2.1  实验动物数量分析  实验选用新西兰白兔18只，分为3组，实验过程中无脱失，全部进入结果分析。

2.2  一般情况  各组新西兰白兔麻醉清醒后，精神萎靡，少量觅食饮水。术后第1天，新西兰白兔精神状态好转，活动自如，可正常觅食饮水。术后兔下肢切口周围有不同程度肿胀，四五天肿胀基本消退，术后2周左右切口愈合良好，未出现切口开裂或感染征象，所有新西兰白兔均如期存活。

2.3  大体观察  术后第12周大体标本观察，直径5 mm组缺损由新生骨组织充填，缺损区与周围骨组织界限不清，股骨髁塑形良好，骨缺损区基本完全修复；直径6 mm组骨缺损区可见缺损空腔变浅，有部分新生骨组织，骨缺损不完全修复；直径7 mm组骨缺损区可见明显缺损空腔，新生骨组织较少，缺损部位由白色纤维包膜覆盖，骨缺损未修复(图2)。

2.4  CT三维重建结果  术后第1天CT三维重建可见各组圆柱形缺损造模准确，缺损区域未见骨屑残留；术后第4，8周各组均有不同程度的骨膜反应，直径5 mm组缺损区逐渐减小，断端桥接；直径6 mm组、直径7 mm组缺损区仅周边有少量新生骨长入，缺损面积较前稍减小；术后第12周可见直径5 mm组皮质骨结构完整、连续，股骨髁塑形良好，骨缺损基本完全修复；直径6 mm组骨缺损部分修复，空腔减小；直径7 mm组缺损未修复，仍可见明显缺损空腔存在(图3)。

术后CT-Hedberg评分显示：直径5 mm组与直径6 mm组、直径7 mm组不同时间点评分之间比较差异有显著性意义(P=0.000)；直径6 mm组与直径7 mm组不同时间点评分之间比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见表1。

2.5  组织学观察  建模后第12周取材行苏木精-伊红染色，结果显示直径5 mm组缺损区出现排列不规则的骨小梁结构，骨小梁连续性好，中间可见大量新生骨组织填充，直径6 mm组在骨缺损周边可见部分新生骨小梁存在，骨小梁连续性欠佳，中间可见部分新生骨组织填充；直径7 mm组缺损区可见极少量骨小梁，连续性欠佳，中间可见极少量新生骨组织填充(图4)。

在全膝关节翻修或者复杂初次膝关节置换中经常会遇到股骨远端骨缺损的情况，如果股骨远端骨缺损得不到处理将会导致膝关节翻修和置换手术的失败^[1]。传统治疗方法是根据骨缺损的大小选择包括骨水泥+螺钉技术、自体骨移植、同种异体骨移植、金属垫块、袖套等方法处理，近年来随着材料学、工程学、生命科学的快速发展，骨组织工程用于骨缺损修复的研究受到广泛关注^[2-4]。骨组织工程材料可以促进骨再生，在缺损处植入骨组织材料作为填充物来修复骨缺损成为一种理想治疗方法。为了评价骨缺损修复材料的临床效果，往往需要建立临床相关的测试动物模型来研究材料的生物相容性、降解、力学性能以及与宿主组织的相互作用。动物模型是体外实验和人体临床试验之间的关键一步，因此，选择一种合适的在体骨缺损动物模型来测试骨缺损修复材料的疗效是非常必要的。目前常用的造模动物有鼠、兔、狗、猴、羊、猪等，而兔骨缺损模型是最常用的，对兔股骨髁实验动物骨缺损模型的研究也日益增多^[5-6]。

股骨远端骨缺损是膝关节翻修面临的主要困难和挑  战^[7-9]，因此，在进行人体临床试验之前，使用股骨远端骨缺损动物模型测试替代材料的临床效果具有建设性的意义。兔股骨远端骨缺损模型被研究者们广泛用于骨缺损替代骨组织工程材料的测试^[10-12]，但对于兔股骨髁圆柱形骨缺损模型的大小文献报道不一^[13-15]，直径分布在5-9 mm，深度8-   12 mm，目前尚无统一的标准。因此，建立标准的兔股骨髁缺损动物模型是进行骨组织工程研究的必要条件。

实验通过构建不同尺寸的兔股骨髁骨缺损模型，并进行相应的大体、影像学及组织学观察来评估缺损愈合情况，以期在制备兔股骨髁骨缺损模型时，为骨缺损模型的选择提供数据支持，为进一步研究股骨远端骨缺的损修复和股骨远端骨缺损修复后的疗效评价提供参考标准。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1  设计  动物模型的制备。

1.2  时间及地点  实验于2018年8月至2019年6月在徐州医科大学完成。

1.3  材料

1.3.1  实验动物  选取6月龄普通级雄性新西兰白兔18只，体质量为3.0-3.5 kg，购自徐州医科大学实验动物中心[SCXK(苏)2014-0005]。连续监测动物饲养室内的温度及湿度，维持室温20-25 ℃，相对湿度40%-70%[SYXK(苏) 2015-0025]。实验过程中对动物的处置符合国家科技部2006年颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》。

