2.1   镁黄长石浸提液对骨髓干细胞增殖活性的影响   CCK-8实验结果表明，镁黄长石浸提液对大鼠骨髓干细胞增殖活性的影响具有时间及浓度依赖性。诱导培养1 d后，各组细胞增殖活性比较差异无显著性意义(P > 0.05)；诱导培养3 d后，各实验组细胞增殖活性均高于对照组，其中镁黄长石1/4组与对照组比较差异有显著性意义(P < 0.01)；诱导培养7 d后，各组均有明显增殖，其中镁黄长石1/8组和镁黄长石1/4组增殖活性最高，高于对照组(P < 0.01)，见图1。



2.2   镁黄长石浸提液骨髓干细胞成骨分化的影响
碱性磷酸酶活性检测：碱性磷酸酶染色结果显示，镁黄长石浸提液诱导细胞后，细胞碱性磷酸酶表达增高且呈浓度依赖性，其中镁黄长石1/4组表达最高，与成骨诱导液组相近，并明显高于对照组，见图2。



成骨相关基因的表达：利用RT-qPCR检测大鼠骨髓干细胞成骨相关基因的表达情况，实验结果显示，镁黄长浸提液诱导培养细胞7 d后，成骨相关基因的表达均有升高，各浓度镁黄长石组碱性磷酸酶mRNA相对表达量均高于对照组(P < 0.05)，低于成骨诱导液组(P < 0.05)，呈浓度依赖性；镁黄长石1/8组及镁黄长石1/4组Ⅰ型胶原mRNA的相对表达量高于对照组(P < 0.05)，低于成骨诱导液组(P < 0.05)；镁黄长石1/4组Runx2 mRNA表达量高于对照组(P < 0.05)，低于成骨诱导液组(P < 0.05)，RT-qPCR检测结果与碱性磷酸酶染色结果相一致，见图3。



2.3   黄长石浸提液对人脐静脉内皮细胞迁移的影响   Transwell细胞迁移实验结果表明，各浓度镁黄长石组具有更多的穿膜细胞数，其中镁黄长石1/4组穿膜细胞数最多，达到对照组的2倍以上(P < 0.01)，镁黄长石1/8组其次，达到对照组的1.5倍(P < 0.05)，见图4。



2.4    镁黄长石支架的扫描电镜检测结果  利用改良同轴三维打印机成功制备了具有空心管道结构的镁黄长石支架，扫描电镜显示支架材料的纵截面，无孔组和有孔组的直径均为1 mm，有孔组管道中心可见直径约500 μm的管腔结构，见图5。



2.5   镁黄长石支架的离子释放情况   将两种镁黄长石支架浸入去离子水中30 d检测钙、镁、硅离子的释放浓度，结果显示3种离子都呈现持续释放的特征，且有孔组离子释放速率更快、浓度更高，见图6。



2.6   支架材料的生物相容性   由CCK-8实验结果可知，镁黄长石材料具有良好的细胞相容性。

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近年来，骨组织工程的发展为大块骨缺损修复提供了一种新的解决策略。目前，组织工程化骨在小范围骨缺损修复中取得了一定的进展，但由于现有骨替代物(如β-三磷酸钙)的骨诱导性不足，导致成骨速率慢、效果较差，将其应用到大块骨缺损仍面临挑战。

镁黄长石(Ca2MgSi2O7)是一种含钙、硅、镁的新型生物活性陶瓷，具有良好的生物相容性、力学性能及合适的降解速率[1]。研究发现，镁黄长石可以在生理条件下释放生物活性离子，在体外诱导骨髓干细胞和脂肪干细胞等多种干细胞的成骨分化，并且可以促进表皮细胞的迁移，在体内可以促进大鼠颅骨的骨再生[2-5]。因此，镁黄长石被认为是一种较为理想的骨再生支架材料。

支架材料的快速血管化是成功修复大块骨缺损的重要因素，多孔支架为骨缺损修复过程中的快速血管化提供了解决策略。多孔支架不仅可以促进血管长入，还为细胞的迁移和营养物质的交换提供有利条件，多项研究表明，500-1 000 μm孔径的支架最适用于骨再生[6-8]。

近年来，3D打印被广泛应用于骨组织领域，以制备具有理想孔隙率和孔径的多孔支架。结合计算机辅助设计和计算机辅助制造的3D打印技术可以精确控制生物材料沉积，灵活控制支架的几何形状，其中同轴3D打印是生物3D打印中一项新技术，通过选用合适的生物材料可以简单快速地制备具有中空管道结构的支架材料。

