3D生物打印甲基丙烯酰化明胶水凝胶支架促进软骨下骨缺损的修复

doi:10.12307/2022.455

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (34): 5454-5460.doi: 10.12307/2022.455

• 组织工程软骨材料 tissue-engineered cartilage • 上一篇下一篇

3D生物打印甲基丙烯酰化明胶水凝胶支架促进软骨下骨缺损的修复

路冬冬1，朱天峰1，张一健1，赵志坚1，刘洋1，沈序2，朱雪松1

1苏州大学附属第一医院骨科，江苏省苏州市 215006；2苏州市独墅湖医院骨科，江苏省苏州市 215006

收稿日期:2021-03-17 接受日期:2021-04-15 出版日期:2022-12-08 发布日期:2022-04-15
通讯作者: 朱雪松，研究员，苏州大学附属第一医院骨科，江苏省苏州市 215006 沈序，医师，苏州市独墅湖医院骨科，江苏省苏州市 215006
作者简介:路冬冬，男，1994 年生，江苏省扬州市人，汉族，苏州大学在读硕士，主要从事软骨组织工程研究。朱天峰，男，1996年生，江苏省南通市人，汉族，苏州大学在读硕士，主要从事骨关节炎研究。
基金资助:
江苏省“333工程”科研项目资助计划(BRA2020092)，项目负责人：朱雪松

3D bio-printing methylacrylated gelatin hydrogel scaffolds promote the repair of subchondral bone defects

Lu Dongdong1, Zhu Tianfeng1, Zhang Yijian1, Zhao Zhijian1, Liu Yang1, Shen Xu2, Zhu Xuesong1

1Department of Orthopedics, First Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou 215006, Jiangsu Province, China; 2Department of Orthopedics, Suzhou Dushu Lake Hospital, Suzhou 215006, Jiangsu Province, China

Received:2021-03-17 Accepted:2021-04-15 Online:2022-12-08 Published:2022-04-15
Contact: Zhu Xuesong, Researcher, Department of Orthopedics, First Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou 215006, Jiangsu Province, China Shen Xu, Physician, Department of Orthopedics, Suzhou Dushu Lake Hospital, Suzhou 215006, Jiangsu Province, China
About author:Lu Dongdong, Master candidate, Department of Orthopedics, First Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou 215006, Jiangsu Province, China Zhu Tianfeng, Master candidate, Department of Orthopedics, First Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou 215006, Jiangsu Province, China Lu Dongdong and Zhu Tianfeng contributed equally to this work.
Supported by:
the “333 Project” Scientific Research Project Fund Plan of Jiangsu Province, No. BRA2020092 (to ZXS)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
3D生物打印：又名快速成型、实体自由成型、增材制造等，它以自体干细胞体外诱导分化出的活细胞为种子细胞和包含生长因子在内的胞外基质与材料作为“生物墨水”，制作出符合细胞增殖分化需要的微环境和空间构架，最终搭建出具有生物活性的人造组织器官。
甲基丙烯酰化明胶水凝胶：为一种常见的光固化水凝胶，兼具天然和合成生物材料的特征，具有优异的生物相容性和细胞反应特性，例如提供合适的细胞黏附位点及具有蛋白水解降解性。此外，该水凝胶具有良好的机械性能，其构建的3D支架具有可调的机械和化学性质。

背景：软骨下骨在关节正常生理活动中发挥着重要作用，一旦损伤就难以修复，而传统的骨水泥和自体骨移植治疗方式存在一定的局限性。
目的：探讨以骨髓间充质干细胞或软骨祖细胞作为种子细胞，利用3D生物打印技术将其包封于甲基丙烯酰化明胶水凝胶支架中修复软骨下骨缺损的有效性。
方法：利用纤连蛋白分选获得兔软骨祖细胞，利用全骨髓贴壁法获得兔骨髓间充质干细胞，对比两种细胞的增殖能力及成骨、成软骨、成脂分化能力。通过3D生物打印技术分别制作负载骨髓间充质干细胞与软骨祖细胞的甲基丙烯酰化明胶水凝胶支架，成骨诱导培养后，活死染色分析支架中的细胞存活率，qRT-PCR检测支架的成骨基因表达。在16只新西兰大白兔双侧膝关节处制备直径5 mm、深度5 mm的软骨下骨骨缺损，分4组，A组不做处理，B组植入甲基丙烯酰化明胶水凝胶支架，C组植入负载骨髓间充质干细胞的水凝胶支架，D 组植入负载软骨祖细胞的水凝胶支架，术后6，12周进行骨缺损区Micro-CT扫描与组织学观察。
结果与结论：①骨髓间充质干细胞的增殖能力及成骨和成脂分化能力强于软骨祖细胞，成软骨分化能力弱于软骨祖细胞；②水凝胶支架中的两种细胞均表现出良好的生存能力，并且支架中骨髓间充质干细胞的成骨相关基因骨钙素、骨桥蛋白、Runx-2 mRNA表达均高于软骨祖细胞(P < 0.05)；③动物体内修复实验Micro-CT扫描显示，C组骨组织形成最多，术后12周可见骨小梁结构形成，新生骨形态与周围的天然松质骨类似；A、B组新生骨组织最少；番红快绿结果显示，术后6周时，仅C、D组软骨下骨区域有少量新骨生成；术后12周时，A、B组开始有骨基质生成，C组显示出软骨下骨的大量修复且新骨生成量多于D组；④结果表明，骨髓间充质干细胞与3D生物打印的甲基丙烯酰化明胶水凝胶是适合于骨组织工程的种子细胞与支架材料。
缩略语：甲基丙烯酰化明胶：methylacrylated gelatin，GelMA；骨髓间充质干细胞：bone marrow mesenchyml stem cells，BMSCs；软骨祖细胞：chondroprogenitor cells，CPCs

