外源性硫化氢对双侧卵巢摘除骨质疏松模型大鼠骨代谢的影响

doi:10.12307/2021.161

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (29): 4632-4637.doi: 10.12307/2021.161

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外源性硫化氢对双侧卵巢摘除骨质疏松模型大鼠骨代谢的影响

赖鸿辉1，刘跃1，李体远1，潘晓华2，徐忠世1

1暨南大学第二临床医学院(深圳市人民医院)骨关节科，广东省深圳市 518000；2深圳市宝安区人民医院骨科，广东省深圳市 518000

收稿日期:2020-09-27 修回日期:2020-09-28 接受日期:2020-12-07 出版日期:2021-10-18 发布日期:2021-06-02
通讯作者: 徐忠世，博士，主任医师，暨南大学第二临床医学院(深圳市人民医院)骨关节科，广东省深圳市 518000
作者简介:赖鸿辉，男，1994年生，广东省广州市人，汉族，2018年暨南大学毕业，医师。
基金资助:
深圳市知识创新计划基础研究项目(JCYJ20150403101028168)，项目负责人：徐忠世

Effect of exogenous hydrogen sulfide on bone metabolism in an ovariectomized osteoporotic rat model

Lai Honghui1, Liu Yue1, Li Tiyuan1, Pan Xiaohua2, Xu Zhongshi1

1Department of Orthopedics, Jinan University Second Clinical School (Shenzhen People's Hospital), Shenzhen 518000, Guangdong Province, China; 2Department of Orthopedics, Baoan District People’s Hospital, Shenzhen 518000, Guangdong Province, China

Received:2020-09-27 Revised:2020-09-28 Accepted:2020-12-07 Online:2021-10-18 Published:2021-06-02
Contact: Xu Zhongshi, MD, Chief physician, Department of Orthopedics, Jinan University Second Clinical School (Shenzhen People's Hospital), Shenzhen 518000, Guangdong Province, China
About author:Lai Honghui, Physician, Department of Orthopedics, Jinan University Second Clinical School (Shenzhen People's Hospital), Shenzhen 518000, Guangdong Province, China
Supported by:
Basic Research Project of Shenzhen Knowledge Innovation Plan, No. JCYJ20150403101028168 (to XZS)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
骨质疏松：是以骨量减少、骨的微观结构退化为特征的，致使骨的脆性增加以及易于发生骨折的一种全身性骨胳疾病，是骨科及老年科等相关科室常见病、多发病。
H2S：内源性H2S在体内多种系统的生理及病理生理方面起着重要作用，通过细胞内外信号传递途径调节许多重要的细胞功能，被认为是继一氧化氮和一氧化碳后发现的第3种内源性气体信号分子。外源性H2S可以通过ERK1/2依赖的抗氧化机制刺激成骨细胞的形成和分化，在体外细胞实验中成功抑制了双氧水诱导的成骨细胞株系MC3T-E1氧化损伤。

背景：外源性硫化氢(H2S)对成骨细胞的形成和分化有重要的影响，成骨细胞是骨质疏松疾病发生发展的重要功能细胞，而外源性H2S对骨质疏松水平及相关激素的影响尚未见研究。
目的：探讨内源性H2S浓度与骨质疏松的相关性，以及补充外源性H2S对骨代谢临床随访常用生化、激素指标的影响。
方法：纳入60只大鼠，随机分为3组(n=20)，模型组、外源性H2S组通过切除大鼠双侧卵巢建立经典的骨质疏松模型，假手术组进行假手术处理，不做卵巢切除术。假手术组、模型组大鼠腹腔注射1 mg/kg生理盐水，外源性H2S组大鼠腹腔注射100 μg/kg 外源性H2S缓释剂GYY4137，用药频率均为2 d 1次，实验期为12周。定量对比分析各组大鼠血浆H2S水平、血钙和血磷浓度以及血浆碱性磷酸酶活性、骨钙素、降钙素、甲状旁腺素、瘦素表达水平。
结果与结论：①与假手术组相比，给药第8，12周模型组大鼠L5骨密度、血浆H2S、钙、磷、碱性磷酸酶、降钙素水平显著降低，骨钙素、甲状旁腺素、瘦素水平则显著升高(P < 0.05)；②与假手术组相比，给药第8，12周外源性H2S组L5骨密度、血浆H2S、磷、骨钙素、降钙素、甲状旁腺素和瘦素差异无显著性意义(P > 0.05)，而血浆钙水平、碱性磷酸酶活性仍降低(P < 0.05)；③与模型组相比，外源性H2S组血浆H2S、钙、磷水平升高，瘦素水平降低(P < 0.05)，而给药第8，12周L5骨密度、碱性磷酸酶活性、骨钙素、降钙素、甲状旁腺素水平差异均无显著性意义(P > 0.05)；④结果表明，内源性H2S浓度与去势大鼠骨质疏松模型的骨质疏松病情呈现负相关关系，外源性补充提高血浆H2S浓度可以改善或反转血浆钙、磷和部分骨代谢激素指标水平；提示血浆H2S浓度与骨质疏松存在相关性，补充外源性H2S对因雌激素减少导致的骨质疏松症具有潜在治疗效果。
https://orcid.org/0000-0002-3463-3266 (赖鸿辉)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 雌激素, 骨质疏松, H2S, 骨代谢, 钙, 磷, 激素