此次实验观察镁黄长石释放的生物活性离子成分对大鼠骨髓干细胞增殖、分化及人脐静脉内皮细胞迁移中的作用，基于此通过改良同轴3D打印机制备了具有500 μm孔径的中空管道结构的多孔镁黄长石支架，并在体外检测其离子释放。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

1.1   设计   体外材料与细胞共培养实验，单因素方差分析。
1.2   时间及地点   实验于2020年10月至2021年2月在上海市口腔生物工程再生医学实验室完成。
1.3   材料   镁黄长石购自华侨科技有限公司，其理化性能见表1。

1.3.1   主要试剂与仪器   DMEM培养基(HyClone，美国)；胎牛血清、0.25%胰酶、青-链霉素(Gibco，美国)；成骨诱导液(赛业生物，中国)；免疫染色封闭液(碧云天，中国)；CCK-8试剂盒(Cell Counting Kit-8，Dojindo，日本)；反转录试剂盒(PrimeScriptTM RT Master Mix，TAKARA，日本)；SYBR Green荧光定量试剂盒(天根生物公司，北京)；Transwell板(Corning，美国)；3D打印机(Bioscaffold，GESIM，德国)；ICP-AES分析仪(Varian CO.，美国)；荧光定量PCR仪(Thermos Fisher Scientific公司，美国)；多功能酶标仪(Tecan，瑞士)、倒置显微镜(Nikon，德国)、共聚焦显微镜(Leica，德国)。
1.3.2   实验动物   4周龄雄性SD大鼠2只，体质量80-90 g，由上海交通大学医学院附属第九人民医院动物实验中心提供，许可证号：SYXK (沪) 2016-0016。实验方案得到上海交通大学医学院附属第九人民医院动物伦理委员会批准。
1.4   实验方法   
1.4.1   分离培养大鼠骨髓干细胞   断颈法处死2只SD大鼠，于无菌条件下钝性分离获得胫骨及股骨，剔除骨表面附着的软组织，减去两端骨骺，用注射器吸取10 mL DMEM完全培养基(450 mL高糖DMEM培养基中加入50 mL胎牛血清和5 mL青-链霉素)将骨髓腔内容物冲出至离心管中，反复冲洗至长骨颜色发白。将收集到的髓腔冲洗液1 500 r/min离心10 min，弃去上清，用DMEM完全培养基重悬后均匀接种于细胞培养皿中，置于37 ℃、体积分数5%CO2恒温培养箱中培养。3 d后观察、换液，细胞达到90%融合状态时进行传代，选用第1，2代细胞进行后续实验[9]。通过流式表面标记物鉴定检测证实为干细胞。
1.4.2   镁黄长石浸提液的制备   按照IOS/EN 10993-5的浸提液制备标准提取镁黄长石支架的离子成分。总的来说，称取所需用量的无菌镁黄长石粉末，以200 g/L质量浓度加入完全培养基中，于37 ℃摇床上孵育72 h；1 000 r/min离心5 min，取上清，经0.22 μL滤器过滤，随后用适量完全培养基按比例稀释成所需浓度梯度，分别为镁黄长石1/4组、镁黄长石1/8组和镁黄长石1/16组。以完全培养液作为对照组。
1.4.3   镁黄长石浸提液对骨髓干细胞增殖的影响   将大鼠骨髓干细胞以1×104/孔接种于96孔板中，置于细胞培养箱培养1 d后，每孔分别加入不同浓度镁黄长石浸提液和完全培养基各100 μL，每3 d换液一次。培养1，3，7 d后吸弃培养液，每孔加入100 μL CCK-8工作液，于37 ℃培养箱中避光孵育30 min，用酶标仪检测450 nm处吸光度值，实验一式3份，并重复3次。
1.4.4   镁黄长石浸提液对骨髓干细胞成骨分化的影响  
碱性磷酸酶染色：将大鼠骨髓干细胞接种于24孔板中，每孔接种细胞2.5×105，待细胞60%融合后，每孔分别加入不同浓度镁黄长石浸提液、完全培养基或成骨诱导液，培养细胞7 d后去除培养液，用PBS漂洗，40 g/L多聚甲醛室温固定30 min，PBS漂洗后，加入碱性磷酸酶染色工作液染液，37 ℃孵育30 min，倒置显微镜下观察、拍照。
RT-qPCR检测：将大鼠骨髓干细胞接种于6孔板中，每孔接种细胞1×106，按上述方法诱导细胞7 d后去除培养液，用Trizol收集细胞，提取总RNA后根据反转录反应试剂盒说明书将RNA反转录为cDNA。使用TB Green，按说明书配制PCR扩增体系，在实时定量PCR扩增仪中进行扩增，PCR反应条件为：95 ℃30 s，20 ℃/s，预变性1个循环；95℃5 s、20 ℃/s，60 ℃20 s、20 ℃/s，40个PCR反应循环；95 ℃0 s、20 ℃/s，65 ℃15 s、20℃/s，95 ℃0 s、0.1 ℃/s，熔解曲线分析。以GAPDH为管家基因，使用的引物见表2。根据公式(2-ΔΔCT)计算相对表达量，实验一式3份，并重复3次。