https://orcid.org/0000-0003-4856-4270 (路冬冬)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 甲基丙烯酰化明胶, 水凝胶, 骨髓间充质干细胞, 软骨祖细胞, 3D生物打印, 支架, 软骨下骨

Abstract: BACKGROUND: Subchondral bone plays an important role in normal physiological activities of joints and is difficult to repair once it is damaged. Traditional bone cement and autologous bone grafting treatment methods have certain limitations.
OBJECTIVE: To explore the efficacy of bone marrow mesenchymal stem cells or chondroprogenitor cells encapsulated in 3D bio-printing methylacrylated gelatin hydrogel scaffolds to repair subchondral bone defects.
METHODS: Chondroprogenitor cells were obtained by fibronectin sorting method and rabbit bone marrow mesenchymal stem cells were obtained by whole bone marrow adherent method. The proliferation, osteogenic, chondrogenic, and adipogenic differentiation abilities were compared between the two groups. Methylacrylated gelatin hydrogel scaffolds loaded with bone marrow mesenchymal stem cells and chondroprogenitor cells were prepared by 3D bio-printing. After osteogenic induction and culture, the survival rate of cells in the scaffold was analyzed by live-dead staining. The osteogenic gene expression of the scaffold was detected by qRT-PCR. Subchondral bone defects with a diameter of 5 mm and a depth of 5 mm were prepared at the bilateral knee joints of 16 New Zealand white rabbits. They were divided into four groups. Group A was not treated. Group B was implanted with methylacrylated gelatin hydrogel scaffold. Group C was implanted with a hydrogel scaffold loaded with bone marrow mesenchymal stem cells. Group D was implanted with a hydrogel scaffold loaded with chondroprogenitor cells. Micro-CT scanning and histological observation of the bone defect area were performed at 6 and 12 weeks after surgery.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The proliferation, osteogenic and adipogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells were higher than those of chondroprogenitor cells. The chondrogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells was weaker than that of chondroprogenitor cells. (2) Bone marrow mesenchymal stem cells and chondroprogenitor cells in the hydrogel scaffolds showed good viability. The mRNA expression of osteogenic related genes of bone marrow mesenchymal stem cells including osteocalcin, osteopontin and runt-related transcription factor 2 in the scaffold was higher than that of chondroprogenitor cells (P < 0.05). (3) The micro-CT scan of the animal repair experiment showed that the bone tissue formed in Group C was the most, and the trabecular bone structure was formed at 12 weeks after the operation. The shape of the new bone was similar to the surrounding natural cancellous bone; the new bone tissue in groups A and B was the least. The Safranin O/fast green staining results showed that at 6 weeks after surgery, only a small amount of new bone was formed in the subchondral bone area of Groups C and D. At 12 weeks after surgery, bone matrix was formed in Groups A and B. Group C showed massive repairs of subchondral bone. More new bone formation was found in Group C compared with Group D. (4) Results suggested that bone marrow mesenchymal stem cells and 3D bio-printing methylacrylated gelatin hydrogel scaffold were suitable for seed cells and scaffolds for bone tissue engineering.

Key words: methylacrylated gelatin, hydrogel, bone marrow mesenchymal stem cells, chondroprogenitor cells, 3D bio-printing, scaffold, subchondral bone

中图分类号:

路冬冬, 朱天峰, 张一健, 赵志坚, 刘洋, 沈序, 朱雪松. 3D生物打印甲基丙烯酰化明胶水凝胶支架促进软骨下骨缺损的修复[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(34): 5454-5460.

Lu Dongdong, Zhu Tianfeng, Zhang Yijian, Zhao Zhijian, Liu Yang, Shen Xu, Zhu Xuesong. 3D bio-printing methylacrylated gelatin hydrogel scaffolds promote the repair of subchondral bone defects[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(34): 5454-5460.

