, Meng Biying2, Xu Xiaoli2, Chen Yuefu1

1Hunan University of Medicine, Huaihua 418000, Hunan Province, China; 2PLA General Hospital of Central Theater Command, Wuhan 430700, Hubei Province, China

Received:2021-02-03 Revised:2021-02-03 Accepted:2021-04-12 Online:2022-05-18 Published:2021-12-21
Contact: Xiang Guangda, MD, Chief physician, PLA General Hospital of Central Theater Command, Wuhan 430700, Hubei Province, China
About author:Ding Yan, MD, Physician, Hunan University of Medicine, Huaihua 418000, Hunan Province, China; PLA General Hospital of Central Theater Command, Wuhan 430700, Hubei Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81870573 (to XGD)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
髓源性生长因子(myeloid-derived growth factor，MYDGF)：是一种由骨髓单核细胞和巨噬细胞分泌的细胞因子，可以改善糖尿病小鼠的胰岛素抵抗和葡萄糖/脂质代谢。髓源性生长因子可以改善血管内皮功能障碍，并且在改善心肌梗死方面发挥重要作用。
髓源性生长因子和ApoE双基因敲除模型建立：购买骨髓特异性髓源性生长因子基因敲除小鼠和ApoE基因敲除小鼠，将两种小鼠进行杂交得到ApoE基因敲除小鼠骨髓特异性髓源性生长因子缺失小鼠，利用基因鉴定和蛋白水平验证敲除效果，初步观察敲除小鼠表型。

背景：目前关于髓源性生长因子(myeloid-derived growth factor，MYDGF)与动脉粥样硬化及代谢性疾病的研究较少，因此建立一种载脂蛋白E(apolipoprotein E，ApoE)敲除骨髓MYDGF缺失的小鼠模型对于研究MYDGF与动脉粥样硬化疾病的关系尤为重要。
目的：建立ApoE敲除骨髓MYDGF特异性缺失小鼠模型并进行鉴定。
方法：ApoE敲除小鼠和骨髓特异性MYDGF敲除小鼠，均购于上海南方模式生物科技股份有限公司。选取5只ApoE敲除小鼠与10只骨髓特异性MYDGF敲除小鼠进行交配，得到基因型为MYDGFflox/+ApoEflox/+ F1子代小鼠30只，MYDGFflox/+ApoEflox/+互相进行交配，一共得到基因型为MYDGFflox/floxApoEflox/flox双敲除小鼠30只和ApoEflox/flox小鼠子代小鼠34只。采用PCR法进行MYDGFflox及ApoEflox基因型鉴定，记录MYDGFflox/floxApoEflox/flox双敲除小鼠与ApoEflox/flox小鼠2月龄的体长及体质量，采用Western blotting和免疫荧光检测2组小鼠骨髓组织MYDGF蛋白相对表达量，油红O染色检测2组小鼠胸主动脉斑块面积。实验方案经中国人民解放军中部战区总医院动物实验伦理委员会批准。
结果与结论：①得到基因型为ApoEflox/flox小鼠共34只、MYDGFflox/floxApoEflox/flox小鼠共30只，2组小鼠体长、体质量比较差异均无显著性意义(均P > 0.05)；②MYDGFflox/floxApoEflox/flox小鼠骨髓组织MYDGF蛋白相对表达量显著低于ApoEflox/flox小鼠(P < 0.05)；③MYDGFflox/floxApoEflox/flox小鼠胸主动脉的斑块面积百分比显著大于ApoEflox/flox小鼠(P < 0.05) ；④结果证实成功敲除了ApoE小鼠的MYDGF基因，说明成功构建ApoE敲除骨髓特异性MYDGF缺失小鼠模型，并经基因型及蛋白组织水平鉴定；MYDGF基因缺乏可以加重ApoE基因敲除小鼠的动脉粥样硬化。

https://orcid.org/0000-0002-2356-9924 (丁燕)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 骨髓细胞, MYDGF基因, ApoE基因, MYDGF蛋白, 双基因敲除, 小鼠

