低强度脉冲超声介导骨髓间充质干细胞促进膝骨关节炎软骨修复

doi:10.12307/2021.135

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (31): 4950-4955.doi: 10.12307/2021.135

• 骨髓干细胞 bone marrow stem cells • 上一篇下一篇

低强度脉冲超声介导骨髓间充质干细胞促进膝骨关节炎软骨修复

廖晴，李保建，李洋，徐泰祥，曾静，张珍珍，刘刚

南方医科大学第三附属医院康复医学科，广东省广州市 510630

收稿日期:2020-08-19 修回日期:2020-08-21 接受日期:2020-09-26 出版日期:2021-11-08 发布日期:2021-04-25
通讯作者: 刘刚，博士，主任医师，南方医科大学第三附属医院康复医学科，广东省广州市 510630
作者简介:廖晴，女，1992年生，湖南省常宁市人，汉族，南方医科大学在读硕士，主要从事干细胞相关研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81774382)，项目负责人：刘刚

Low-intensity pulsed ultrasound mediates bone marrow mesenchymal stem cells to promote osteoarthritis cartilage repair

Liao Qing, Li Baojian, Li Yang, Xu Taixiang, Zeng Jing, Zhang Zhenzhen, Liu Gang

Department of Rehabilitation Medicine, Third Hospital of Southern Medical University, Guangzhou 510630, Guangdong Province, China

Received:2020-08-19 Revised:2020-08-21 Accepted:2020-09-26 Online:2021-11-08 Published:2021-04-25
Contact: Liu Gang, MD, Chief physician, Department of Rehabilitation Medicine, Third Hospital of Southern Medical University, Guangzhou 510630, Guangdong Province, China
About author:Liao Qing, Master candidate, Department of Rehabilitation Medicine, Third Hospital of Southern Medical University, Guangzhou 510630, Guangdong Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81774382 (to LG)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
低强度脉冲超声：是一种频率超过人耳听阈(20 kHz)以上，强度为1-100 mW/cm2的声波，不仅可以提高骨髓间充质干细胞的分化、增殖及趋化归巢能力，还能调节损伤部位的微环境以吸引骨髓间充质干细胞的归巢，改善骨髓间充质干细胞的移植效果；同时也能显著促进对力学敏感的骨与软骨组织再生，已被FDA批准作为加速骨折愈合的治疗手段。膝骨关节炎的重要特征是软骨破坏，因此治疗的关键是关节软骨的修复，低强度脉冲超声具有软骨保护作用，可促进软骨修复。

Sox9：主要表达于软骨细胞中，可促进软骨细胞存活并调节软骨细胞表型，转录激活许多软骨特异性基因。Sox9是成人软骨发育和维持的关键转录因子，参与软骨细胞分化的每个阶段，是软骨形成所必需的。
背景：研究表明骨髓间充质干细胞及低强度脉冲超声均能促进膝骨关节炎软骨修复，但目前尚未有报道低强度脉冲超声介导骨髓间充质干细胞对膝骨关节炎软骨是否能有更好的修复效果。
目的：观察低强度脉冲超声介导骨髓充质干细胞对膝骨关节炎软骨的修复效果。
方法：将36只6周龄SD雄性大鼠随机分为 4组，分别为对照组、骨关节炎组、干细胞组、干细胞+超声组，每组9只，后3组采用右侧膝关节前交叉韧带横断+内侧半月板部分切除的方法制备骨关节炎模型。造模后6周，对照组及骨关节炎组大鼠不予以特殊处理；干细胞组、干细胞+超声组大鼠膝关节腔内均注射骨髓间充质干细胞悬液0.1 mL(细胞浓度为1×109 L-1)，1次/周，治疗4周，同时干细胞+超声组给予低强度脉冲超声治疗，20 min/d，治疗4周。采用Western blot检测大鼠关节软骨Ⅱ型胶原、Sox9蛋白的表达，同时用Mankin评分评估各组大鼠的软骨退变程度。
结果与结论：①治疗4周后，相对于其他3组，骨关节炎组Ⅱ型胶原、Sox9蛋白表达减少(P < 0.05)；干细胞组Ⅱ型胶原、Sox9蛋白表达低于干细胞+超声组(P < 0.05)；②对照组、干细胞组与干细胞+超声组的Mankin评分均明显低于骨关节炎组(P < 0.01)；与干细胞组相比，干细胞+超声组Mankin评分降低(P < 0.05)；③结果表明，相对于单纯应用骨髓间充质干细胞，低强度脉冲超声介导骨髓间充质干细胞促进膝骨关节炎软骨修复的效果更优。
https://orcid.org/0000-0002-7227-2676(廖晴)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 骨髓间充质干细胞, 低强度脉冲超声, 骨关节炎, 膝, 软骨, 修复