图/表（结果） 8

2.1 BMSCs与CPCs形态学观察及增殖能力比较镜下观察可见，兔BMSCs呈长梭形，CPCs呈短纺锤形，见图2A，两者均表现出典型的间充质干细胞形态。CCK-8实验结果显示，CPCs培养第1，3，5，7天的吸光度值都要低于BMSCs(P < 0.001，P < 0.000 1)，见图2B。在细胞培养皿中培养2周后，CPCs能形成(88.33±3.05)个的克隆集落，BMSCs能形成(112.67±4.04)个克隆集落，表明同等条件下CPCs的增殖能力要弱于BMSCs，见图2C，D。

2.2 BMSCs与CPCs的成骨、成软骨和成脂分化能力两种细胞在体外均能成功分化出骨(钙结节)、软骨(胶原)和脂肪(脂滴)，但成骨、成脂和成软骨能力存在着差异。BMSCs的成骨诱导分化能力似乎比CPCs强，茜素红染色显示，BMSCs经诱导后产生的钙结节形状不规则，呈弥漫性，CPCs形成的钙结节形状呈圆形或椭圆形，且数目较少；BMSCs分化出更多橙红色的脂滴，且多呈串珠状，成脂诱导能力较CPCs强；BMSCs甲苯胺蓝染色较CPCs弱，成软骨诱导能力不如CPCs，见图3。

2.3 BMSCs与CPCs的表面标志物比较流式细胞术检测结果显示，P2代的BMSCs和CPCs间充质干细胞表面标志物整合素CD29、内皮素CD90表达呈强阳性，不表达造血细胞表面标志物，如脂多糖受体CD34、白细胞抗原CD45，见图4。表明软骨来源的CPCs与BMSCs一样，共同表达类似于间充质干细胞的表面标志物。

2.4 GelMA水凝胶支架内细胞存活率 3D生物打印后第3天，GelMA+BMSCs水凝胶支架和GelMA+CPCs水凝胶支架中大部分细胞呈绿色，只有极少数细胞染色呈红色，表明水凝胶支架内的细胞大部分存活，两组细胞存活率分别为(85.71±2.19)%与(83.58±0.61)%，细胞表现出良好的生存状态，见图5。由此可见，GelMA水凝胶具有较好的生物相容性。

2.5 水凝胶支架内细胞成骨相关基因表达在成骨诱导培养基中培养21 d后，GelMA+BMSCs支架组的成骨相关基因骨钙素、骨桥蛋白和Runx-2 mRNA的表达均高于GelMA+CPCs支架组，分别上调了3.08，2.20，1.84倍(P < 0.05，P < 0.000 1)，见图6。

2.6 动物体内实验观察结果
Micro-CT扫描和重建：GelMA+BMSCs支架组术后6，12周形成最多的骨组织，术后12周可见骨小梁结构形成，新生骨的形态与周围的天然松质骨类似；GelMA+BMSCs支架组的新生骨体积分数和矿物质密度在各组中均是最高，GelMA+CPCs支架组次之，GelMA支架组和空白组新生的骨组织最少，见图7。

番红快绿染色：术后6周时，空白组和单纯GelMA支架组几乎无新骨生成，GelMA+BMSCs支架组和GelMA+CPCs支架组软骨下骨区域有少量新骨生成；术后12周时，空白组和单纯GelMA支架组开始有骨基质生成，GelMA+BMSCs支架组显示出软骨下骨的大量修复，软骨下骨区域呈强烈深蓝染色，与呈现红色的软骨形成了鲜明的对比，GelMA+CPCs支架组缺损部位生成的新骨较GelMA+BMSCs支架组少，但多于空白组和单纯支架组，见图8。

