1.4.7  成骨细胞分化基因分析  取第3代成骨细胞(2×10⁴个/孔)，分为正常细胞对照组、罗汉果苷V(1.25×10^-2 g/L)干预组、TUG1沉默组、罗汉果苷V(1.25×10^-2 g/L)干预+ TUG1沉默组、罗汉果苷V(1.25×10^-2 g/L)+阴性病毒组。病毒转染48 h后再培养6 d后，用细胞RNA快速提取试剂盒完成RNA提取，按赛默费科技科技有限公司提供的反转录试剂盒及荧光定量PCR试剂盒说明书合成cDNA及定量检测。引物序列见表1。以β-actin为内参，采用2^-??Ct法并计算成骨相关基因RUNX2、BSP、OCN和COL1A1相对表达量。

2.1  成骨细胞LncRNA测序结果  如图1所示，成骨细胞在1.25×10^-2 g/L罗汉果皂苷V干预48 h后，LncRNA TUG1表达显著升高(P < 0.05)。

2.2  分组干预后PCR检测TUG1表达  如图2所示，细胞按分组条件干预48 h后通过RT-PCR检测TUG1表达。结果显示：与正常细胞对照组相比，罗汉果苷V干预组、罗汉果苷V+阴性病毒组的TUG1表达升高，TUG1沉默组、罗汉果苷V+ TUG1沉默组的TUG1表达下降(P < 0.05)。

2.3  成骨细胞增殖活性分析结果  如图3所示， FDA荧光染色表明，随着时间的推移，所有分组染色均逐渐增强；与正常细胞对照组相比，罗汉果苷V干预组、罗汉果苷V+阴性病毒对照组的细胞数目显著增多，TUG1沉默组、罗汉果苷V+TUG1沉默组的细胞数目显著下降(P < 0.05)。

2.4  碱性磷酸酶活性分析结果  如图4所示，分组干预6 d后，与正常细胞对照组相比，罗汉果苷V干预组、罗汉果苷V+阴性病毒对照组的碱性磷酸酶染色更深，活性显著升高，而TUG1沉默组、罗汉果苷V+TUG1沉默组的碱性磷酸酶染色浅，活性下降(P < 0.05)。

2.5  成骨细胞钙化结节染色结果  如图4所示，分组干预 6 d后，与正常细胞对照组相比，罗汉果苷V干预组、罗汉果苷V+阴性病毒对照组的茜素红染色更深，矿化面积显著增加，而TUG1沉默组、罗汉果苷V+TUG1沉默组的茜素红染色浅，矿化面积减少(P < 0.05)。

2.6  成骨细胞分化基因分析  如图5所示，分组干预6 d后，与正常细胞对照组相比，罗汉果苷V干预组、罗汉果苷V+阴性病毒对照组的成骨分化相关基因RUNX2、BSP、OCN和COL1A1表达水平显著升高，而TUG1沉默组、罗汉果苷V + TUG1沉默组的RUNX2、BSP、OCN和COL1A1表达水平下降(P < 0.05)。

骨质疏松症是一种以骨质量下降、骨脆性增加、骨组织破坏为特点的骨病，多发于老年人，特别是绝经后的妇女，严重后果是导致脆性骨折，在低冲击创伤中即具有较高骨折风险^[1-2]。在英国每年约发生53万例脆性骨折，在美国每年有200万例骨折归因于骨质疏松症，导致超过43万例住院，近250万次就诊；而澳大利亚2017年用于治疗骨质疏松症及其并发症的总直接成本估计为34.4亿美元^[3-5]。因此，骨质疏松症相关的骨折不仅会对个人生存质量产生重大影响，也会给政府和社会带来巨大的经济负担，预防骨质疏松症已经成为临床面临的重要课题。

维持骨稳态、促进骨形成和防止骨质流失是预防骨质疏松症的关键^[6]。在骨形成中，最重要的是成骨细胞，骨形成的基本条件：大量的骨胶原、骨基质及一些重要的细胞因子、酶类均来源于成骨细胞^[7-8]。因此，成骨细胞活性降低，增殖、分化缺陷是骨质疏松症发病的根本原因之一。LncRNA是长度大于200 nt的非编码RNA(non-coding RNA，ncRNA)，无蛋白质编码功能，近年研究发现其具有调节细胞行为和功能的作用与许多疾病相关^[9]。LncRNA在RNA加工、基因转录调控、染色质修饰、细胞凋亡、端粒维护、蛋白质与蛋白质或DNA与蛋白质交互作用的调控等生物学过程中扮演重要角色，故LncRNA的错误表达可导致疾病的起始、生长和转移^[10]。