Abstract: BACKGROUND: Studies have shown that bone marrow mesenchymal stem cells and low-intensity pulsed ultrasound can promote the repair of knee osteoarthritis cartilage, but there is no report whether low-intensity pulsed ultrasound-mediated bone marrow mesenchymal stem cells can have a better effect on knee osteoarthritis cartilage repair.

OBJECTIVE: To observe the repair effect of bone marrow mesenchymal stem cells mediated by low-intensity pulsed ultrasound on knee osteoarthritis cartilage.

METHODS: Totally 36 Sprague-Dawley male rats aged 6 weeks were randomly divided into four groups: control group, osteoarthritis group, stem cell group and stem cell plus ultrasound group (n=9 per group). In the osteoarthritis group, stem cell group and stem cell plus ultrasound group, osteoarthritis models were made by the anterior cruciate ligament transection of the right knee joint with partial resection of the medial meniscus. At 6 weeks after model establishment, no special treatment was given to the control group and the osteoarthritis group. In the stem cell group and the stem cell plus ultrasound group, the knee joint cavity was injected with bone marrow mesenchymal stem cells 0.1 mL (cell concentration was 1×109 L-1), once a week, for 4 weeks. Simultaneously, rats in the stem cells plus ultrasound group were treated with low-intensity pulsed ultrasound at 20 minutes/day for 4 weeks. Western blot assay was used to detect the expression of type II collagen and Sox9 protein in rat articular cartilage, and Mankin score was used to evaluate the degree of cartilage degeneration in each group of experimental rats.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) After 4 weeks of treatment, the expression of type II collagen and Sox9 protein in the osteoarthritis group was reduced compared to the other three groups (P < 0.05). The protein expression of type II collagen and Sox9 in the stem cell group was lower than that of stem cells plus ultrasound group (P < 0.05). (2) The Mankin scores of control group, stem cell group and stem cell plus ultrasound group were significantly lower than those of the osteoarthritis group (P < 0.01). Compared with the stem cell group, the Mankin score of the stem cell plus ultrasound group was lower (P < 0.05). (3) The results show that compared with simple bone marrow mesenchymal stem cells, low-intensity pulsed ultrasound-mediated bone marrow mesenchymal stem cells have a better effect on cartilage repair in knee osteoarthritis.

Key words: stem cells, bone marrow mesenchymal stem cells, low-intensity pulsed ultrasound, osteoarthritis, knee, cartilage, repair

中图分类号:

廖晴, 李保建, 李洋, 徐泰祥, 曾静, 张珍珍, 刘刚. 低强度脉冲超声介导骨髓间充质干细胞促进膝骨关节炎软骨修复[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(31): 4950-4955.

Liao Qing, Li Baojian, Li Yang, Xu Taixiang, Zeng Jing, Zhang Zhenzhen, Liu Gang. Low-intensity pulsed ultrasound mediates bone marrow mesenchymal stem cells to promote osteoarthritis cartilage repair[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(31): 4950-4955.