2.7 水凝胶支架的生物相容性由体外实验与体内实验可知，GelMA水凝胶支架具有良好的细胞相容性与组织相容性。

参考文献

[1] BRITTBERG M, RECKER D, ILGENFRITZ J, et al. Matrix-Applied Characterized Autologous Cultured Chondrocytes Versus Microfracture: Five-Year Follow-up of a Prospective Randomized Trial. Am J Sports Med. 2018;46(6):1343-1351.
[2] IIJIMA H, AOYAMA T, ITO A, et al. Immature articular cartilage and subchondral bone covered by menisci are potentially susceptive to mechanical load. BMC Musculoskelet Disord. 2014;15(2):101.
[3] LORIES RJ, LUYTEN FP. The bone-cartilage unit in osteoarthritis. Nat Rev Rheumatol. 2011;7(1):43-49.
[4] FRAQUET N, FAIZON G, ROSSET P, et al. Long bones giant cells tumors: treatment by curretage and cavity filling cementation. Orthop Traumatol Surg Res. 2009;95(6):402-406.
[5] PARK JH, CHAE IJ, HAN SB, et al. Arthroscopic burring of exposed cement following curettage and cavity filling cementation for chondroblastoma of the proximal tibia. Knee Surg Relat Res. 2015; 27(1):61-64.
[6] HOHMANN E, TETSWORTH K. Large osteochondral lesions of the femoral condyles: Treatment with fresh frozen and irradiated allograft using the Mega OATS technique. Knee. 2016;23(3):436-441.
[7] HANGODY L, KISH G, KARPATI Z, et al. Arthroscopic autogenous osteochondral mosaicplasty for the treatment of femoral condylar articular defects. A preliminary report. Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc. 1997;5(4):262-267.
[8] PITTENGER MF, MACKAY AM, BECK SC, et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 1999;284(5411):143-147.
[9] DOWTHWAITE GP, BISHOP JC, REDMAN SN, et al. The surface of articular cartilage contains a progenitor cell population. J Cell Sci. 2004; 117(Pt 6):889-897.
[10] RAMASAMY R, TONG CK, SEOW HF, et al. The immunosuppressive effects of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells target T cell proliferation but not its effector function. Cell Immunol. 2008;251(2):131-136.
[11] TABATABAEI F, MOHARAMZADEH K, TAYEBI L. Fibroblast encapsulation in gelatin methacryloyl (GelMA) versus collagen hydrogel as substrates for oral mucosa tissue engineering. J Oral Biol Craniofac Res. 2020; 10(4):573-577.
[12] MORONI L, BURDICK JA, HIGHLEY C, et al. Biofabrication strategies for 3D in vitro models and regenerative medicine. Nat Rev Mater. 2018; 3(5):21-37.
[13] 刘伟,陈剑,宋佳,等.兔骨髓间充质干细胞的分离、培养及鉴定[J].中国实验诊断学,2013,17(8):1366-1369.
[14] CHEN P, ZHENG L, WANG Y, et al. Desktop-stereolithography 3D printing of a radially oriented extracellular matrix/mesenchymal stem cell exosome bioink for osteochondral defect regeneration. Theranostics. 2019;9(9):2439-2459.
[15] KOELLING S, KRUEGEL J, IRMER M, et al. Migratory chondrogenic progenitor cells from repair tissue during the later stages of human osteoarthritis. Cell Stem Cell. 2009;4(4):324-335.
[16] GONG H, FEI H, XU Q, et al. 3D-engineered GelMA conduit filled with ECM promotes regeneration of peripheral nerve. J Biomed Mater Res A. 2020;108(3):805-813.
[17] TABATABAEI F, MOHARAMZADEH K, TAYEBI L. Fibroblast encapsulation in gelatin methacryloyl (GelMA) versus collagen hydrogel as substrates for oral mucosa tissue engineering. J Oral Biol Craniofac Res. 2020; 10(4):573-577.
[18] SHAHABIPOUR F, OSKUEE RK, DEHGHANI H, et al. Cell-cell interaction in a coculture system consisting of CRISPR/Cas9 mediated GFP knock-in HUVECs and MG-63 cells in alginate- GelMA based nanocomposites hydrogel as a 3D scaffold. J Biomed Mater Res A. 2020;108(8):1596-1606.
[19] ZHAO X, LIU S, YILDIRIMER L, et al. Injectable Stem Cell-Laden Photocrosslinkable Microspheres Fabricated Using Microfluidics for Rapid Generation of Osteogenic Tissue Constructs. Adv Funct Mater. 2016;26(17):2809-2819.
[20] RATHEESH G, VAQUETTE C, XIAO Y. Patient-Specific Bone Particles Bioprinting for Bone Tissue Engineering. Adv Healthc Mater. 2020; 9(23):e2001323.
[21] HUANG L, ZHANG Z, GUO M, et al. Biomimetic Hydrogels Loaded with Nanofibers Mediate Sustained Release of pDNA and Promote In Situ Bone Regeneration. Macromol Biosci. 2021;21(4):e2000393.
[22] GAO J, DING X, YU X, et al. Cell-Free Bilayered Porous Scaffolds for Osteochondral Regeneration Fabricated by Continuous 3D-Printing Using Nascent Physical Hydrogel as Ink. Adv Healthc Mater. 2021;10(3): e2001404.