       罗汉果皂苷V是从植物中提取具有抗氧化、降血糖、抗癌等活性的天然化合物^[11-13]。前期研究中，课题组发现罗汉果皂苷V可刺激成骨细胞增殖、分化^[14]。为进一步研究其对成骨细胞的作用机制，课题组对汉果皂苷V干预后的成骨细胞进行基因测序，结果发现汉果皂苷V促进LncRNA 牛磺酸上调基因1(taurine upregulated gene 1，TUG1)表达。既往大量研究表明，TUG1在多种癌症例如肝细胞癌、膀胱癌、食管癌等中扮演重要角色，也与心脏重塑、心肌缺血修复密切相关^[15-19]。而在骨系统方面，同样有学者发现TUG1高表达促进人类主动脉瓣间质细胞向成骨细胞分化^[20]。实验前发现罗汉果皂苷V促进成骨细胞增殖与分化过程中伴有TUG1高表达，但TUG1在其中的作用尚不明确。因此，开展此次研究探讨LncRNA TUG1在罗汉果苷V促进成骨细胞增殖与分化中的作用。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1  设计  对比观察实验。

1.2  时间及地点  实验于2019年2至6月在广西医科大学再生医学实验室完成。

1.3  材料

1.3.1  实验动物  新生24 h SD大鼠乳鼠12只，雌雄不限，由广西医科大学动物实验中心提供，许可证号SCXK(桂) 2014-0002。

1.3.2  实验用主要仪器与试剂  细胞超净操作台(苏州苏洁净化设备有限公司)；ABI 7500型定量PCR仪(Applied Biosystems Inc.，美国)；CO₂培养箱、MultiSkan酶标仪、DMEM培养基、反转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒(Thermo Scientific，美国)；荧光倒置显微镜(Olympus，日本)；罗汉果皂苷V(成都曼思特生物科技有限公司)；0.25%胰蛋白酶、MTT、Ⅱ型胶原酶、二甲基亚砜、青链霉素混合液、PBS溶液、茜素红染色液、FDA荧光染色试剂、细胞RNA快速提取试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)；胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司)；碱性磷酸酶显色试剂盒(碧云天生物技术研究所)。

1.4  实验方法

1.4.1  成骨细胞提取与培养  将乳鼠处死后在无菌条件下解剖出颅盖骨，分离出其他组织后剪成1 mm×1 mm大小组织块；将组织块放入无菌离心管，在37 ℃下先后使用0.25%胰蛋白酶消化30 min、2 g/mLⅡ型胶原酶消化4 h，消化结束离心去除上清液，用DMEM全培养基(体积分数10%胎牛血清和1%抗生素混合物)重悬沉淀，调整细胞浓度为5×10⁶ L^-1。将细胞悬液接种于100 mm培养皿，每皿接种10 mL，置于细胞培养箱中培养(37 ℃、体积分数5% CO₂)24 h后更换培养基，之后每三四天换液1次；待细胞基本融合后，以1∶2比例传代之后继续培养，选取生长良好的第3代成骨细胞进行下列实验。

1.4.2  成骨细胞LncRNA测序  将第3代成骨细胞接种于6孔培养板(2×10⁴个/孔)，细胞分2组，培养24 h后更换含有质量浓度为0，1.25×10^-2 g/L的罗汉果苷V干预，干预培养48 h后提取total RNA后，去除total RNA中的核糖体RNA，将RNA打断成片段后连接上测序接头，进行PCR扩增构建测序文库，最后进行上机测序(HiSeq 4 000)，测序模式为PE150。对获取的数据进行 lncRNA表达谱研究。

