2.1  脐带间充质干细胞的培养及表型检测结果  脐带间充质干细胞呈梭形生长，流式抗体染色显示，脐带间充质干细胞高表达CD90、CD44和CD73表面抗原，阳性率依次为(98.69±9.87)%，(99.59±10.12)%，(99.85±12.32)%；低表达CD34、CD45和CD14表面抗原，阳性率依次为0%，0.04%，(0.21±0.04)%，复合间充质干细胞表型要求。

2.2  TDP43慢病毒转染脐带间充质干细胞效果检测结果  将野生型TDP43基因重组到慢病毒载体Lv-GV358-GFP中，并以不同转染复数值转染脐带间充质干细胞，通过荧光倒置显微镜和锥虫蓝染色确定最佳转染复数值进而转染脐带间充质干细胞。图1为GFP荧光确定的转染效率和细胞存活率分析曲线，可以看到随着转染复数值增加，脐带间充质干细胞的死亡率也略有增加，在转染复数值为20时TDP43慢病毒转染效率达到90%以上，死亡率不到5%，选择其为最佳转染转染复数值。在转染复数值为20时，TDP43慢病毒转染脐带间充质干细胞90%以上发绿色荧光，表明TDP43慢病毒转染脐带间充质干细胞成功。

通过荧光定量PCR和Western blotting分别检测TDP43在不同处理脐带间充质干细胞中的基因和蛋白表达水平。图2A显示TDP43慢病毒转染脐带间充质干细胞中的TDP43基因表达高于空载体慢病毒转染脐带间充质干细胞、未转染脐带间充质干细胞(P=0.001，0.004)。图2B显示TDP43慢病毒转染脐带间充质干细胞高表达TDP43蛋白，分子质量为43 kD，而且还可见TDP43异构体蛋白，分子质量为35 kD；空载体慢病毒转染脐带间充质干细胞、未转染脐带间充质干细胞均不表达TDP43蛋白，表明TDP43慢病毒转染脐带间充质干细胞高表达TDP43基因和蛋白，还发现全长TDP43降解形成截短型TDP43/p35蛋白。

2.3  TDP43慢病毒转染脐带间充质干细胞可分化为软骨细胞  脐带间充质干细胞通过体外诱导培养分化成软骨细胞分化，在第21天进行阿新蓝染色，倒置显微镜显示TDP43慢病毒转染脐带间充质干细胞、空载体慢病毒转染脐带间充质干细胞、未转染脐带间充质干细胞的胞浆呈蓝色质，可向软骨细胞分化。

通过qRT-PCR分析胶原蛋白(Ⅰ型胶原a1、Ⅱ型胶原a1和Ⅲ型胶原a1)在3种脐带间充质干细胞中的表达情况，结果显示：空载体慢病毒转染及未转染脐带间充质干细胞中的Ⅰ型胶原a1基因表达均明显高于TDP43慢病毒转染脐带间充质干细胞(P=0.04，0.036)，Ⅱ型胶原a1和Ⅲ型胶原a1基因表达也均明显高于TDP43慢病毒转染脐带间充质干细胞(P=0.035，0.012；P=0.041，0.011)，见图3，表明TDP43慢病毒转染的脐带间充质干细胞可分化为软骨细胞，但其表达的胶原蛋白基因与未转染慢病脐带间充质干细胞有明显差异，可能与TDP43过表达后影响了胶原蛋白基因表达有关。

2.4  干细胞与软骨细胞共培养实验结果

2.4.1  共培养后软骨细胞形态变化  人软骨细胞与TDP43慢病毒转染脐带间充质干细胞共培养12 d，倒置显微镜显示软骨细胞形态发生显著改变，生长已不呈长梭形，细胞变得粗大，并出现多个分枝情况；而与空载体慢病毒转染脐带间充质干细胞、未转染脐带间充质干细胞共培养的软骨细胞形态未出现变化，即梭形贴壁生长。