1.3.2  实验用主要药品及仪器  氯胺酮(福建古田药业有限公司)，氟哌利多(上海旭东海普药业有限公司)，地西泮(济川药业集团有限公司)，青霉素(山东鲁抗医药股份有限公司)，骨科电钻(Smith＆Nephew，美国)，螺旋CT(SIEMENS Definition Flash，德国)，光学显微镜(OLYMPUS，日本)，电钻、持针器、剪刀、2 mm克氏针、手外科拉钩、骨膜剥离器、手术刀柄、止血钳、中空取骨钻、刀片、缝针缝线、注射器等手术器械由徐州医科大学动物实验中心提供。

1.4  实验方法

1.4.1  实验分组及模型制备  18只新西兰白兔根据圆柱形骨缺损的直径大小随机分为直径5，6，7 mm 3组，骨缺损直径依次为5，6，7 mm，深度均为10 mm，每组各6只，双侧手术计12侧。参考邓威等^[16]造模方法制备兔股骨髁缺损模型。采用氯胺酮(0.35 mL/kg)加氟哌利多(0.35 mL/kg)耳缘静脉注射麻醉，地西泮(0.35 mL/kg)耳缘静脉注射维持麻醉效果。麻醉生效后，双侧后肢术区备皮，将兔仰卧位固定于动物手术台上，常规消毒、铺巾，膝关节上方1c m处，股骨外侧可触及到稍隆起平台结构，确定股骨外侧髁位置，以股骨外侧髁为中心沿关节长轴方向做长约2.5 cm的纵行手术切口，切开皮肤，逐层分离皮下组织、肌肉至骨膜，拉开肌肉组织，充分显露兔股骨髁部，剥离骨膜，暴露股骨外侧髁。先使用直径2 mm的克氏针垂直骨面钻孔定位，以保证骨缺损中心距股骨远端0.5-1.0 cm，采用骨科电钻和不同直径的钻头，垂直于骨干长轴、平行于冠状面按照术前分组分别制备直径为5，6，7 mm，深度为10 mm的圆柱形骨缺损(图1)。生理盐水彻底冲洗缺损处碎骨屑及积血，4-0可吸收缝线逐层缝合切口，敷料包扎固定，单笼饲养，自由进食、饮水。术后每日肌肉注射青霉素80万U，连续注射3 d，预防感染。

1.4.2  大体观察  术后观察新西兰白兔精神状态、饮食活动等一般情况，以及切口有无开裂、感染等表现。术后第12周麻醉后处死所有动物，取出股骨髁缺损样本，大体观察各组骨缺损修复情况及缺损区纤维组织增生情况。

1.4.3  CT观察  术后第1天及术后第4，8，12周采用氯胺酮(0.35 mL/kg)加氟哌利多(0.35 mL/kg)耳缘静脉注射麻醉，地西泮(0.35 mL/kg)耳缘静脉注射维持麻醉效果，在麻醉下行CT扫描及三维重建。CT扫描参数：电压80 kV，电流180 mA，螺距0.8，旋转时间1.0 s。根据CT信号值变化，观察不同时间段骨缺损区新生骨生成量，并完成CT-Hedberg评分定量分析骨缺损修复情况。CT-Hedberg评分根据新生骨量占缺损区域的比值不同，将0%-25%计为1分；26%-50%计为2分；51%-75%计为3分；76%-100%计为4分。

1.4.4  组织学观察  术后第12周，麻醉后采用耳缘静脉推注20-50 mL的空气处死新西兰白兔，将取出的股骨髁样本用体积分数10%甲醛溶液固定48 h，然后EDTA脱钙至标本软化，梯度乙醇逐级脱水，石蜡包埋，骨组织切片，苏木精-伊红染色，观察骨缺损区愈合情况。

1.5  主要观察指标  ①术后兔大体观察，骨髁缺损样本大体观察；②骨缺损区CT观察，CT-Hedberg评分定量分析；③骨缺损区组织学观察。

1.6  统计学分析  采用SPSS 19.0统计软件进行统计学处理，计量资料以x(_)±s表示，对各组骨缺损CT-Hedberg评分进行单因素方差分析，检验水准α值取双侧0.05，以P < 0.05表示差异有显著性意义。