图/表（结果） 6

2.1 骨髓间充质干细胞的形态接种至培养皿24 h之后开始贴壁，呈圆形，随着培养时间延长，细胞逐渐伸展为多角形或梭形，排列尚不规则；第1代贴壁细胞明显增多，主要呈梭形，见图1A；第3代骨髓间充质干细胞呈辐射状或者漩涡状排列，细胞形态较均一，见图1B。

2.2 骨髓间充质干细胞的鉴定结果流式细胞仪检测结果显示，CD29、CD90的阳性率为98.92%，97.73%，CD34、CD45的阳性率为4.86%，6.51%，以上结果提示分离培养的细胞是骨髓间充质干细胞，见图2。

2.3 生物相容性 CCK-8细胞毒性实验结果显示，实验组与对照组的吸光度值相比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见图3，说明骨髓间充质干细胞没有毒性，具有良好的生物相容性。

2.4 软骨形成相关蛋白的表达治疗4周后，骨关节炎组Ⅱ型胶原、Sox9蛋白表达相对于其他3组明显降低，差异均有显著性意义(P < 0.05)；干细胞+超声组Ⅱ型胶原、Sox9蛋白表达高于干细胞组，差异有显著性意义(P < 0.05)；对照组与干细胞组的Ⅱ型胶原、Sox9蛋白表达水平差异无显著性意义 (P > 0.05)，见图4。

2.5 组织病理变化治疗4周后，苏木精-伊红染色显示，对照组右膝关节软骨组织表面光滑完整，未见裂隙，软骨细胞排列正常，见图5A；骨关节炎组右膝关节软骨组织表面粗糙、破坏显著，可见较多裂隙，其中部分裂隙深至钙化层，软骨细胞数量减少且排列混乱，见图5B；干细胞组软骨组织表面较平整，可见裂隙较骨关节炎组减少，软骨细胞数量较骨关节炎组增多且分布较均匀，见图5C；干细胞+超声组关节软骨组织表面光滑平整，无关节裂隙，软骨细胞数量较骨关节炎组明显增多，细胞排列较正常，形态均一，见图5D。