Abstract: BACKGROUND: There are few studies on myeloid-derived growth factor (MYDGF) and atherosclerosis and metabolic diseases. Therefore, a mouse model of bone marrow specific MYDGF deficiency with apolipoprotein E (ApoE) knockout is particularly important for studying the relationship between MYDGF and atherosclerotic diseases.
OBJECTIVE: To establish and identify the mouse model of bone marrow specific MYDGF deficiency with ApoE knockout.
METHODS: ApoEflox/flox mice and bone marrow specific MYDGFflox/fiox mice were purchased from the Shanghai Model Organisms Centre, Inc (Shanghai, China). Five ApoEflox/flox male mice were selected to mate with 10 MYDGFflox/fiox female mice, and 30 F1 progeny mice with genotype of MYDGFflox/+ApoEflox/+ were obtained and mated with each other. Finally 30 mice with genotypes of MYDGFflox/floxApoEflox/flox and 34 ApoEflox/flox progenies were obtained. The MYDGFflox and ApoEflox genotypes were identified by PCR, and the body length and body mass of MYDGFflox/floxApoEflox/flox mice and ApoEflox/flox mice at 2 months were recorded. The expression of MYDGF protein in the mouse bone marrow tissues was detected by western blot assay, and immunofluorescence was used to detect the expression of MYDGF in the mouse bone marrow cells. The plaque area of the thoracic aorta in the mouse was detected by oil red O staining. The study was approved by the Animal Ethic Committee of PLA General Hospital of Central Theater Command.
RESULTS AND CONCLUSION: There were 34 ApoEflox/flox mice and 30 MYDGFflox/floxApoEflox/flox mice, with no significant difference in their body length and body mass (both P > 0.05). The relative expression level of MYDGF protein in the bone marrow of MYDGFflox/floxApoEflox/flox mice was significantly lower than that of ApoEflox/flox mice (P < 0.05). The percentage of plaque area in the thoracic aorta of MYDGFflox/floxApoEflox/flox mice was significantly higher than that of ApoEflox/flox mice (P < 0.05). Therefore, MYDGF gene was successfully knocked out in ApoEflox/flox mice, and the homozygous mouse model of bone marrow knockout MYDGF gene in ApoE knockout mice was successfully constructed and identified by genotype and protein tissue levels. To conclude, MYDGF gene deficiency can aggravate atherosclerosis in ApoE knockout mice.

Key words: bone marrow cells, MYDGF gene, ApoE gene, MYDGF protein, double gene knockout, mouse

中图分类号:

丁燕, 向光大, 孟碧莹, 徐晓丽, 陈月富. 建立载脂蛋白E基因敲除小鼠骨髓髓源性生长因子缺失模型及鉴定[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(14): 2196-2201.

Ding Yan, Xiang Guangda, Meng Biying, Xu Xiaoli, Chen Yuefu. Establishment and identification of a myeloid-derived growth factor deficiency model in apolipoprotein E knockout mice[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(14): 2196-2201.

图/表（结果） 6

2.1 MYDGFflox小鼠基因型鉴定结果 PCR电泳实验结果显示，MYDGFflox/flox纯合子小鼠可见355 bp一条条带，MYDGFflox/+杂合子小鼠可见355 bp和87 bp两条条带。结果经统计，共繁殖出MYDGFflox/flox纯合子小鼠10只，MYDGFflox/+杂合子小鼠12只，见图1。

2.2 ApoEflox小鼠基因型鉴定结果 PCR电泳实验结果显示，ApoEflox/flox小鼠可见254 bp一条条带，ApoEflox/+小鼠可见254 bp和155 bp两条条带，见图2。

2.3 ApoEflox/flox小鼠骨髓特异性敲除MYDGF基因的鉴定结果经PCR电泳实验结果统计，共鉴定出基因型为MYDGFflox/flox ApoEflox/flox的小鼠30只、单纯的ApoEflox/flox小鼠34只，见图3。

经测量和称质量统计分析，2月龄的单纯ApoEflox/flox敲除鼠与MYDGFflox/floxApoEflox/flox的对照小鼠体长分别为(18.49±0.83)，(18.41±0.80) cm(t=0.395，P=0.694)；体质量分别为(24.04±1.82)，(24.12±1.83) g(t=0.172，P=0.864)。二者体长、体质量比较，差异无显著性意义(均P > 0.05)。
2.4 ApoEflox/flox小鼠与MYDGFflox/floxApoEflox/flox小鼠骨髓组织MYDGF蛋白表达 Western Blot结果显示，ApoEflox/flox小鼠与MYDGFflox/floxApoEflox/flox小鼠骨髓组织MYDGF蛋白相对表达量分别为(0.72±0.08)，(0.07±0.05)(t=17.44，P=0.000 1)；证实成功敲除MYDGFflox/floxApoEflox/flox小鼠的骨髓组织MYDGF基因，见图4。