Abstract: BACKGROUND: Exogenous hydrogen sulfide has an important effect on the formation and differentiation of osteoblasts, which are important functional cells in the development of osteoporotic disease. The effect of exogenous hydrogen sulfide on osteoporosis levels and related hormones has not been studied.
OBJECTIVE: To investigate the correlation between endogenous hydrogen sulfide concentration and osteoporosis, and the effect of exogenous hydrogen sulfide supplementation on the biochemical and hormonal parameters commonly used in the clinical follow-up of bone metabolism.
METHODS: Sixty rats were randomly divided into sham-operated group, model group, and exogenous hydrogen sulfide group (n=20 per group). A classical osteoporosis model was established by removing both ovaries of rats in the latter two groups. No ovariectomy was conducted in the sham-operated group. Rats in the sham-operated and model groups were intraperitoneally given 1 mg/kg normal saline, while those in the exogenous hydrogen sulfide group intraperitoneally injected 100 μg/kg GYY4137, a slow-released agent of exogenous hydrogen sulfide. Treatments in each group were conducted twice a day, for 12 weeks. Plasma hydrogen sulfide concentration, blood calcium and phosphorus concentrations, alkaline phosphatase activity, osteocalcin, calcitonin, parathyroid hormone, and leptin laboratory index data of each group were analyzed by quantitative comparison.
RESULTS AND CONCLUSION: Bone mineral density of the L5, plasma hydrogen sulfide, calcium, phosphorus, alkaline phosphatase, calcitonin concentrations were significantly lower, and osteocalcin, parathyroid hormone, and leptin levels were significantly higher in the model group compared with the sham-operated group at weeks 8 and 12 (P < 0.05). There were no significant differences between the sham-operated and exogenous hydrogen sulfide groups at weeks 8 and 12 in terms of L5 bone mineral density, plasma hydrogen sulfide, phosphorus, osteocalcin, calcitonin, parathyroid hormone and leptin levels (P > 0.05). Whereas blood calcium concentration and alkaline phosphatase activity were still decreased in the exogenous hydrogen sulfide group compared with the sham-operated group (P < 0.05). Compared with the model group, plasma hydrogen sulfide, blood calcium and phosphorus concentrations were elevated and leptin level was decreased in the exogenous hydrogen sulfide group (P < 0.05), while the differences in L5 bone mineral density, alkaline phosphatase activity, osteocalcin, calcitonin and parathyroid hormone levels at weeks 8 and 12 were not significant between the two groups (P > 0.05). Therefore, in the ovariectomized osteoporotic rat model, endogenous hydrogen sulfide concentration was negatively correlated with the severity of osteoporosis, and exogenous supplementation to increase plasma hydrogen sulfide concentration could improve or reverse plasma calcium, phosphorus and some hormone indexes related to bone metabolism. To conclude, plasma hydrogen sulfide concentration and osteoporosis are correlated, and exogenous hydrogen sulfide supplementation has a potential therapeutic effect on osteoporosis which is caused by estrogen reduction.