引言

关节软骨是位于关节中与骨相连的表面有弹性的负重组织，而软骨下骨位于骨与软骨交界，由上层的皮质终板及下方松质骨的骨小梁结构组成[1]。软骨下骨在关节正常生理活动中发挥着重要的作用，承担着吸收机械性震荡、承受力学负荷及连接骨与软骨的作用[2]。由于软骨下骨的生物力学特性特殊，一旦发生病变将直接削弱其对软骨的支撑功能，同时造成关节软骨损伤及钙化增加，引发骨关节炎乃至其他更严重的疾病[3]。目前临床上为了应对软骨下骨严重损伤，常采用骨水泥和自体骨移植来填充受损部位，以期恢复对软骨的支撑作用，但骨水泥凝聚时造成的热损伤会破坏软骨与软骨下骨的力学传导性能，引发继发性关节炎[4-5]，而自体骨移植存在着取骨部位疼痛增加、感染及大的骨质缺损来源有限等局限性[6-7]。近年来由于材料科学的飞速发展，以往单靠生物学线索难以完成骨软骨缺损修复所遇到的瓶颈，促使研究人员开始思考将细胞生物学与材料科学结合起来，于是组织工程技术便应运而生。组织工程技术的原理简单来说，就是从机体获取少量的活体细胞后在体外进行扩增，然后将细胞与具有良好生物学性能的材料混合，形成细胞-材料复合物，必要的情况下辅之以功能性的药物，最终将该复合物植入机体病损部位，以期达到修复创伤和重建功能的目的。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchyml stem cells，BMSCs)和软骨祖细胞(chondroprogenitor cells，CPCs)被认为是多潜能细胞，具有高度克隆性和多能性，在一定条件下可以经诱导分化为中胚层组织谱系，包括骨、软骨、脂肪、肌腱、肌肉和骨髓基质[8-9]。另一方面，关于间充质干细胞免疫特性的初步研究表明，它们不仅不能刺激异基因T细胞，而且还表现出积极的免疫抑制作用[10]，揭示了它们有可能被用于同种异体移植，避免发生移植物抗宿主病和自身免疫。