治疗4周后，各组Mankin评分见图6。

参考文献

[1] BIJLSMA JW, BERENBAUM F, LAFEBER FP. Osteoarthritis: an update with relevance for clinical practice. Lancet. 2011;377(9783):2115-2126.
[2] LITWIC A, EDWARDS MH, DENNISON EM, et al. Epidemiology and burden of osteoarthritis. Br Med Bull. 2013;105:185-199.
[3] LIU Q, WANG S, LIN J, et al. The burden for knee osteoarthritis among Chinese elderly: estimates from a nationally representative study. Osteoarthritis Cartilage. 2018;26(12):1636-1642.
4] 王斌,邢丹,林剑浩,等.关节腔内注射治疗膝骨关节炎的研究进展[J].中华关节外科杂志(电子版),2018,12(6):814-820.
[5] 王弘德,李升,陈伟,等.《骨关节炎诊疗指南(2018年版)》膝关节骨关节炎部分的更新与解读[J].河北医科大学学报,2019,40(9): 993-995,1000.
[6] MAKRIS EA, GOMOLL AH, MALIZOS KN, et al. Repair and tissue engineering techniques for articular cartilage. Nat Rev Rheumatol. 2015;11(1):21-34.
[7] 卓群豪,张伟娜,李舰,等. 膝关节腔内注射Sox9转染骨髓间充质干细胞修复膝关节骨关节炎[J].中国组织工程研究,2017,21(5): 736-741.
[8] AL FAQEH H, NOR HAMDAN BM, CHEN HC, et al. The potential of intra-articular injection of chondrogenic-induced bone marrow stem cells to retard the progression of osteoarthritis in a sheep model. Exp Gerontol. 2012;47(6):458-464.
[9] HALEEM AM, SINGERGY AA, SABRY D, et al. The Clinical Use of Human Culture-Expanded Autologous Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Transplanted on Platelet-Rich Fibrin Glue in the Treatment of Articular Cartilage Defects: A Pilot Study and Preliminary Results. Cartilage. 2010;1(4):253-261.
[10] WAKITANI S, OKABE T, HORIBE S, et al. Safety of autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cell transplantation for cartilage repair in 41 patients with 45 joints followed for up to 11 years and 5 months. J Tissue Eng Regen Med. 2011;5(2):146-150.
[11] UCCELLI A, MORETTA L, PISTOIA V. Mesenchymal stem cells in health and disease. Nat Rev Immunol. 2008;8(9):726-736.
[12] PITTENGER MF, MACKAY AM, BECK SC, et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 1999;284(5411): 143-147.
[13] 李凡,杜联芳.低强度脉冲超声介导骨髓间充质干细胞移植的研究进展[J].中华超声影像学杂志,2017,26(8):729-732.
[14] 于海生,陈文直,王嫣,等.低强度脉冲超声对体外培养的骨髓间充质干细胞增殖效应的研究[J].中国医科大学学报,2011,40(11):
971-974.
[15] 罗显文,李明星.低强度脉冲超声可缓解膝骨关节炎疼痛与修复关节软骨损伤[J].中国组织工程研究,2019,23(3):348-353.
[16] HAYAMI T, PICKARSKI M, ZHUO Y, et al. Characterization of articular cartilage and subchondral bone changes in the rat anterior cruciate ligament transection and meniscectomized models of osteoarthritis. Bone. 2006;38(2):234-243.
[17] MANKIN HJ, JOHNSON ME, LIPPIELLO L. Biochemical and metabolic abnormalities in articular cartilage from osteoarthritic human hips. III. Distribution and metabolism of amino sugar-containing macromolecules. J Bone Joint Surg Am. 1981;63(1):131-139.
[18] LOESER RF, GOLDRING SR, SCANZELLO CR, et al. Osteoarthritis: a disease of the joint as an organ. Arthritis Rheum. 2012;64(6): 1697-1707.
[19] GUPTA PK, DAS AK, CHULLIKANA A, et al. Mesenchymal stem cells for cartilage repair in osteoarthritis. Stem Cell Res Ther. 2012;3(4):25.
[20] KUSUYAMA J, HWAN SEONG C, OHNISHI T, et al. Low-Intensity Pulsed Ultrasound (LIPUS) Stimulation Helps to Maintain the Differentiation Potency of Mesenchymal Stem Cells by Induction in Nanog Protein Transcript Levels and Phosphorylation. J Orthop Trauma. 2016;30(8):
S4-5.
[21] NISHIMORI M, DEIE M, KANAYA A, et al. Repair of chronic osteochondral defects in the rat. A bone marrow-stimulating procedure enhanced by cultured allogenic bone marrow mesenchymal stromal cells. J Bone Joint Surg Br. 2006;88(9):1236-1244.
[22] WAKITANI S, GOTO T, PINEDA SJ, et al. Mesenchymal cell-based repair of large, full-thickness defects of articular cartilage. J Bone Joint Surg Am. 1994;76(4):579-592.
[23] MURPHY JM, FINK DJ, HUNZIKER EB, et al. Stem cell therapy in a caprine model of osteoarthritis. Arthritis Rheum. 2003;48(12): 3464-3474.
[24] VEGA A, MARTÍN-FERRERO MA, DEL CANTO F, et al. Treatment of Knee Osteoarthritis With Allogeneic Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells: A Randomized Controlled Trial. Transplantation. 2015;99(8):1681-1690.
[25] CHOI JW, CHOI BH, PARK SH, et al. Mechanical stimulation by ultrasound enhances chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells in a fibrin-hyaluronic acid hydrogel. Artif Organs. 2013;37(7):648-655.
[26] GAO Q, WALMSLEY AD, COOPER PR, et al. Ultrasound Stimulation of Different Dental Stem Cell Populations: Role of Mitogen-activated Protein Kinase Signaling. J Endod. 2016;42(3):425-431.
[27] WANG Y, PENG W, LIU X, et al. Study of bilineage differentiation of human-bone-marrow-derived mesenchymal stem cells in oxidized sodium alginate/N-succinyl chitosan hydrogels and synergistic effects of RGD modification and low-intensity pulsed ultrasound. Acta Biomater. 2014;10(6):2518-2528.
[28] WEI FY, LEUNG KS, LI G, et al. Low intensity pulsed ultrasound enhanced mesenchymal stem cell recruitment through stromal derived factor-1 signaling in fracture healing. PLoS One. 2014;9(9):e106722.
[29] XIA P, WANG X, QU Y, et al. TGF-β1-induced chondrogenesis of bone marrow mesenchymal stem cells is promoted by low-intensity pulsed ultrasound through the integrin-mTOR signaling pathway. Stem Cell Res Ther. 2017;8(1):281.
[30] YANG C, YOU D, HUANG J, et al. Effects of AURKA-mediated degradation of SOD2 on mitochondrial dysfunction and cartilage homeostasis in osteoarthritis. J Cell Physiol. 2019;234(10):17727-17738.