Key words: estrogen, osteoporosis, hydrogen sulfide, bone metabolism, calcium, phosphorus, hormone

中图分类号:

赖鸿辉, 刘跃, 李体远, 潘晓华, 徐忠世. 外源性硫化氢对双侧卵巢摘除骨质疏松模型大鼠骨代谢的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(29): 4632-4637.

Lai Honghui, Liu Yue, Li Tiyuan, Pan Xiaohua, Xu Zhongshi. Effect of exogenous hydrogen sulfide on bone metabolism in an ovariectomized osteoporotic rat model[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(29): 4632-4637.

图/表（结果） 6

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引言

骨质疏松是以骨量减少、骨微观结构退化为特征的，致使骨脆性增加以及易于发生骨折的一种全身性骨胳疾病，是骨科及老年科等相关科室的常见病、多发病[1-2]。去卵巢大鼠骨质疏松模型作为一种成熟经典的动物实验模型，是美国食品与药品管理局和世界卫生组织推荐研究雌激素减少形成骨质疏松症的模型，在研究绝经后妇女发生骨质疏松的病理过程中已经得到公认[3-4]。在去卵巢大鼠构建的绝经后骨质疏松模型中，可以发现大鼠腿部肌肉匀浆中脂质过氧化水平和H2O2出现显著增高，同时伴随酶的抗氧化物减少，过多的活性氧产生的氧化应激易引起成骨细胞的损伤死亡或凋亡，并刺激破骨细胞功能及延长破骨细胞寿命，导致骨质疏松[5-6]，人类同样观察到类似的结论[7-8]。伴随着衰老，机体内的氧化应激水平亦会相应提高[9]，目前认为氧化应激在绝经后骨质疏松中扮演重要角色，而雌激素通过多种途径防止骨质疏松来维持骨代谢的平衡，其中一个重要的途径就是抗氧化作用[10-11]。而在生理浓度下，硫化氢(H2S)作为还原剂具有抗氧化、抗炎及抗凋亡的作用[12-13]，自1996年ABE等[14]首先提出了H2S的内源性神经递质作用以来，越来越多的证据表明内源性H2S在体内多种系统的生理及病理生理方面起着重要作用，通过细胞内外信号传递途径调节许多重要的细胞功能，被认为是继一氧化氮和一氧化碳后发现的第3种内源性气体信号分子[15]。研究表明外源性H2S可以通过ERK1/2依赖的抗氧化机制刺激成骨细胞的形成和分化，在体外细胞实验中成功抑制双氧水诱导的成骨细胞株系MC3T-E1氧化损伤[16]。此次研究以去卵巢大鼠为实验对象，定量观察大鼠血浆内源性H2S水平与骨质疏松的相关性，初步探讨血浆中H2S浓度对钙、磷平衡及骨代谢激素指标的调节和干预作用。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计完全随机设计，动物实验，两样本t检验。
1.2 时间及地点于2016年1月至2017年6月在暨南大学第二临床医学院骨科完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 60只6月龄SPF级雌性SD大鼠，体质量(265±15) g，购于广东省实验动物中心，许可证号：SCXK(粤)2018-0002。60只大鼠按随机数字表法分为假手术组、模型组、外源性H2S组，每组20只；其中模型组、外源性H2S组进行骨质疏松造模，麻醉后行完整双侧卵巢摘除；假手术组大鼠进行假手术处理。大鼠由专人饲养，在温度(23±2)℃，相对湿度(55±10)%以及昼夜交替各12 h的受控条件下，自由进食和饮水。以上所有实验步骤均严格按照中国科技部的《实验动物的管理和使用指南》进行。
1.3.2 试剂和化学物质外源性H2S缓释剂GYY4137购买于Santa Cruz Biotechnology(SC-224013)；水合氯醛(Sangon Biotech，Shanghai，China)、青霉素、乙醚、碘伏、生理盐水等均购于正规国内生产厂商。
1.4 方法