2.5 ApoEflox/flox小鼠与MYDGFflox/floxApoEflox/flox小鼠骨髓MYDGF免疫荧光染色免疫荧光染色结果发现，在骨髓细胞MYDGF阳性个数表达中，MYDGFflox/floxApoEflox/flox小鼠骨髓细胞MYDGF阳染个数明显低于ApoEflox/flox小鼠，ApoEflox/flox小鼠与MYDGFflox/floxApoEflox/flox小鼠骨髓组织MYDGF荧光相对表达量分别为(60.33±10.13)%，(9.83±1.72)%(t=12.04，P=0.000 1)；说明MYDGFflox/floxApoEflox/flox小鼠成功在骨髓细胞上敲除了MYDGF基因，见图5。

2.6 ApoEflox/flox小鼠与MYDGFflox/floxApoEflox/flox小鼠西方饮食条件下胸主动脉油红染色取8周龄ApoEflox/flox和MYDGFflox/floxApoEflox/flox小鼠各6只，西方饮食喂养3个月后，取2组小鼠的胸主动脉组织，进行油红O染色。油红染色结果显示，与ApoEflox/flox小鼠相比，MYDGFflox/floxApoEflox/flox小鼠胸主动脉表面斑块面积明显增加，ApoEflox/flox小鼠与MYDGFflox/floxApoEflox/flox小鼠胸主动脉斑块面积分别为(8.00±2.37)%，(17.33±2.58)%，t=6.528，P=0.000 1，二者比较P < 0.05；说明MYDGF基因缺乏可以加重APOE基因敲除小鼠的动脉粥样硬化，见图6。