甲基丙烯酰化明胶(methylacrylated gelatin，GelMA)是一种双键改性明胶，作为典型的光固化水凝胶，其可通过紫外及可见光在光引发剂作用下10 s内固化成胶。GelMA水凝胶兼具天然和合成生物材料的特征，其具有适于细胞生长和分化的三维结构[11]。另外，GelMA 水凝胶还具有良好的机械性能，其构建的支架具有可调的机械和化学性质。这些特点使得GelMA水凝胶已成为各种组织或器官生物制造的生物墨水的理想选择。3D生物打印技术是在组织工程结构中实现空间变化的独特工具，因为它们能够精确控制生物材料、细胞及生物活性分子的空间位置，是一种新发展和迅速发展的技术[12]。实验应用组织工程技术原理，探讨使用负载BMSCs和CPCs的3D生物打印GelMA水凝胶支架修复兔软骨下骨缺损的效果，为临床修复软骨下骨缺损提供新的治疗策略。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验，组间数据比较采用成组t检验、单因素方差分析及Tukey多重比较检验。
1.2 时间及地点实验于2020年6-12月在苏州大学附属第一医院完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物雌性新西兰大白兔17只，2月龄，由上海灵畅生物科技有限公司提供，实验动物机构许可证号：SCXK(沪)2018-0003。该实验经过苏州大学伦理委员会批准。
1.3.2 实验试剂 GelMA、GelMA裂解液(苏州EFL实验室)；胎牛血清、青-链霉素、胰蛋白酶、PBS(美国Gibco公司)；α-MEM培养基、高糖DMEM培养基(美国Hyclone公司)；CCK-8(日本东仁化学)；流式抗体、Trizol(美国Invitrogen公司)；反转录试剂盒(Takara公司)；纤连蛋白、Ⅱ型胶原酶、地塞米松、β-磷酸甘油钠、维生素C、异丁基甲基黄嘌呤、吲哚美辛、ITS (美国Sigma公司)；转化生长因子β1、胰岛素样生长因子(美国R&D公司)；活死染色试剂盒(上海碧云天公司)。
1.4 方法
1.4.1 BMSCs与CPCs的分离与培养
BMSCs的分离与培养[13]：取1只新西兰大白兔，按2%戊巴比妥溶液(1 mL/kg)耳缘静脉注射麻醉后，下肢局部备皮消毒后，在股骨大转子处行骨髓穿刺术，用注射器抽吸三四毫升的骨髓液至15 mL离心管中，加入新鲜的α-MEM完全培养基(α-MEM基础培养基+体积分数10%胎牛血清+1%青-链霉素)，1 200 r/min离心5 min，弃去上清和脂肪；裂解红细胞后加入新鲜的α-MEM完全培养基重悬，接种于培养皿中；48 h后换液，去除未贴壁细胞，加入新鲜的培养基后继续培养；每周换液2次。待到贴壁细胞融合80%-90%时进行细胞消化传代培养，传代至P2代备用。
CPCs的分离与培养：上文同一只新西兰大白兔过量戊巴比妥耳缘静脉注射处死后，无菌条件下打开兔膝关节，在关节软骨表面削取透明软骨组织并剪碎后放入无菌PBS中。用10倍软骨体积的0.2%Ⅱ型胶原酶溶液在37 ℃恒温摇床中振荡消化软骨组织。约4 h消化完全后，通过细胞筛网获得单细胞悬液，在纤连蛋白溶液预铺板的培养皿中孵育20 min，之后弃去未贴壁的细胞，加入α-MEM完全培养基，待细胞融合至80%-90%时进行细胞消化传代，传代至P2代备用。
1.4.2 CCK-8增殖实验与克隆形成率实验
CCK-8增殖实验：分别取P2代的BMSCs和CPCs，以1 000个/孔的密度接种于96孔板中。培养第1，3，5，7天时，加入100 μL CCK-8工作液(CCK-8原液∶培养基=1∶9)避光孵育。2 h后，每孔吸出上清液于新的96孔板中，于全波长酶标仪上测定450 nm处的吸光度值。
克隆形成率实验：分别取P2代的BMSCs和CPCs，按3 000个/皿接种于培养皿中，摇晃使细胞分布均匀。每3 d换液一次。培养2周后行结晶紫染色，统计直径大于2 mm的集落数。
1.4.3 BMSCs与CPCs的鉴定
成骨、软骨和成脂分化实验：取P2代的BMSCs和CPCs，按每孔105个细胞种于6孔板中。待细胞融合至70%-80%后，分别加入成骨诱导培养基(高糖DMEM培养基+50 μg/L维生素 C+10 mmol/L β-磷酸甘油钠+10-7 mol/L地塞米松+体积分数10%胎牛血清)、成软骨诱导培养基(高糖DMEM培养基+10 µg/L 转化生长因子β1+40 µg/L胰岛素样生长因子+10-7 mol/L地塞米松 +1%ITS)和成脂诱导培养基(高糖DMEM完全培养基+10-7 mol/L地塞米松+0.5 mmol/L异丁基甲基黄嘌呤+0.05 mmol/L吲哚美辛+体积分数10%胎牛血清)。每3 d换液一次。21 d后分别行茜素红S染色、甲苯胺蓝染色和油红染色实验。
流式细胞术检测：取P2代的CPCs和BMSCs，胰蛋白酶消化后分别加入等量完全培养基终止。1 200 r/min离心5 min后弃去上层液体，用含体积分数2%胎牛血清的PBS重悬，细胞计数后，分别转移至1.5 mL EP管中，调整EP管中细胞悬液浓度为5×108 L-1。分别加入0.5 μL的CD29-PE、CD34-FITC、CD45- APC、 CD90-PE，对照组分别加入上述4种抗体的同型对照抗体。 4 ℃下避光孵育30 min，1 500 r/min离心5 min，PBS洗涤细胞沉淀，重复洗涤步骤一次；最终用含体积分数1%胎牛血清的PBS重悬，利用流式细胞仪检测。
1.4.4 支架打印通过3D生物打印技术分别制作GelMA水凝胶支架、负载BMSCs的GelMA水凝胶支架与负载CPCs的GelMA水凝胶支架。
生物墨水配制：将I2959引发剂(0.05%)溶解到PBS中，加入一定量的GelMA(8%)，60 ℃完全溶解后静置至无气泡状态后用于打印；如果要加细胞打印，则将细胞先用PBS重悬，所有材料需无菌滤器过滤除菌。
打印参数设置：针头内径0.3 mm，线条间隔1.0 mm，打印角度90°，细胞浓度为2×109 L-1，打印压力40 kPa，打印速度2 mm/s；打印成型后的水凝胶支架用紫外手电筒交联约30 s，形成底面直径5 mm，高度4 mm的多孔圆柱形结构，如图1A，交联完全后加入成骨诱导分化培养基中置于培养箱培养。
1.4.5 细胞存活率实验按照活死染色试剂盒说明书来进行活死染色，按钙黄绿素AM(Calcein AM)∶碘化丙啶(PI)∶检测缓冲液=1∶1∶1 000配制活死染色检测工作液。于第3天分别取出GelMA+BMSCs和GelMA+CPCs水凝胶支架，PBS冲洗后，加入适量的染色检测工作液，量以浸没整个支架为准，37 ℃避光孵育30 min。孵育结束后，PBS冲洗后置于倒置显微镜下观察。Calcein AM染色活细胞显示绿色荧光，PI染色死细胞显示红色荧光。
1.4.6 qRT-PCR检测于第21天从成骨诱导分化培养基中取出GelMA+BMSCs和GelMA+CPCs水凝胶支架，PBS冲洗3次后加入适量GelMA裂解工作液，吹打后于37 ℃恒温孵育约2 h。支架裂解完全后离心，所获得的细胞沉淀加入Trizol试剂提取总RNA，并经反转录后变成cDNA，用于Realtime-PCR。
PCR扩增条件：95 ℃温度下预变性30 s，95 ℃温度下变性5 s，60 ℃温度下延伸30 s，用荧光法作定量分析，重复40次实验。用Realtime-PCR来测定两组支架中BMSCs和CPCs成骨相关基因(骨钙素、骨桥蛋白、Runx-2)的表达，以管家基因(GAPDH)作为内参。引物序列见表1。