1.4.5   镁黄长石浸提液对人脐静脉内皮细胞迁移的影响   在 Transwell小室下室中分别加入750 μL不同的诱导液(完全培养基与不同浓度镁黄长石浸提液)。人脐静脉内皮细胞(eahy926，澳塞尔斯)消化、离心后调整细胞浓度为1×108 L-1，在小室中加入200 μL细胞悬液，置于培养箱中培养12 h后去除小室内培养液，PBS漂洗2次，40 g/L多聚甲醛室温固定30 min，PBS漂洗2次，结晶紫室温染色15 min，PBS漂洗2次，棉签轻轻擦去膜上层细胞，倒置显微镜下拍摄并计数，实验重复3次。
1.4.6   镁黄长石支架材料的制备和电镜观察   将镁黄长石粉末、海藻酸钠和普朗尼克F-127(200 g/L)按3.5 g∶0.1 g∶0.7 mL比例混匀，调制成膏状，装入使用传统3D打印喷头(直径1 mm)或改良3D打印喷头(内径500 μm、外径1 mm)的打印管中，所打印出的支架分别是无孔支架组和有孔支架组。调节打印机参数：压力500 kPa，速度2 mm/s，打印间距1.25 mm，层厚4 mm。将打印好的支架置于室温放置过夜，自然晾干。然后1 250 ℃高温烧结，备用。使用扫描电镜观察镁黄长石支架的纵截面的孔隙结构。
1.4.7   镁黄长石支架的体外离子释放检测   用去离子水将直径10 mm、高度3 mm的镁黄长石支架清洗3遍，将支架置于10 mL去离子水中，分别于5，10，15，20，25，30 d后收集浸提液并换新的去离子水，最后用电感耦合等离子体原子发射光谱分析仪检测硅、钙、镁离子释放情况。
1.5   主要观察指标   不同浓度镁黄长石浸提液对骨髓干细胞增殖与成骨分化的影响，以及对人脐静脉内皮细胞迁移的影响；镁黄长石支架的微观形貌与体外离子释放情况。
1.6    统计学分析   使用SPSS 20.0和GraphPad Prism 5软件对所得数据进行统计分析，各组间比较采用方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

组织工程骨为大块骨缺损的修复提供了解决策略，具有迫切的临床需求和广泛的应用前景。理想的骨再生修复材料应具有良好的生物相容性、骨传导性和骨诱导性，其中骨传导性允许新骨在支架表面或内部的生长，而骨诱导是募集未成熟细胞并诱导其成骨分化的过程，是骨愈合过程中的重要现象。但目前临床常用的人工骨植入物如β-三磷酸钙和羟基磷灰石等，虽然都有良好的生物相容性和骨传导性，但骨诱导性往往不足，从而限制了其在骨再生中的应用[10-11]。众所周知，锶、镁、铜、钙等生物活性离子对骨再生有积极作用。镁黄长石是一种富含钙、镁、硅离子的新型生物活性陶瓷，而钙离子和镁离子是天然骨组织中的必要元素之一，可以直接影响骨再生和血管生成，硅离子不仅有诱导成骨的能力，也可以促进血管再生。

已有研究表明，镁黄长石具有良好的生物相容性，并可以在生理条件下释放钙、镁、硅离子，促进细胞的增殖、迁移和分化[12-14]。实验利用镁黄长石析出的离子成分培养大鼠骨髓干细胞1，3，7 d，各实验组细胞的增殖活性均随着时间推移而增高，每个时间点镁黄长石组细胞增殖活性都高于对照组，且有浓度依赖性，其中镁黄长石1/8组和镁黄长石1/4组增殖活性最高，可见镁黄长石的离子成分有利于细胞的增殖，具有良好的生物相容性。此外，实验还检测了离子成分对大鼠骨髓干细胞成骨分化的影响，碱性磷酸酶染色结果显示，镁黄长石组的碱性磷酸酶表达高于对照组，且有浓度依赖性；在基因表达层面，成骨相关基因碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原和Runx2 mRNA的表达均升高，与碱性磷酸酶染色结果一致呈现浓度依赖性，其中镁黄长石1/4组基因表达最高，略低于成骨诱导液组。根据以上结果，作者认为镁黄长石的离子成分促进了大鼠骨髓干细胞的成骨分化，且镁黄长石1/4组成骨诱导性最强。