1.4.1 骨质疏松大鼠模型制备及给药方法模型组、外源性H2S组进行骨质疏松造模，10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉后，完整双侧卵巢摘除，碘伏消毒切口关腹。假手术组大鼠进行假手术处理，开腹后分离卵巢组织，关腹，不做卵巢切除术，手术过程中动物无大出血。术后待大鼠自然清醒，青霉素(4×104 U/只)治疗3 d避免感染。术后假手术组、模型组大鼠腹腔注射1 mg/kg生理盐水，外源性H2S组大鼠腹腔注射100 μg/kg 外源性H2S缓释剂GYY4137，用药频率均为2 d 1次。实验期为12 周，实验过程中没有大鼠意外死亡。

1.4.2 取材于给药2，4，8，12周每组随机取出5只大鼠，并采用过量乙醚麻醉的方法处死，开腹并腹主动脉采血，分离血浆；并于第8，12周时完整取出各组大鼠L5椎体，同样剔除软组织和附件，并以浸透生理盐水的纱布包裹，分组标记后保存于-80 ℃冰箱中备用。
1.5 主要观察指标
1.5.1 骨密度检测给药第8，12周，使用美国生产的Hologic双能X射线4 500 W骨密度仪对大鼠L5椎体进行骨密度测定。当卵巢摘除大鼠L5骨密度较假手术组有显著降低时认为造模成功[17-18]。
1.5.2 血磷、血钙检测于给药2，4，8，12周进行检测。
(1)血磷检测：大鼠腹主动脉采血，加入EDTANa2 (Amresco)1 g/L作为抗凝剂，分离血浆，血磷检测是采用磷测定试剂盒(Solarbio，China)进行磷钼酸紫外线比色法，分光光度计(Thermo Fisher，USA)测定吸光度(A)值，计算浓度。
(2)血钙检测：大鼠腹主动脉采血，加入EDTANa2 1 g/L作为抗凝剂，分离血浆，比色法检测血钙，仪器采用罗氏全自动生化分析仪(Cobas 8000 c702)。
1.5.3 血浆激素检测选取临床诊断和随访观察骨质疏松病情最常使用的相关激素指标，包括碱性磷酸酶、骨钙素、降钙素、甲状旁腺素、瘦素这5种[19-23]。
(1)碱性磷酸酶：大鼠腹主动脉采血，加入EDTANa2 1 g/L作为抗凝剂，分离血浆，速率法测碱性磷酸酶活性，试剂盒为罗氏碱性磷酸酶试剂盒，仪器是罗氏全自动生化分析仪Cobas 8000 c702。
(2)骨钙素：化学发光法检测血浆中骨钙素水平，试剂盒为罗氏骨钙素试剂盒，仪器是罗氏全自动生化分析仪Cobas 8000 c702。
(3)降钙素：电化学发光法测血浆中降钙素水平，试剂盒为罗氏降钙素检测试剂盒，实验仪器为罗氏COBAS E602。
(4)甲状旁腺素：电化学发光法测血浆中甲状旁腺素水平，试剂盒为罗氏甲状旁腺素检测试剂盒，实验仪器为罗氏全自动生化分析仪Cobas 8000 c702。
(5)瘦素：ELISA法检测瘦素，采用武汉华美Rat Leptin，LEP ELISA kit检测。
1.5.4 血浆H2S浓度检测于给药2，4，8，12周进行检测。改良亚甲基蓝法测定血浆H2S，先加过量醋酸锌溶液使血浆中游离H2S、HS-、S2-形成ZnS沉淀；再加入5 mol/L NaOH强碱溶解变性的蛋白；离心去除大量蛋白质；加入0.2%N，N-二甲基对苯二胺盐酸盐溶液使ZnS完全溶解，用三氯乙酸沉淀剩余蛋白质，最后用分光光度计法测定H2S浓度。
1.6 统计学分析各组数据以x±s 表示，使用SPSS 22.0软件进行处理，根据方差齐性检验结果，两组间比较采用两样本t检验；P < 0.05认为差异有显著性意义，P < 0.01认为差异有非常显著性意义。