引言

骨关节炎是一种常见的致残性关节疾病，其主要特征是关节软骨的逐渐破坏，临床上主要表现为关节肿胀、疼痛、畸形、僵硬及关节功能障碍等。随着人口的老龄化，骨关节炎发生率也逐年升高，不仅严重影响着患者的身心健康及生活质量，更加重了家庭及社会的经济负担，正逐渐引起人们的重视[1-3]。目前临床上已有的功能锻炼、物理治疗、药物治疗等方法只能暂时缓解症状或延缓骨关节炎病理进程[4-5]，而关节镜灌洗、清创术、微骨折诱导和自体软骨细胞植入等治疗方法可保护关节正常功能并防止骨关节炎进一步退化[6]，
但无论是保守治疗或是手术治疗都不能修复已损伤的软骨，亟需发展新的医学技术来修复关节软骨。
近年来，间充质干细胞已广泛应用于软骨损伤的动物模型及一些临床试验中，并取得了一定的疗效[7-10]。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是最常见的间充质干细胞类型之一，不仅具备多向分化、自我更新以及免疫调节和抗炎的特点，还可参与损伤组织的修复 [11-12]，为骨关节炎治疗带来新的手段。
低强度脉冲超声(low-intensity pulsed ultrasound，LIPUS)是一种新兴的物理治疗方法，具有无创、操作简便、效果确切、并发症少等优点，既可以使骨髓间充质干细胞的分化和增殖能力增强，也有缓解关节疼痛、促进关节软骨损伤修复的作用[13-15]。因此，该实验旨在观察低强度脉冲超声介导骨髓间充质干细胞对膝骨关节炎软骨的修复效果，为骨关节炎治疗探索新的方法。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。
1.2 时间及地点实验于2019年3月至2020年1月在南方医科大学第三附属医院医学实验中心完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 4只4周龄健康SD大鼠，用于骨髓间充质干细胞的分离和培养；1-3 d的SD乳鼠，用于软骨细胞的分离和培养；36只6周龄SPF级健康雄性SD大鼠，体质量(250±20) g，给予普通饲料饲养，所有大鼠均来源于广东省动物实验中心。实验过程中严格遵循动物伦理委员会的标准对动物进行处置。
1.3.2 实验试剂和仪器 DMEM/F-12培养基、PBS、胎牛血清、青霉素/链霉素、胰蛋白酶(Gibco)；抗Ⅱ型胶原抗体(Abcam)；抗Sox9抗体(Santa Cruz Biotechnology)；无菌超净工作台、CO2恒温培养箱(Thermo Scientific)；倒置生物显微镜(ZEISS)；多功能酶标仪(Bio-Rad)；低强度脉冲超声(深圳市圣祥高科技有限公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 骨髓间充质干细胞的分离和培养取4只4周龄SD大鼠，采用2%戊巴比妥注射液(40 mL/kg)腹腔注射麻醉，浸泡在体积分数为75%乙醇中5 min；将双侧股骨及胫骨在无菌超净工作台中剥离，并使用无菌PBS反复冲洗；剪开股骨及胫骨的干骺端，用DMEM/F-12培养基冲洗骨髓腔，制备成细胞混悬液，1 000 r/min离心5 min，弃去上清液，用含1%青霉素/链霉素和体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F-12培养基重悬细胞，以1×108 L-1的细胞密度接种于培养皿内，置于体积分数为5%CO2、37 ℃恒温培养箱中孵育。当细胞铺满培养皿80%-90%时，用0.25%胰蛋白酶消化细胞，以1∶2比例传代，取第3代细胞用于后续实验。

1.4.2 骨髓间充质干细胞的鉴定取生长良好的第3代大鼠骨髓间充质干细胞，加入0.25%胰蛋白酶消化后，转移至无菌离心管离心；PBS清洗2次并离心，再用PBS重悬细胞；取100 μL细胞混悬液加入流式管，分别加入CD90-PE、CD29- FITC、CD34-PE、CD45-V450单克隆抗体及同型对照，在常温下避光孵育30 min，无菌PBS清洗2次，流式细胞仪上机检测。