参考文献

[1] BRUNEAU S, NAKAYAMA H, WODA CB, et al. DEPTOR regulates vascular endothelial cell activation and proinflammatory and angiogenic responses. Blood. 2013;122(10):1833-1842.
[2] MEI W, XIANG G, LI Y, et al. GDF11 protects against endothelial injury and reduces atherosclerotic lesion formation in apolipoprotein E-null mice. Mol Ther. 2016;24(11):1926-1938.
[3] Li Y, Xu S, Mihaylova MM, et al. AMPK phosphorylates and inhibits SREBP activity to attenuate hepatic steatosis and atherosclerosis in diet-induced insulin-resistant mice. Cell metabolism. 2011;13(4):376-388.
[4] LU J, XIANG G, LIU M, et al. Irisin protects against endothelial injury and ameliorates atherosclerosis in apolipoprotein E-Null diabetic mice. Atherosclerosis. 2015;243(2):438-448.
[5] 周政荣,丁丽娜. 冠心病合并糖尿病应用奥美沙坦酯对患者血管内皮细胞功能的影响作用[J].北方药学,2018,15(11):29-30.
[6] 马丽娜,陈北冬,赵艳阳,等. 银杏内酯B对内皮细胞的保护作用及分子机制研究[J].中国药理学通报,2013,29(2):189-193.
[7] WANG Y, LI Y, FENG J, et al. Mydgf promotes Cardiomyocyte proliferation and Neonatal Heart regeneration. Theranostics. 2020;10(20):9100-9112.
[8] WANG L, LI Y, GUO B, et al. Myeloid-derived growth factor promotes intestinal glucagon-like peptide-1 production in male mice with type 2 diabetes. Endocrinology. 2020;161(2):1-19.
[9] LI H, LI Y, XIANG L, et al. GDF11 attenuates development of type 2 diabetes via improvement of islet β-cell function and survival. Diabetes. 2017;66(7):1914-1927.
[10] XU H, LI H, WOO S, et al. Myeloid cell-specific disruption of Period1 and Period2 exacerbates diet-induced inflammation and insulin resistance. J Biol Chem. 2014;289(23):16374-16388.
[11] LIAO J, AN X, YANG X, et al. Deficiency of LMP10 Attenuates Diet-Induced Atherosclerosis by Inhibiting Macrophage Polarization and Inflammation in Apolipoprotein E Deficient Mice. Front Cell Dev Biol. 2020;8:1-12.
[12] SUI Y, PARK SH, XU J, et al. IKKβ links vascular inflammation to obesity and atherosclerosis. J Exp Med. 2014;211(5):869-886.
[13] 王俊岩,朱美林,冷雪,等. 丹参酮ⅡA对ApoE基因敲除小鼠肝脏脂质沉积的影响及机制[J].遵义医学院学报,2014,37(1):94-98.
[14] 王力,向光大,郭孛,等.髓源性生长因子通过促进GLP-1分泌改善2型糖尿病小鼠血糖水平[J].中华内分泌代谢杂志,2019,35(7): 591-598.
[15] 桑璐,郭英,任立明,等. 利用Cre/lox重组系统在转基因动物中筛选高效表达外源基因的“友好”基因座[J]. 高技术通讯,2004, 14(12):43-49.
[16] ZHU B, LI Y, XIANG L, et al. Alogliptin improves survival and health of mice on a high-fat diet. Aging Cell. 2019;18(2):e12883.
[17] 赖舒畅,邱鸿,王肖,等.条件性胰岛β细胞DEPTOR基因敲除小鼠构建及鉴定[J].实用医学杂志,2018,34(4):552-555.
[18] ZHU B, MEI W, JIAO T, et al. Neuregulin 4 alleviates hepatic steatosis via activating AMPK/mTOR-mediated autophagy in aged mice fed a high fat diet. Eur J Pharmacol. 2020;884:173350.
[19] 丁燕,傅友,单兰兰,等. 佛手柑内酯对双氧水诱导人脐静脉内皮细胞衰老的影响[J].中国组织工程研究,2016,20(46):6885-6892.
[20] 丁燕,赖丽芬,奈文青,等. 血管内皮细胞敲除Rheb基因杂合子小鼠模型建立及意义[J].山东医药,2017,57(36):34-36.
[21] HE M, LI Y, WANG L, et al. MYDGF attenuates podocyte injury and proteinuria by activating Akt/BAD signal pathway in mice with diabetic kidney disease. Diabetologia. 2020;63(9):1916-1931.
[22] DING Y, JIANG H, MENG B, et al. Sweroside-mediated mTORC1 hyperactivation in bone marrow mesenchymal stem cells promotes osteogenic differentiation. J Cell Biochem. 2019;120(9):16025-16036.
[23] BORTNOV V, ANNIS DS, FOGERTY FJ, et al. Myeloid-derived growth factor is a resident endoplasmic reticulum protein. J Biol Chem. 2018; 293(34):13166-13175.
[24] DWIVEDI RC, KROKHIN OV, EL-GABALAWY HS, et al. Development of an SRM method for absolute quantitation of MYDGF/C19orf10 protein. Proteomics Clin Appl. 2016;10(6):663-670.
[25] WEILER T, DU Q, KROKHIN O, et al. The identification and characterization of a novel protein, c19orf10, in the synovium. Arthritis Res Ther. 2007; 9(2):R30.
[26] KORF-KLINGEBIEL M, REBOLL MR, KLEDE S, et al. Myeloid-derived growth factor (C19orf10) mediates cardiac repair following myocardial infarction. Nat Med. 2015;21(2):140-149.
[27] Cully M. MYDGF promotes heart repair after myocardial infarction. Nat Rev Drug Discov. 2015;14(3):164-165.
[28] ZHAO L, FENG S, WANG S, et al. Production of bioactive recombinant human myeloid-derived growth factor inEscherichia coli and its mechanism on vascular endothelial cell proliferation. J Cell Biochem. 2019;24(2):1189-1199.
[29] DING Y, SHAN L, NAI W, et al. DEPTOR Deficiency-Mediated mTORc1 Hyperactivation in Vascular Endothelial Cells Promotes Angiogenesis. Cell Physiol Biochem. 2018;46:520-531.
[30] 丁燕,孟碧莹,向光大. 建立血管内皮细胞敲除DEPTOR基因小鼠模型及鉴定[J].中国组织工程研究,2019,23(23):3698-3704.
[31] LIN Z, PAN X, WU F, et al. Fibroblast growth factor 21 prevents atherosclerosis by suppression of hepatic sterol regulatory element-binding protein-2 and induction of adiponectin in mice. Circulation. 2015;131(21):1861-1871.
[32] SUNAGOZAKA H, HONDA M, YAMASHITA T, et al. Identification of a secretory protein c19orf10 activated in hepatocellular carcinoma. Int J Cancer.2011;129(7):1576-1585.