1.4.7 动物实验取16只新西兰大白兔，分2批耳缘静脉注射2%戊巴比妥钠溶液(1 mL/kg)麻醉，下肢局部剃毛备皮消毒后，双侧膝外侧髌骨旁切口入路，切开皮肤和皮下筋膜，膝关节过伸，髌骨向内侧脱位，暴露股骨内外侧髁及滑车；在股骨内髁和外髁之间的关节滑车处，采用平头钻头按垂直于滑车切面方向钻孔，钻孔直径5 mm、深度5 mm，以刮匙刮除缺损处游离骨质至软骨下骨板，如图1B。每批分别植入GelMA +BMSCs水凝胶支架(n=4)、GelMA+CPCs水凝胶支架(n=4)和单纯GelMA水凝胶支架(n=4)，如图1C，空白组(n=4)只钻孔，不做任何处理。生理盐水反复冲洗后逐层缝合膝关节囊、肌肉筋膜组织和皮肤切口。

术后将兔送回动物房，自由活动，每只兔每天肌注青霉素20×104 U，肌注3 d。术后6，12周，对实验兔进行安乐死分别处死，取材股骨下段(包括关节面)，剪去股骨下段附着的肌腱和肌肉，加入体积分数10%甲醛溶液固定24 h。固定结束后行Micro-CT扫描，扫描完成后脱钙包埋，切片后行番红快绿染色。番红快绿染色染色简要步骤：二甲苯脱蜡→梯度乙醇脱苯→水洗脱醇→苏木精染色→水洗后分化反蓝→快绿染色→番红O染色→脱水封固。
1.5 主要观察指标 GelMA水凝胶支架中两种细胞的存活率与成骨分化情况，以及负载细胞GelMA水凝胶支架修复软骨下骨缺损的效果。
1.6 统计学分析数据以x±s表示。用Graphpad Prism 8.0软件进行统计分析，使用成组t检验、单因素方差分析及Tukey多重比较检验来分析确定各组数据间的统计学差异性，P < 0.05被认为差异有显著性意义。

讨论

3D生物打印通常被定义为“利用3D打印技术操纵含有活细胞的材料构造活性结构”，因此3D生物打印功能化的关键之一在于细胞的选用。

目前骨组织工程3D生物打印的种子细胞来源主要包括BMSCs[14]、脂肪干细胞、羊膜脐带干细胞等多能干细胞及患者自体细胞。考虑到骨组织修复的方式主要分为膜内成骨和软骨内成骨，膜内成骨机制主要是骨损伤附近的骨内、外膜增生，新生血管长入，间充质干细胞分化而来的成骨细胞增生并分泌骨基质，逐渐骨化而形成新骨；软骨内成骨主要是通过骨损伤附近形成的纤维组织逐渐转化为软骨组织，成骨细胞侵入软骨基质，使其发生钙化而成骨，是大部分长骨、短骨及颌骨等不规则骨的修复方式。此次实验为了对应膜内成骨中的BMSCs选用了CPCs，一种介于间充质干细胞与终末分化软骨细胞之间的中间祖细胞群来尽可能模拟软骨内成骨[15]。首先通过中胚层三系分化实验和流式细胞术发现两种细胞均能在体外成功发生成骨、软骨和脂肪分化，且高表达基质细胞标志物CD29、CD90，不表达造血细胞标志物CD34、CD45，证明分离出的BMSCs和CPCs均符合间充质干细胞的定义。但这两种细胞的扩增能力和三系分化能力存在着差异，具体而言，BMSCs的增殖能力强于CPCs，相同诱导条件下CPCs的成软骨诱导甲苯胺蓝染色更强烈，而BMSCs成骨诱导形成的钙结节更多、更密集，这表明在同样条件下BMSCs的成骨能力更强。对于骨组织工程来说，BMSCs无疑是最为合适的种子细胞。

GelMA水凝胶由甲基丙烯酸酯基团与胶原胺侧基团结合而成，由于其具有相对较高的机械强度、较低的膨胀率，同时能提供合适的细胞黏附位点及蛋白水解降解性，因而可以取代人工基底膜或其他天然胶原蛋白水凝胶[16]，目前已被广泛用于组织工程[17-18]。此次实验体外活死染色显示，GelMA水凝胶支架中的细胞存活率较高，表明了GelMA水凝胶和3D生物打印工艺优越的生物相容性。