新生血管是细胞氧气、营养物质及代谢产物的运输通道，对于大块骨组织缺损新生的血管长入作用更持久且广泛，但是新生血管长入并布满整块组织工程复合物需要较长的时间，往往就在这段时间(一般认为需要 2 周以上的时间)大块组织工程复合物内部负载细胞就会出现凋亡坏死，延缓骨再生速度并降低骨再生质量。因此在骨修复和再生的过程中，整体快速的营养供应是至关重要的，血管化是实现大块骨再生成功的先决条件，如何调控支架材料的快速血管化并促进负载干细胞的体内存活，是目前限制组织工程骨从基础研究推向临床应用转化的关键问题[15]。实验结果证明，镁黄长石释出的离子成分可以促进内皮细胞的迁移，从而促进血管再生，且镁黄长石1/4组有最多的穿膜细胞数。除了离子作用外，模拟天然血管网络的组织工程支架构建也可以促进骨组织再生过程中的血管化，其中多孔支架为骨缺损修复过程中的快速血管化提供了解决策略。以往的研究发现，多孔支架不仅可以促进血管长入，还可为细胞的迁移和营养物质的交换提供有利条件。但用于骨组织再生的最佳支架孔径大小还未有统一的结论，大孔径支架虽有利于营养供应，但支架的机械强度往往不足，而小孔径支架则不利于细胞的负载和扩散。以往的研究证明，小于400 μm的支架可能会限制血管生长，一般认为500-1 000 μm孔径的支架最适用于骨再生[6-8]。

传统多孔支架的制作方法如气体发泡法、颗粒烧结法和相分离法等，无法控制支架的孔形态、孔隙率及孔间的连通性，而近年来快速发展的3D打印技术克服了传统制作方法的不足[16-17]。结合计算机辅助设计和计算机辅助制造的3D打印技术可以精确控制生物材料沉积，灵活控制支架的几何形状，近年来在骨组织领域被广泛用来制备具有理想孔隙率和孔径的多孔支架[18-19]。同轴3D打印是生物3D打印中一项新技术，选用合适的生物材料可以简单快速地制备具有中空管道结构的支架材料。实验使用具有核/壳结构的改良3D打印喷头，通过同轴3D打印制备了具有空心管道结构的镁黄长石支架，扫描电镜结果显管道外径约1 mm，内径约
500 μm。电感耦合等离子体原子发射光谱法检测发现，镁黄长石支架材料在体外30 d内持续释放钙、镁和硅离子，且与实心支架相比，空心管道的离子释放更快、浓度更高，表明空心管道结构更有利于镁黄长石生物活性离子的释放，为干细胞的成骨分化及内皮细胞迁移创造条件。

综上所述，实验采用改良同轴3D打印技术成功制备了具有空心管道结构的镁黄长石支架，其释放的生物活性离子成分对大鼠骨髓干细胞有明显的成骨诱导性，并可以趋化人脐静脉内皮细胞的迁移，促进血管再生；此外，支架的空心管道结构在体外模拟了血管网络结构，将有利于大块骨缺损修复过程中的快速血管化，具有广泛的临床应用前景。
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文题释义：#br# 镁黄长石：是一种含钙、硅、镁的生物陶瓷，其熔点为1 450 ℃，密度为2.944 g/cm3，在生理条件下释放阳离子，具有良好的生物相容性、力学性能和合适的降解速率，被认为是一种理想的骨再生支架材料。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

镁黄长石是一种含钙、硅、镁的新型生物陶瓷，在生理条件下可以释放生物活性离子，具有良好的生物相容性、力学性能以及合适的降解速率，近年来逐渐被应用于骨组织再生领域。本研究首先探究镁黄长石释放的生物活性离子对大鼠骨髓干细胞增殖、分化的作用，以及对人脐静脉内皮细胞迁移的作用，并采用同轴3D打印技术制备具有中空管道结构的镁黄长石支架材料，以期应用于骨组织再生领域。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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