1.4.3 软骨细胞的分离和培养取健康的1-3 d龄SD乳鼠双侧膝关节软骨，无菌剪成粥样，使用0.25%胰酶消化30 min后，用Ⅱ型胶原酶处理4 h，离心后去上清，用含1%青霉素/链霉素和体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F-12培养基重悬细胞，接种于培养皿内，置于体积分数为5%CO2、37℃的恒温培养箱中孵育，当细胞铺满培养皿80%-90%时，用0.25%胰蛋白酶消化细胞，以1∶2传代，取第1-3代细胞用于后续实验。
1.4.4 CCK-8细胞毒性实验实验分为2组，对照组：96孔培养板中单独培养2×103个正常软骨细胞；实验组：将2×103个骨髓间充质干细胞接种于96孔Trsnswell系统上室，2×103个正常软骨细胞接种于培养板中。每组设3个复孔，将孔板置于37 ℃、体积分数为5%CO2恒温培养箱中培养48 h，每孔中加入10 μL CCK-8溶液，于37 ℃孵箱孵育1 h后，使用酶标仪检测450 nm处的吸光度值。
1.4.5 实验动物分组及造模将36只6周龄SD大鼠按照随机数字表法分为4组，分别为对照组、骨关节炎组、干细胞组、干细胞+超声组，每组9只。用2%戊巴比妥注射液(40 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠，常规碘伏消毒右侧膝关节，采用右侧膝关节前交叉韧带横断以及内侧半月板部分切除的方法制备骨关节炎模型[16]。对照组不予以造模，不做特殊处理。
1.4.6 各组动物干预方法造模后6周，对照组不予以特殊处理；骨关节炎组右膝关节腔注射PBS 0.1 mL，1次/周，持续4周，并予以假超声(0 mW/cm2)治疗，20 min/d，治疗4周；干细胞组右膝关节腔内注射骨髓间充质干细胞悬液0.1 mL(细胞浓度为1×109 L-1)，1次/周，持续4周，并予以假超声(0 mW/cm2)治疗，20 min/d，治疗4周；干细胞+超声组右膝关节腔内注射骨髓间充质干细胞悬液0.1 mL(细胞浓度为1×109 L-1)，1次/周，持续4周，同时予以低强度脉冲超声治疗(频率1.5 MHz，占空比20%，声强30 mW/cm2)，20 min/d，治疗4周。
1.5 主要观察指标

1.5.1 蛋白质免疫印迹检测软骨相关蛋白的表达治疗4周后，取各组大鼠右侧膝关节软骨，使用液氮将软骨组织研磨成粉末，加入适量的组织蛋白裂解液，在冰上混匀液体后通过超声破碎样本，离心后取上清液，再通过BCA法检测样本蛋白质浓度、制备蛋白样品、上样、电泳、转膜、封闭、一抗孵育、洗膜、二抗孵育及显影，通过化学发光成像系统显影，使用ImageJ测量灰度值，检测Ⅱ型胶原、Sox9蛋白的表达。

1.5.2 苏木精-伊红染色观察右膝关节软骨的病理变化治疗4周后，取各组大鼠右侧膝关节，使用多聚甲醛固定48 h后脱钙8周，石蜡包埋、切片(厚度为5 μm)、烤片、脱蜡水化、常规苏木精-伊红染色、梯度乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封固，正置显微镜下观察右侧膝关节的软骨组织形态，并进行Mankin评分[17]，总分越低表明修复效果越好。
1.6 统计学分析每个实验都进行至少3次独立重复实验。所有实验数据应用GraphPad Prism 8.2.1软件进行录入和处理，所有数据进行正态性检验，符合正态分布时应用方差分析，方差齐性时采用单因素方差分析，组间比较采用Tukey’s法，方差不齐时采用Brown-Forsythe and Welch ANOVA 检验，组间比较使用Dunnett’s T3法，数据以x±s表示，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