讨论

成骨细胞的骨形成与破骨细胞的骨吸收两者之间保持动态平衡是骨代谢活动维持正常状态的基础，成骨细胞是骨形成发育过程中最重要的功能细胞，同时破骨细胞的活动亦受到成骨细胞的调控[24]，基于此，血钙、磷与骨骼中的钙、磷同样保持着动态平衡。雌激素主要通过成骨细胞上的雌激素受体途径促进骨的形成[25-26]，通过破骨细胞的雌激素受体诱导其凋亡从而抑制骨吸收[27-28]。雌激素除了直接作用于骨代谢外，还间接通过调节骨代谢相关激素发挥着作用，在增加降钙素分泌、抑制甲状旁腺素分泌、增加维生素D在肾内的活化、促进小肠对钙的吸收等功能中发挥着成骨作用。
此次实验结果显示，卵巢摘除大鼠血浆钙、磷、碱性磷酸酶、骨钙素、降钙素水平随骨质疏松发生显著降低，甲状旁腺素、瘦素水平则显著升高，GYY4137的干预可升高血浆钙、磷水平，但未达到假手术组水平，且GYY4137干预均未对卵巢摘除大鼠血浆中的碱性磷酸酶、骨钙素、甲状旁腺素产生显著的调节作用；其中降钙素是选取的5种骨代谢相关激素中唯一一种在实验周期内与时间因素无明显关系的钙调激素，这可能与降钙素不受年龄因素影响、骨质疏松患者的降钙素基值和代谢率无明显改变有关[29-30]。而甲状旁腺素由甲状旁腺脉冲式分泌，作用于成骨细胞上的甲状旁腺素受体，具有增强成骨的作用，但甲状旁腺素分泌异常，比如像甲状旁腺功能亢进持续大量分泌则可增强破骨细胞的活性，导致骨吸收和骨质疏松；血浆碱性磷酸酶大约50%来源于成骨细胞；骨钙素是由成骨细胞直接分泌和表达的一种活性多肽物质，它们都反映成骨细胞的活性和状态，代表了骨形成和骨重建[31]。而H2S通过影响核心结合蛋白(Cbfα1/Runx2)和Osterix相互作用，促进骨细胞的增殖和分化，以及进一步启动成骨细胞特异性因子(如碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原和骨钙蛋白)的表达，从而促进骨的形成[32]。另一方面H2S同样也在实验中被观察到通过MAPKs途径中EPK1/2和p38依赖的机制对抗氧化应激损伤，促进成骨细胞的分化和增殖，减轻炎症反应[33]。GAMBARI等[34]还观察到，H2S通过抗氧化应激转录因子依赖的机制直接抑制破骨细胞分化。但此次实验结果显示，GYY4137的干预均未对卵巢摘除大鼠血浆中的碱性磷酸酶和骨钙素产生显著的调节作用，这需要更进一步研究。此外，此次实验观察到第12周时外源性干预血浆H2S可能对瘦素水平产生有益的调节作用，提示瘦素可能存在于卵巢摘除大鼠形成骨质疏松病理的某条通路上，但具体在何通路上需要进一步研究。
总之，此次研究中模型组去势大鼠产生的雌激素减少缺乏导致了其骨质疏松的发生，与此同时测得大鼠血浆内源性H2S浓度相应降低。而H2S是体内重要的还原剂之一，具有对抗氧化应激的作用[35]，而骨质疏松时机体处于氧化应激状态[36]，这在一定程度上说明H2S通过抗氧化应激来对抗去势大鼠的骨质疏松；也印证了HINE等[37]观察到的血浆内源性H2S产物与衰老及体内氧化应激水平呈负相关的结果，为临床上处于氧化应激状态的患者提供一种可能有效的还原剂，帮助其对抗机体氧化应激，如在心血管及神经系统疾病中更好地保护相应器官[35-36]。此次研究中外源性H2S组还证实了外源性GYY4137可以提高大鼠血浆中的H2S浓度，改善因卵巢摘除所致的钙磷失衡，对因卵巢摘除所致骨代谢相关激素-瘦素异常水平产生了显著的调节影响，提示临床上可能通过使用相应的H2S释放制剂来提高血浆H2S水平对抗骨质疏松所致的钙磷失衡。但此次实验结果存在相对局限性，对大鼠其他病因导致的骨质疏松或特发型骨质疏松、以及进而对于H2S与人类骨质疏松的关联及干预结果可能与此次实验结论存在差异，尚需今后进一步研究证实。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

外源性硫化氢对双侧卵巢摘除骨质疏松模型大鼠骨代谢的影响

Effect of exogenous hydrogen sulfide on bone metabolism in an ovariectomized osteoporotic rat model

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