引言

动脉粥样硬化发病率日益增高，病理机制主要是动脉血管内壁的慢性炎症所致，炎症可以加速动脉粥样硬化的进展和斑块的形成[1]。动脉硬化引发的血管栓塞易引起心肌梗死，许多信号通路如LKB1-AMPK-AKT1以及PI3K/PTEN等与动脉粥样硬化疾病关系密切[2-3]。临床上采用了他汀类药物调节血脂、活血化瘀、抗炎等方法开展治疗，有效延缓了斑块的进展[4-6]。但仍需要寻找靶点特异性高、作用效果好的新型药物制剂。
骨髓作为传统的造血器官，维持了机体的能量和营养，而关于骨髓细胞调控代谢的研究则知之甚少。髓源性生长因子(myeloid-derived growth factor，MYDGF)是一种主要由骨髓单核细胞和巨噬细胞分泌的细胞因子，可以改善心肌梗死后心肌功能，促进心脏再生[7]。作者团队最新研究发现MYDGF可以改善糖尿病小鼠的胰岛素抵抗和糖脂代谢紊乱[8]，而胰岛素抵抗与糖脂代谢紊乱和动脉粥样硬化的发展息息相关[9-10]，因此MYDGF是否可以改善动脉粥样硬化的发展值得关注。骨髓特异性MYDGF基因敲除小鼠容易构建，易饲养和繁殖，存活能力强，毛色光泽，成本经济合理。此外，动物体内缺乏载脂蛋白E(apolipoprotein E，ApoE)，则会导致血液循环胆固醇大量积累，促进动脉粥样硬化形成[11]。ApoE基因敲除小鼠存在严重的脂蛋白清除障碍和高胆固醇血症[12]。西方饮食可以加速ApoE基因敲除小鼠动脉粥样硬化模型构建[13]。因此该研究初步探讨MYDGF缺失对西方饮食下ApoE基因小鼠动脉粥样硬化的影响。
此次研究首次在ApoE敲除小鼠中进行骨髓特异性的MYDGF基因敲除，产生骨髓特异性MYDGF缺失的ApoE敲除小鼠，即MYDGFflox/floxApoEflox/flox小鼠，为实验所需的双敲小鼠，单纯的ApoEflox/flox小鼠为实验对照组，并进行基因水平和蛋白组织水平的验证，观察两种敲除小鼠的表型差异，初步比较西方饮食喂养下ApoEflox/flox小鼠骨髓MYDGF缺失对动脉粥样硬化的影响，研究具有一定创新性和重要的基础研究意义。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计构建双敲小鼠模型，基因和蛋白组织水平检测，两组比较采用t检验。
1.2 时间及地点实验于2018年4月至2019年3月在中国人民解放军中部战区总医院实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物无特定病原体级C57BL/6J背景特异性MYDGF敲除雌性小鼠(MYDGFflox/flox)10只，4周龄，体质量(15.09±0.94) g，ApoEflox/flox雄鼠5只，4周龄，体质量(15.38±1.04) g，以上小鼠均购于上海南方模式生物科技股份有限公司[14-15]，实验动物许可证号：SYXK(沪)2017-0012，上述小鼠的颜色均为黑色；4周龄C57野生型(WT)小鼠6只，雌性各半，作为小鼠基因型鉴定的对照，购自湖北省实验动物研究中心，许可证号：SCXK(鄂)2015-0018。所有实验小鼠均饲养在华中科技大学动物实验中心SPF级动物房，湿度控制在55%-75%，室内温度控制在(25±2) ℃[16-17]。
1.3.2 小鼠西方饮食小鼠出生后接受正常饮食(10%脂肪，70%碳水化合物和20%蛋白质)喂养，自8周龄开始，喂食西方饮食饲料(40%脂肪，43% 碳水化合物和17%蛋白质)持续12周，饲料购买于北京华阜康生物科技股份有限公司。
1.3.3 实验用主要试剂 PremixTag酶(购买于武汉巴菲尔公司)；DNTP试剂、ddH2O(购买于武汉拜意尔生物公司)；PCR引物委托上海生物工程有限公司进行合成；鼠尾裂解液(购买于武汉华联科生物技术有限公司)[18-19]；兔抗MYDGF(Proteintech，#11353-1-AP)；鼠抗GAPDH(CST，#5174)；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(#111-035-003)、抗鼠IgG (#115-035-146)(Jackson ImmunoResearch Laboratories，USA)。
1.4 实验方法
1.4.1 MYDGFflox/flox纯合子小鼠的养殖及鉴定取8周龄的MYDGFflox/+雄鼠3只与8周龄的MYDGFflox/+雌鼠6只进行交配，繁殖出F1子代小鼠一共30只，颜色均为黑色。用解剖剪剪取2周龄上述小鼠的鼠尾5 mm，分别装入写好相应编号的1.5 mL的EP管内，采用PCR法进行小鼠基因型的鉴定。鉴定方法如下：在1.5 mL装有鼠尾的EP管中加入100 μL的裂解液A液，在离心机中以15 000 r/min的转速离心2 min，随后放入温度为96 ℃金属水浴锅中，煮沸1 h；离心后加入100 μL的鼠尾裂解液B液，离心机中15 000 r/min转速离心2 min。MYDGF的PCR引物序列为：MYDGF-1：5’-CGT AAG TGA GTC CGG GAC C-3’；MYDGF-2：5’-TGT TTG GGT TGG AGT TTG C-3’；MYDGF-3：5’-AGG GCT ATT GCC TGC TGT-3’。PCR反应体系20 μL：2×PCR mix 10 μL，上游引物2 μL(调整终浓度100 nmol)，下游引物2 μL (调整终浓度100 nmol)，模板4 μL，dd超纯水2 μL。PCR反应条件： 94 ℃2 min，94 ℃30 s，55 ℃30 s，72 ℃ 1 min，72 ℃ 5 min，循环共35次，在4 ℃保存。配制2%的琼脂糖凝胶，PCR上机结束后，用移液枪移取10 μL 模板DNA小心加入上样孔中，电泳半小时后对琼脂糖凝胶进行成像系统拍照，记录PCR鉴定结果[20]。
1.4.2 ApoEflox/flox纯合子小鼠的养殖及鉴定选择ApoEflox/+ 雄性小鼠2只与ApoEflox/+ 雄性小鼠4只进行交配，顺利繁殖出实验所需的ApoEflox/flox纯合子小鼠5只。参照1.4.1的方法采用PCR法进行小鼠ApoE基因型的鉴定。ApoE引物序列：APOE-1：5’-GCC TAG CCG AGG GAG AGC CCG-3’；APOE-2：5’-TGT GAC TTG GGA GCT CTG CAG C-3’；APOE-3：5’-GCC GCC CCG ACT GAC TCT-3’。PCR体系20 μL：2×PCR mix 10 μL，上游引物2 μL(调整终浓度100 nmol)，下游引物2 μL(调整终浓度100 nmol)，模板4 μL，dd超纯水2 μL。PCR反应条件：94 ℃3 min，94 ℃30 s，59 ℃40 s，72 ℃1 min，72 ℃ 2 min，循环共35次，在4 ℃保存。随后进行PCR上机和凝胶拍照。