1.4.3  细胞分组与转染  将第3代成骨细胞接种于6孔培养板(2×10⁴个/孔)，分为正常细胞对照组、罗汉果苷V(1.25× 10^-2 g/L)干预组、TUG1沉默组、罗汉果苷V(1.25×10^-2 g/L)干预+TUG1沉默组、罗汉果苷V(1.25×10-² g/L)+阴性病毒组。设计并合成 TUG1沉默病毒。按照Lipofectamine 3 000试剂盒说明书进行转染操作，转染48 h后通过PCR检测确认干扰效果并进行后续实验。

1.4.4  成骨细胞增殖活性分析  采用FDA荧光染色法检测成骨细胞增殖活性。取第3代成骨细胞(2×10⁴个/孔)，分为正常细胞对照组、罗汉果苷V(1.25×10^-2 g/L)干预组、TUG1沉默组、罗汉果苷V(1.25×10^-2 g/L)干预+ TUG1沉默组、罗汉果苷V(1.25×10^-2 g/L)+阴性病毒组。病毒转染48 h后再分别培养2，4，6 d时，取出细胞爬片，将爬片轻柔的清洗干净后置入FDA终浓度为100 mg/L的FDA液，避光染色5 min，随后在荧光倒置显微镜下观察并拍照。

1.4.5  碱性磷酸酶活性分析  采用BCIP/NBT比色法检测。取第3代成骨细胞(2×10⁴个/孔)，分为正常细胞对照组、罗汉果苷V(1.25×10^-2 g/L)干预组、TUG1沉默组、罗汉果苷V(1.25×10^-2 g/L)干预+TUG1沉默组、罗汉果苷V (1.25×10^-2 g/L)+阴性病毒组。病毒转染48 h后再培养6 d后，取出细胞爬片，将爬片轻柔的清洗干净后置入40 g/L多聚甲醛中固定30 min，固定结束再次清洗，清洗完毕后去除洗涤液，加入适量BCIP/NBT染色工作液充分覆盖样品，在室温避光孵育5-30 min，显色至预期深浅后去除BCIP/NBT染色工作液，用蒸馏水洗涤一两次，在光学显微镜下观察并拍照。

1.4.6  成骨细胞钙化结节染色  采用茜素红染色法检测成骨细胞矿化结节的形成情况。取第3代成骨细胞(2×10⁴个/孔)，分为正常细胞对照组、罗汉果苷V (1.25×10^-2 g/L)干预组、TUG1沉默组、罗汉果苷V (1.25×10^-2 g/L)干预+ TUG1沉默组、罗汉果苷V (1.25×10^-2 g/L)+阴性病毒组。病毒转染48 h后再培养6 d后，取出细胞爬片，将爬片轻柔清洗干净后置入40 g/L多聚甲醛中固定30 min，固定结束再次清洗，清洗完毕后去除洗涤液，将水完全吸干净，缓缓加入茜素红染色液，染色20-30 min，显色至预期深浅后去除茜素红染色液，用ddH₂O洗涤一两次，并保留少量ddH₂O附于爬片防止干燥，光学显微镜下观察并拍照。

1.4.7  成骨细胞分化基因分析  取第3代成骨细胞(2×10⁴个/孔)，分为正常细胞对照组、罗汉果苷V(1.25×10^-2 g/L)干预组、TUG1沉默组、罗汉果苷V(1.25×10^-2 g/L)干预+ TUG1沉默组、罗汉果苷V(1.25×10^-2 g/L)+阴性病毒组。病毒转染48 h后再培养6 d后，用细胞RNA快速提取试剂盒完成RNA提取，按赛默费科技科技有限公司提供的反转录试剂盒及荧光定量PCR试剂盒说明书合成cDNA及定量检测。引物序列见表1。以β-actin为内参，采用2^-∆∆Ct法并计算成骨相关基因RUNX2、BSP、OCN和COL1A1相对表达量。

1.5  主要观察指标  ①成骨细胞TUG1表达分析；②成骨细胞活性分析；③成骨细胞碱性磷酸酶活性；④成骨细胞茜素红染色结果；⑤成骨分化相关基因表达。

1.6  统计学分析  统计学分析采用Graphpad 6.0软件进。用x(_)±s表示计量数据，采用单因素方差分析进行组间比较，P < 0.05为差异有显著性意义。