目前，已有不少研究在骨组织工程中使用GelMA水凝胶来促进骨修复与骨形成。ZHAO等[19]利用微流控技术制备的GelMA微球来捕获BMSCs和生长因子，证明了GelMA微球可以维持干细胞活力，支持细胞在微球内扩散和定向迁移，并增强细胞增殖效率，最终生成可注射的成骨组织结构。为了解决3D生物打印结构的生物功能问题，RATHEESH等[20]设计了一种基于GelMA的自体骨颗粒生物功能化生物墨水，结果显示墨水中包含的细胞能够迁移和锚定于生物打印支架的表面，同时还保持了表达早期成骨标志物的能力。HUANG 等[21]将携带DNA质粒的纳米纤维引入到GelMA和硫醇化壳聚糖水凝胶中，制备的新型复合水凝胶在体内可以显著促进成骨和血管形成，意味着这种仿生复合水凝胶支架是骨修复再生材料的极佳候选者。体内实验证明，作者设计出的负载BMSCs的GelMA水凝胶支架相较于负载CPCs的支架能够产生更多的骨基质，有效重现软骨下骨的骨小梁结构，促进软骨下骨的修复。有趣的是，除了软骨下骨的修复，还发现负载BMSCs和CPCs的水凝胶支架也能够有效形成软骨样组织来填充软骨缺损，表明3D生物打印的GelMA支架还具有修复软骨损伤的潜力，目前已有相关研究报道了使用3D打印GelMA水凝胶作为软骨仿生支架来促进兔模型软骨缺损再生，成功实现了软骨陷窝形成和软骨再生[22]。但就骨组织修复而言，BMSCs比CPCs更适合于作为种子细胞，而3D生物打印不失为一种相对优良的支架生物制造方法。此次实验主要评价了GelMA水凝胶支架修复软骨下骨的生物学效果，并未对水凝胶的机械性能乃至修复的软骨下骨的力学性能做进一步的研究，这也是该研究的不足之处，在后续的研究中会进一步探讨。

实验应用了一种新的方法即3D生物打印技术将活细胞(BMSCs和CPCs)整合至GelMA水凝胶材料中，这种方法在软骨下骨再生方面具有潜在的应用价值。BMSCs仍是骨组织工程中最适合的种子细胞。另外，使用的水凝胶材料及3D生物打印工艺对细胞存活率影响较小，因此允许在体内外进行骨组织工程，希望这些结果能够为下一代模拟活体组织的多材料、复合组织的生物制造提供重要线索。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

3D生物打印甲基丙烯酰化明胶水凝胶支架促进软骨下骨缺损的修复

3D bio-printing methylacrylated gelatin hydrogel scaffolds promote the repair of subchondral bone defects

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 8

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	肖豪, 刘静, 周君. 脉冲电磁场治疗绝经后骨质疏松症的研究进展[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1266-1271.
[2]	田川, 朱向情, 杨再玲, 鄢东海, 李晔, 王严影, 杨育坤, 何洁, 吕冠柯, 蔡学敏, 舒丽萍, 何志旭, 潘兴华. 骨髓间充质干细胞调控猕猴卵巢的衰老[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 985-991.
[3]	胡伟, 谢兴奇, 屠冠军. 骨髓间充质干细胞来源外泌体改善脊髓损伤后血脊髓屏障的完整性[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 992-998.
[4]	侯婧瑛, 郭天柱, 于萌蕾, 龙会宝, 吴浩. 缺氧预处理通过激活MALAT1靶向抑制miR-195促进骨髓间充质干细胞的生存和血管形成[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1005-1011.
[5]	梁学振, 杨曦, 李嘉程, 骆帝, 许波, 李刚. 补肾活血胶囊介导Hedgehog信号通路调控大鼠骨髓间充质干细胞成骨成脂分化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1020-1026.
[6]	房晓磊, 冷军, 张晨, 刘会敏, 郭文. 间充质干细胞不同移植途径治疗缺血性脑卒中疗效差异的系统评价[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1085-1092.
[7]	黄传俊, 邹煜, 周晓婷, 朱扬清, 钱伟, 张卫, 刘星. 携带脐带间充质干细胞的RADA16-BDNF水凝胶支架定向移植促进脑出血大鼠神经功能恢复[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(4): 510-515.
[8]	谭国忠, 涂欣冉, 郭黎洋, 钟嘉琳, 张阳, 江千舟. 3D打印明胶/海藻酸钠/58S生物玻璃骨缺损修复支架的生物安全性评价[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(4): 521-527.
[9]	何冠宇, 徐宝山, 杜立龙, 张同星, 霍振鑫, 申力. 天然丝素蛋白构建仿生取向微通道纤维环支架[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(4): 560-566.
[10]	杨峰, 赵骞, 张世轩, 赵铁男, 冯博. 雷帕霉素联合CD133抗体支架预防血管再狭窄的有效性和安全性[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(4): 579-584.
[11]	陈晓旭, 罗雅馨, 毕浩然, 杨琨. 脱细胞支架制备及其在组织工程和再生医学中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(4): 591-596.
[12]	康坤龙, 王新涛. 生物支架材料促进骨髓间充质干细胞成骨分化的研究热点[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(4): 597-603.
[13]	王阮彬, 程丽乾, 陈凯. 高分子材料在3D打印生物骨骼及支架中的应用与价值[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(4): 610-616.
[14]	张通, 蔡金池, 袁志发, 赵海燕, 韩兴文, 王文己. 基于透明质酸的复合水凝胶修复骨关节炎软骨损伤：应用与机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(4): 617-625.
[15]	张圣敏, 曹长红, 王宁宁, 王静, 李章一. 负载去铁胺聚乳酸-羟基乙酸/羟基磷灰石复合支架的血管化成骨[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(34): 5413-5418.