1.4.3 MYDGFflox/floxApoEflox/flox双基因敲除纯合子小鼠的繁殖和鉴定选取5只ApoE敲除小鼠与10只骨髓特异性MYDGF敲除小鼠进行交配，得到基因型为MYDGFflox/+ApoEflox/+ F1子代小鼠30只，将30只MYDGFflox/+ApoEflox/+小鼠互相进行交配，得到基因型为MYDGFflox/floxApoEflox/flox小鼠30只、ApoEflox/flox小鼠34只，MYDGFflox/+ApoEflox/+小鼠20只，MYDGFflox/flox小鼠15只，MYDGF+/+ApoE+/+小鼠15只，MYDGFflox/+小鼠10只，APOEflox/+小鼠9只，其中基因型为MYDGFflox/floxApoEflox/flox的小鼠即为实验所需建立的骨髓特异性敲除MYDGF基因ApoEflox/flox纯合子小鼠模型。参照1.4.1的方法鉴定64只子代小鼠的MYDGFflox及ApoEflox基因型。

1.4.4 Western blotting法检测小鼠骨髓组织的MYDGF蛋白表达取8周龄的MYDGFflox/floxApoEflox/flox小鼠和ApoEflox/fllox小鼠各3只，麻醉处死，取适量骨髓组织，研碎后放入编好号的EP管内，加入100 μL蛋白裂解液裂解组织，100 ℃水浴锅中煮沸10 min。配制10%的PAGE凝胶，用移液枪吸取6组蛋白样品各10 μL于上样孔中，电泳2 h，用PVDF将目标蛋白进行转膜，常温下用5%的脱脂奶粉在摇床上封闭1 h。之后剪下PVDF膜中目标条带，放入抗体孵育盒中，分别加入兔抗MYDGF(1∶1 000)、鼠抗GAPDH(1∶4 000)的一抗稀释液各3 mL，注意完全覆盖PVDF膜，将抗体孵育盒放在4 ℃冰箱的摇床过夜。次日，用1×TBST洗膜3次，每次5 min，用辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(1∶3 000) 和抗鼠IgG (1∶3 000)二抗孵育1 h，1×TBST洗涤3次，每次5 min后，在暗室进行胶片曝光显影，用胶片扫描仪扫描。GAPDH为内参，以MYDGF蛋白与GAPDH灰度值的比值计算MYDGF蛋白相对表达量[21]。
1.4.5 免疫荧光法检测小鼠骨髓组织的MYDGF蛋白表达取8周龄MYDGFflox/floxApoEflox/flox小鼠和ApoEflox/fllox小鼠各3只，麻醉处死后取股骨，脱钙处理石蜡包埋，切片厚度为4 μm。将切片进行常规脱蜡水化，小心滴加100 μL的兔抗小鼠的MYDGF(1∶200)，4 ℃过夜，洗涤3次后，在室温摇床上用异硫氰酸荧光素标记的山羊抗兔IgG二抗孵育1 h，PBS洗涤3次，DAPI显色15 s，在暗室中使用荧光显微镜下拍照[22]。
1.4.6 油红O染色检测小鼠胸主动脉的斑块面积用40 g/L的多聚甲醛固定小鼠的胸主动脉48 h，取新鲜配制的油红O染液染色30 min，照相观察胸主动脉的斑块与胸主动脉总面积的百分比。
1.5 主要观察指标 ①小鼠的体长和体质量；②PCR基因鉴定结果；③小鼠的骨髓组织MYDGF蛋白表达及免疫荧光表达；④小鼠胸主动脉斑块面积。
1.6 统计学分析采用SPSS 20.0统计软件，计量资料以x±s表示，组间比较采用两样本t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