骨关节炎的重要特征是关节软骨破坏，最终导致患者出现关节疼痛、功能障碍，甚至严重的残疾[18]，其治疗重点应在关节软骨的修复。骨髓间充质干细胞是再生医学中理想的种子细胞，研究发现骨髓间充质干细胞具有软骨形成分化潜能，还能促进软骨修复[19]，为骨关节炎治疗提供一种新思路。低强度脉冲超声是近年来新兴的物理治疗方法，既可以使骨髓间充质干细胞的分化和增殖能力增强，也有促进关节软骨修复的作用[13，15，20]，但尚未有低强度脉冲超声介导骨髓间充质干细胞促进膝骨关节炎软骨修复的研究及应用，因此该研究试图使用低强度脉冲超声介导骨髓间充质干细胞以促进膝骨关节炎软骨修复。
关节软骨的主要构成是软骨细胞及其分泌的细胞外基质，细胞外基质主要由Ⅱ型胶原蛋白构成。Sox9是发育和成年软骨中的关键转录因子，对软骨形成起重要作用。有研究发现在大鼠软骨缺损模型关节内注射间充质干细胞可以加速软骨再生[21]，兔软骨缺损模型关节内移植骨髓间充质干细胞可成功地诱导软骨组织再生[22]，在山羊骨关节炎模型的关节腔内注射骨髓间充质干细胞，不仅再生了软骨组织，还能阻止骨关节炎进展[23]。临床试验中同种异体输注骨髓间充质干细胞1年后，患者的关节疼痛及关节功能得到改善，MRI复查发现关节软骨质地显著改善[24]。上述临床前试验及临床试验结果均表明骨髓间充质干细胞对骨关节炎的软骨再生有一定效果，该实验结果显示干细胞组软骨内Ⅱ型胶原、Sox9的蛋白表达高于骨关节炎组，表明骨髓间充质干细胞能促进膝骨关节炎的软骨形成，同既往研究保持一致。相较于骨关节炎组，干细胞+超声组也能促进Ⅱ型胶原、Sox9蛋白表达。低强度脉冲超声不仅可以提高骨髓间充质干细胞的分化、增殖及趋化能力，还能调节损伤部位的微环境以吸引骨髓间充质干细胞的归巢，改善移植效果[13，25-28]。既往研究发现使用低强度脉冲超声干预能增加骨髓间充质干细胞中Ⅱ型胶原、Aggrecan和Sox9的表达以促进软骨形成[29]。低强度脉冲超声介导骨髓间充质干细胞是否能更好地促进膝骨关节炎软骨修复呢？该研究通过使用低强度脉冲超声介导骨髓间充质干细胞促进软骨修复，从蛋白水平检测了软骨形成蛋白Ⅱ型胶原和Sox9表达，发现干细胞+超声组Ⅱ型胶原、Sox9的表达较干细胞组升高，表明低强度脉冲超声介导骨髓间充质干细胞比单纯骨髓间充质干细胞能更好地促进软骨形成。
膝骨关节炎的一个重要病理特征是软骨退变、软骨基质降解[30]。Ⅱ型胶原蛋白是软骨细胞外基质的主要构成成分，能维持软骨的正常生理功能。Sox9主要表达于软骨细胞中，可激活Ⅱ型胶原蛋白、聚集蛋白聚糖蛋白的表达，调控软骨的分化，在软骨形成中扮演着不可或缺的角色[7]。该研究的病理研究观察结果显示，骨关节炎组右膝关节软骨组织表面粗糙不平整、破坏显著，可见较多裂隙，其中部分裂隙深至钙化层，软骨细胞数量减少且排列混乱；相较于骨关节炎组，干细胞组软骨组织表面较平整，裂隙减少，软骨细胞数量增多，可见部分软骨修复；干细胞+超声组关节软骨表面光滑平整，无关节裂隙，软骨细胞的数量较干细胞组明显增多，细胞排列正常，形态均一。由此可见软骨形成蛋白的表达和软骨的病理变化结果有一致性，表明低强度脉冲超声介导骨髓间充质干细胞的效果优于单独应用骨髓间充质干细胞，可能为骨关节炎治疗带来新的见解和思路。
综上所述，骨髓间充质干细胞与低强度脉冲超声对膝骨关节炎软骨修复均有一定的治疗作用，相对于既往研究，该研究创新性地将低强度脉冲超声和骨髓间充质干细胞结合，观察其对膝骨关节炎软骨修复的效果，研究结果发现低强度脉冲超声介导骨髓间充质干细胞对关节软骨的修复效果优于单独应用骨髓间充质干细胞，具体的作用机制可能是通过抑制炎症，减少软骨基质降解，同时增加软骨基质合成，上调软骨形成相关蛋白，从而进一步促进软骨修复。但由于实验周期较短，低强度脉冲超声介导骨髓间充质干细胞促进膝骨关节炎软骨修复的具体机制尚未做深入研究，需要在接下来的实验中进一步探索，为膝骨关节炎治疗提供理论依据。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