不同原因造成的不同部位的骨折和骨缺损是临床修复的一大难题，建立标准的实验动物骨缺损模型是进行后续各项相关实验的重要基础。1986年，SCHMITZ等^[17]研究表明自然状况下骨缺损有一个不能自行愈合的临界值，首次提出了临界性骨缺损(CSD)这一概念，并将其定义为缺损后不进行任何处理无法自愈的最短的骨缺损尺寸。随后考虑到观察实验动物完整的生命周期是非常困难的，GOSAIN等^[18]将临界性骨缺损值定义为在实验期间物种不能自行愈合的最短骨缺损尺寸。国内学者周芳等^[19]研究指出物种、机体状态、解剖位置、软组织环境等各种因素与临界性骨缺损的愈合相关。因兔和人类具有相似的骨密度和抗骨折的韧性，在所有用于骨骼肌肉研究的动物中，兔子是最常用的动物模型^[20]。目前关于兔股骨髁骨缺损动物模型的标准尚未统一，直径分布在5-9 mm，深度8-12 mm。因此，建立一个标准的兔股骨髁临界性骨缺损模型对进行各种骨组织工程研究来说是非常必要的。

由于兔的股骨外髁层次清楚而且周围没有重要的神经血管等解剖结构，有利于手术操作，兔的股骨髁部外侧是皮质骨，内侧是松质骨，混合有骨髓组织，内外径大约15 mm，前后径大约12 mm，有骨量充足，能够有效避免个体差异对实验结果的干扰^[21]。PAN等^[22]实验证实在兔股骨外髁部利用组织工程材料开展骨缺损修复的研究，可以获得理想的实验效果，所以作者选择兔的股骨外髁部作为建模部位。

目前国内将兔股骨髁缺损模型用于实验研究已有不少报道，但就股骨髁临界性骨缺损值进行相关的探讨文章较少，大多直接根据既往文献中大多的模型制备方式制备股骨髁骨缺损模型，且缺损尺寸大小不一。如黄鑫等^[23]制备的股骨髁松质骨缺损模型尺寸为6 mm(直径)×10 mm(深度)；LIU等^[24]则在实验中选择了7 mm(直径)×10 mm(深度)作为股骨髁缺损模型的值。上述文献中所涉及到的6 mm、7 mm空白对照组中的骨缺损模型在实验周期内均未完全愈合，考虑上述实验结果，此次实验在其基础上增加了直径5 mm，深度10 mm的缺损模型，来推测兔股骨髁临界性骨缺损值，从而为后期的研究提供数据支持。

骨缺损愈合是一个渐进性的过程，需要一定的时间支持。然而完整的观察实验动物的整个生命周期是较为困难的，因此GOSAIN等^[18]也将临界性骨缺损值限定为在实验期间不能自行愈合的最短骨缺损尺寸。LIN等^[25]在研究仿生三维羟基磷灰石/胶原蛋白支架对骨再生影响的实验中选择了12周作为实验动物的观察周期，CHANG等^[26]在研究中也选择了12周作为实验动物骨愈合的观察周期，而SUN等^[27]则选择了术后8周处死新西兰白兔并取出股骨做进一步实验观察。结合上述文献中提到的观察周期，作者将实验周期设计为12周，以评价在12周内兔股骨髁缺损的愈合情况，从而确定临界性骨缺损值。

此次实验根据邓威等^[16]文献中提到的缺损制备方法，制备了直径分别为5，6，7 mm，深度10 mm的兔股骨髁缺损模型，并发现直径5 mm，深度10 mm的兔股骨髁缺损在12周实验周期内基本愈合，而直径6，7 mm的兔股骨髁缺损在12周观察期内缺损区仍明显可见，表明直径6 mm，深度10 mm的兔股骨髁缺损值可以作为兔股骨髁临界性骨缺损值。实验在一定程度上填补了兔股骨髁临界性骨缺损研究中数据上的不足，并对直径6 mm，深度10 mm的兔股骨髁缺损作为兔股骨髁临界性骨缺损提供了数据上的支持。

综上所述在制备兔股骨髁缺损模型时，可将直径6 mm，深度10 mm作为兔股骨髁临界性骨缺损值。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

文题释义：

临界性骨缺损：首先定义为自然状况下骨缺损不进行任何处理无法自愈的最短的骨缺损尺寸。随后考虑到观察实验动物完整的生命周期是非常困难的，将临界性骨缺损值定义为在实验期间物种不能自行愈合的最短骨缺损尺寸。

动物模型：是在医学研究中建立的模拟人类疾病表现的动物，骨组织工程中建立临床相关的测试动物模型来研究材料的生物相容性、降解、力学性能以及与宿主组织的相互作用，是体外实验和人体临床试验之间的关键一步。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

目前国内将兔股骨髁缺损模型用于实验研究已有不少报道，但就股骨髁临界性骨缺损值进行相关的探讨文章较少，大多数直接根据既往文献中大多的模型制备方式制备股骨髁骨缺损模型，且缺损尺寸大小不一。文献报道的所涉及到的6 mm、7 mm空白对照组中的骨缺损模型在实验周期内均未完全愈合，考虑以往实验结果，此次实验在其基础上增加了直径为5 mm，深度为10 mm的缺损模型，来推测兔股骨髁临界性骨缺损值，从而为后期的实验研究提供数据支持。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程