MYDGF是一种由位于第19位染色质的开放阅读框的基因C19orf10编码的分泌蛋白[23-24]，主要由单核细胞和巨噬细胞分泌[25]，最新研究表明MYDGF可以改善心肌梗死，促进毛细血管新生，这种蛋白通过MAPK1/3和STAT3基因介导的信号转导通路刺激内皮细胞的增殖，通过PI3K/Akt依赖性信号转导通路减少心肌细胞凋亡[26]，以上研究提示rMYDGF作为一种新型蛋白在心血管治疗领域可能具有良好的前景[27-28]。此次实验首次构建ApoEflox/flox小鼠的骨髓组织敲除MYDGF基因的模型，在动物体内实验水平中分析MYDGF基因在动物动脉粥样硬化形成、发展和缓解中有重要意义。国内目前关于MYDGF的研究较少，资料文献尚不完善。MYDGF对动脉粥样硬化的影响及是否具有改善或延缓动脉粥样硬化的功能机制仍然不是很清楚，研究MYDGF与代谢性疾病，如2型糖尿病、NAFLD和动脉粥样硬化等的相互作用就变得十分有意义。因此，构建骨髓特异性敲除MYDGF基因的ApoEflox/flox小鼠模型对于研究MYDGF在动脉粥样硬化疾病中的作用具有重要意义。
此次实验结果证实MYDGFflox/flox小鼠的骨髓细胞MYDGF基因被敲除，而其他组织及细胞内的MYDGF基因正常存在，因此有利于研究骨髓中MYDGF缺失对代谢的调控作用。根据Cre/loxp条件基因敲除技术原理，MYDGFflox/flox小鼠与ApoEflox/flox的纯合子小鼠杂交产生MYDGFflox/floxApoEflox/flox小鼠，为骨髓细胞特异性缺失MYDGF的ApoE小鼠。因此，构建基因型为MYDGFflox/floxApoEflox/flox的纯合子小鼠对于研究MYDGF基因在动脉粥样硬化等代谢性疾病的发生发展具有重要作用。在此次实验中，利用Cre/loxp条件性基因敲除技术，繁殖出基因型为MYDGFflox/floxApoEflox/flox小鼠30只、ApoEflox/flox小鼠34只。结果显示2组小鼠的体长及体质量没有明显差异，证实了骨髓特异性敲除MYDGF基因对小鼠的生长、外显和体质量没有影响。MYDGFflox/floxApoEflox/flox小鼠MYDGF基因鉴定结果可见355 bp条带，说明其为MYDGFflox/flox小鼠；ApoEflox/flox基因鉴定结果只见254 bp条带，说明其为MYDGFflox/flox小鼠。因此，基因型为MYDGFflox/floxApoEflox/flox的小鼠即为此次实验所需建立的骨髓特异性敲除MYDGF基因ApoEflox/flox小鼠。因为小鼠是髓源性特异性敲除MYDGF基因，因此研究选取骨髓组织作为蛋白免疫印迹和免疫荧光的检测标本，结果显示，与ApoEflox/flox小鼠相比，MYDGFflox/floxApoEflox/flox小鼠骨髓组织MYDGF蛋白表达量明显减少，且MYDGFflox/floxApoEflox/flox小鼠骨髓组织中MYDGF免疫荧光表达量明显下降，进一步验证了成功敲除了MYDGFflox/floxApoEflox/flox小鼠骨髓细胞的MYDGF基因。最后，油红O染色结果显示在西方饮食条件下，MYDGF敲除加剧了ApoE小鼠的胸主动脉斑块进展，说明MYDG可能对动脉粥样硬化发挥一定的保护作用。
此次研究也存在以下不足。首先，基因敲除小鼠饲养需要控制好实验条件[29]；其次，基因敲除小鼠的繁殖周期较长[30]，基因鉴定和蛋白电泳实验要求高[31]；最后，关于动脉粥样硬化及其他代谢性疾病的研究还没有进行深入探索。作者团队前期报道发现MYDGF通过激活糖尿病肾病小鼠的Akt/BAD信号通路可以减轻足细胞损伤和蛋白尿[21]，说明MYDGF可以缓解糖尿病肾病的进展，且国外有研究报道，MYDGF与肝细胞癌症的增殖和激活密切相关[32]，进一步验证了MYDGF在代谢和肿瘤疾病的调控中均发挥重要作用。在之后的研究中，作者将通过构建腺病毒MYDGF，升高小鼠体内的MYDGF水平，观察各处理组小鼠动脉斑块和脂肪肝的情况，深入探讨MYDGF缺失与心血管疾病、代谢调控的关系，并提供新的治疗和作用靶点。
综上所述，文章利用Cre/loxp技术构建了骨髓特异性敲除MYDGF基因的ApoEflox/flox小鼠模型，并成功鉴定出MYDGFflox/floxApoEflox/flox的小鼠和ApoEflox/flox小鼠的基因型。在蛋白水平上验证了敲除小鼠MYDGF蛋白水平的降低，在组织水平上验证了骨髓细胞MYDGF荧光定量表达降低。实验初步证实了骨髓中的MYDGF对动脉粥样硬化的发展发挥作用，其相关分子机制需要进一步探索。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