[1]	白晨, 杨文骞, 孟志超, 王宇泽. 损伤前交叉韧带修复及促进移植物愈合的策略[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(9): 1457-1463.
[2]	杨骏良, 路坦, 徐彪, 姜亚琼, 王富成. 前交叉韧带部分断裂对膝关节应力影响的三维有限元分析[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(9): 1347-1353.
[3]	李永杰, 付申宇, 夏渊, 张达宽, 刘洪举. 膝骨关节炎女性伸膝肌力、步态时空参数与峰值膝关节屈曲/内收力矩关系[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(9): 1354-1358.
[4]	李超杰, 居来提•买提肉孜, 艾尔西丁•阿不来提, 郑辉, 涂浒第. 不同屈曲角度时内侧髌股韧带重建的有限元分析[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(9): 1359-1364.
[5]	吴菁, 姚英策, 杨晓巍, 薛博士, 赵建斌, 杨辰, 栾天峰, 周志鹏. 肌力训练与神经肌肉电刺激干预髌股关节痛患者下肢功能和生物力学的变化[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(9): 1365-1371.
[6]	单嘉欣, 张一龙, 吴鸿涛, 张家媛, 李安安, 刘文刚, 许学猛, 赵传喜. 全膝关节置换后服用健脾益气活血方患者肌力及疼痛的变化[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(9): 1378-1382.
[7]	齐浩东, 鲁超, 徐韩博, 王孟飞, 郝阳泉. 糖尿病对初次全膝关节置换围术期失血量和疼痛的影响[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(9): 1383-1387.
[8]	李孝强, 陈唯, 李明樾, 单天驰, 申文. 全膝关节置换前股四头肌超声定量分析对置换后慢性疼痛的预测价值[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(9): 1388-1393.
[9]	杜长岭, 石辉, 张寿涛, 孟涛, 刘栋, 李健, 曹恒, 徐闯. 氨甲环酸不同使用方法在胫骨高位截骨过程中的安全及有效性[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(9): 1409-1413.
[10]	陈凯佳, 刘景云, 曹宁, 孙建波, 周燕, 梅建国, 任强. 组织工程技术在股骨头坏死治疗中的应用及前景[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(9): 1450-1456.
[11]	黄夏荣, 胡莉芝, 孙光华, 彭昕珂, 廖瑛, 廖源, 刘静, 尹林伟, 钟培瑞, 彭婷, 周君, 屈萌艰. 电针干预老年膝骨关节炎大鼠关节软骨及软骨下骨P53、P21的表达[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(8): 1174-1179.
[12]	赵嘎日达, 任逸众, 韩长旭, 孔令跃, 贾岩波. 蒙药额尔敦-乌日勒修复骨关节炎大鼠模型的机制[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(8): 1193-1199.
[13]	李蕊, 张桂红, 王涛, 樊萍. 人参多糖干预创伤性骨关节炎模型大鼠前列腺素E2/6-酮-前列腺素F1α的表达[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(8): 1235-1240.
[14]	王姗姗, 舒晴, 田峻. 物理因子促进干细胞的成骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(7): 1083-1090.
[15]	潘小龙, 樊飞燕, 应春苗, 刘飞祥, 张运克. 中药抑制间充质干细胞衰老的作用及机制[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(7): 1091-1098.

低强度脉冲超声介导骨髓间充质干细胞促进膝骨关节炎软骨修复

Low-intensity pulsed ultrasound mediates bone marrow mesenchymal stem cells to promote osteoarthritis cartilage repair

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 6

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价