骨质疏松的主要特征之一是骨量降低，因此维持骨量平衡，促进骨形成、防止骨质流失是预防骨质疏松症的关键^[21]。成骨细胞由间充质干细胞分化而来，不仅直接参与骨形成，也参与调控破骨细胞功能而影响骨吸收^[22]。改善成骨细胞功能可促进骨形成，防止骨量快速丢失，是预防和治疗骨质疏松症的重要手段。LncRNA是近年生物学研究热点，目前已有许多与疾病发生、发展相关的LncRNA被研究者发现，由于LncRNA存在时空特异性或组织特性的表达模式，因此有望成为疾病特异性治疗靶点^[23]。目前关于LncRNA在骨重建中的研究主要集中在干细胞及成骨细胞上。在骨形成中，LncRNA可通过染色质共价修饰或作为miRNA的靶基因参与调节信号通路水平调节成骨分化^[24-25]。

在此次研究中，课题组首先通过基因测序发现罗汉果苷V促进成骨细胞增殖、分化过程中伴有TUG1高表达。为明确TUG1在罗汉果苷V刺激成骨细胞过程中的具体作用，设计并合成LncRNA TUG1沉默病毒，并进行了成骨细胞增殖活性检查、碱性磷酸酶染色、钙结节染色及qRT-PCR检测RUNX2、BSP、OCN和COL1A1表达水平。碱性磷酸酶是与成骨分化正相关的分化标志物，矿化是细胞内钙盐的直接反映，钙盐形成越多则成骨分化越活跃^[26]。RUNX2是早期激活成骨细胞分化和去分化的特异性转录因子，而OCN是Runx2的下游转录因子，在骨细胞的成熟、形态和功能中起着重要作用^[27-29]。BSP、COL1A1均是骨形成过程中起关键调节作用的重要因子，既往大量研究均表明其高表达与成骨分化成正相关^[30-32]。此次研究的碱性磷酸酶染色、钙结节染色及qRT-PCR结果显示：罗汉果苷V增强成骨细胞碱性磷酸酶分泌及矿化，促进RUNX2、BSP、OCN和Ⅰ型胶原蛋白基因表达，而TUG1沉默可抑制罗汉果苷V对成骨细胞的作用。因此，此次实验研究结果表明罗汉果苷V通过促进LncRNA TUG1表达刺激成骨细胞的增殖与分化。

TUG1于2005年被发现，位于人22号常染色体长臂1区2号带2亚带(22q12.2)，全长7.1 kb^[33]。TUG1可通过招募并结合多梳抑制复合体调控某些生长控制基因的表达，也可以通过ceRNA模式与转录因子竞争性结合miRNA参与肿瘤的发生、发展^[34-35]。LIU等^[20]在研究钙化性主动脉瓣疾病(CAVD)中发现TUG1在人类主动脉瓣间质细胞(VIC)中高度表达，利用基因工具敲除VIC中TUG1后，CAVD中的成骨细胞分化受抑制，提示TUG1参与调控细胞成骨分化，且高表达有利于成骨。LIU等^[36]在研究成骨细胞增殖中发现 TUG1高表达可激活Wnt/β-catenin信号传导途径促进成骨细胞的增殖和分化。此次研究的实验结果与上述报道一致，表明Tug1高表达成骨细胞的增值、分化有积极作用。

综上所述，实验发现罗汉果苷V通过促进LncRNA TUG1表达刺激成骨细胞的增殖与分化，为进一步研究罗汉果苷V干预骨质疏松发生、发展的具体机制提供实验基础。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

文题释义：

长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)：是长度大于200个核苷酸的非编码RNA，在表观遗传调控、细胞周期调控和细胞分化调控等众多生命活动中发挥重要作用，是近年遗传学领域研究的热点对象。

罗汉果皂苷V：是一种三萜糖苷，可从罗汉果提取物中分离出来，具有抗氧化、降血糖、抗癌等活性的天然化合物。前期研究中，课题组发现罗汉果皂苷V可刺激成骨细胞增殖、分化。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

      成骨细胞由间充质干细胞分化形成，其不仅直接参与骨形成，同时也参与调控破骨细胞功能而影响骨吸收。成骨细胞增殖、分化过程受遗传因素、激素水平及细胞调控因子的影响与调控，其增殖、分化缺陷是骨质疏松症发病的重要原因，有大量研究表明改善成骨细胞功能可治疗骨质疏松症。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程#br#