建立载脂蛋白E基因敲除小鼠骨髓髓源性生长因子缺失模型及鉴定

Establishment and identification of a myeloid-derived growth factor deficiency model in apolipoprotein E knockout mice

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[1]	林旭晨, 祝海年, 王增顺, 祁腾民, 刘立民, 索南昂秀. 黄腐酚对骨关节炎模型小鼠炎性因子及关节软骨的作用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(5): 676-681.
[2]	何云影, 李玲婕, 张舒淇, 李雨舟, 杨生, 季平. 聚丙烯酸/琼脂糖三维培养构建细胞球的方法[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(4): 553-559.
[3]	王佳佳, 刘杰, 王敏. 构建具核梭杆菌诱导的实验性根尖周炎小鼠模型[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(2): 176-181.
[4]	魏文悦, 王玉银, 郭敏芳, 张婧, 谷青芳, 宋丽娟, 柴智, 尉杰忠, 马存根. 法舒地尔抑制APP/PS1小鼠神经元凋亡的线粒体动力学作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(2): 232-238.
[5]	胡益华, 阳春华, 卢圆圆, 孙德毅. 电针联合雷公藤红素干预膝骨关节炎模型小鼠滑膜和滑膜液中转化生长因子β的表达变化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(14): 2252-2258.
[6]	郭琦琦 , 李毅, 翁桓泽, 王倩, 贾敏. 生物及非生物因素诱导肺纤维化动物模型研究的特点[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(14): 2273-2278.
[7]	张磊, 修春美, 倪莉, 陈建权. 小鼠髓核特异性标志物的鉴定和表达分析[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(11): 1669-1674.
[8]	李静, 谢建山, 崔慧林, 曹锡梅, 杨艳萍, 李海荣. 不同毛色小鼠背部皮肤中甘油二酯激酶ζ和蛋白激酶CβⅡ的表达和定位[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1196-1200.
[9]	陈继铭, 吴晓静, 刘田丰, 陈海聪, 黄成硕. 水飞蓟素对四氯化碳致小鼠肝损伤和骨代谢的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1224-1228.
[10]	史洋洋, 秦英飞, 吴福玲, 何潇, 张雪静. 胎盘间充质干细胞预处理预防小鼠毛细支气管炎[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 991-995.
[11]	周佺, 张亚男, 白亦光, 张琼, 农海斌, 刘明富, 曾高峰, 宗少晖. 3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶 1调控破骨细胞对骨质疏松小鼠骨密度的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(29): 4680-4684.
[12]	张立书, 刘安琪, 何小宁, 金岩, 李蓓, 金钫. Alpl基因影响骨髓间充质干细胞治疗溃疡性结肠炎[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(25): 3970-3975.
[13]	杨新华, 闫银弟, 罗旭光, 杨艳萍, 李海荣, 崔慧林, 曹锡梅. 钟基因Bmal1、Clock参与调节骨骼肌的发育分化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(20): 3130-3137.
[14]	李震, 黄永辉, 孙继芾, 孙海涛. 黏着斑激酶诱导小鼠胚胎成纤维细胞成骨分化的作用及机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(2): 165-171.
[15]	李啸群, 徐凯航, 纪方. 补骨脂异黄酮抑制破骨细胞分化缓解小鼠去卵巢骨质疏松[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(2): 186-190.