2.4.2  共培养后软骨细胞增殖变化  与TDP43慢病毒转染脐带间充质干细胞共培养的软骨细胞数量持续减少，不断有死细胞出现，增殖水平明显低于与其他两组共培养的软骨细胞(P=0.005，0.012)，见图4。

2.4.3  共培养后软骨细胞凋亡变化  共培养到第3天进行细胞凋亡检测，与TDP43慢病毒转染脐带间充质干细胞共培养软骨细胞的Annexin V、Annexin V与PI双阳性、PI阳性率分别为32.41%，36.13%，1.17%，而与其他两组共培养软骨细胞的Annexin V与PI阳性率均在10%以下，组间比较差异有显著性意义(P=0.008，0.014)，见图5。结果表明与TDP43慢病毒转染脐带间充质干细胞共培养后，高表达的TDP43引起了软骨细胞凋亡，抑制了细胞增殖。

2.4.4  共培养后软骨细胞凋亡信号通路分析  与TDP43慢病毒转染脐带间充质干细胞共培养软骨细胞内关键基因TDP43表达高于与其他两组共培养的软骨细胞(P < 0.05)，与TDP43慢病毒转染脐带间充质干细胞共培养软骨细胞内关键基因RACK1表达高于其他两组共培养的软骨细胞(P=0.014，0.009)，见图6A。同时检测细胞凋亡通路中关键基因的表达，结果显示：与TDP43慢病毒转染脐带间充质干细胞共培养软骨细胞内的JNK、AP-1和Bcl-xl的基因表达水平均明显高于其他两组共培养的软骨细胞(P < 0.05)，见图6B。结果揭示TDP43激活了RACK1基因的表达，通过激活JNK-AP-1-Bcl-xl信号通路引发与TDP43慢病毒转染脐带间充质干细胞共培养软骨细胞的凋亡。

骨性关节炎是一种多因素病因引起的慢性退行性疾病，表现为关节软骨丢失和滑膜炎症的问题^[1]。已有研究证实，骨性关节炎是一种低级别的炎症反应和营养缺乏引起的内质网应激，对软骨细胞形成了长久的损伤作用^[2-3]。

间充质干细胞在骨性关节炎条件下出现于滑液中，被认为在体内介导了骨性关节炎的损伤组织再生和抗炎症反应^[4-6]。一些与间充质干细胞共培养研究中证实了未成熟关节软骨细胞产生可溶性因子，能抑制体外成熟生长的软骨细胞终端分化^[7-9]。人滑膜来源间充质干细胞与硝普酸钠激活的软骨细胞共培养，可促进炎性因子分泌、抑制炎症活性相关基因表达，通过分泌胰岛素样生长因子1提高了软骨细胞增殖^[8]。

炎症反应在内的细胞应激导致了TDP43的合成。TDP43是一种组织中分布广泛、功能多样的核蛋白，属于异种的核糖核蛋白家族，与基因转录、剪切和核小体功能相关^[10-11]，其基因突变和过表达对神经产生毒性，引起神经细胞和胶质细胞凋亡。内质网应激药物诱导促进了软骨细胞质中TDP43的积累，这与应激颗粒相关^[2]。细胞应激能激活存活或凋亡的防御机制，低氧、热休克和亚砷酸盐等1类应激引发细胞质应激颗粒的形成，属于一个主要的适应性防御机制^[12]；射线和遗传毒性药物属于2类应激反应，其能激活JNK MAPK信号通路引发细胞损伤作用^[13]。RACK1的功能是作为这两类应答的一个调控子，RACK1结合应激反应的MTK1而促使2类应激的激活，但是在1类应激条件下RACK1被隔离在应激颗粒中。研究表明，1类应激抑制了2类应激诱导的RACK1信号活化，进而促使细胞凋亡^[14]。机体内炎症反应属于2类应激反应^[13]，诱发了软骨细胞凋亡，然而骨性关节炎发病到底是何种分子信号起到关键性作用至今还未被证实过。

基于间充质干细胞在维持软骨细胞正常功能和抑制炎症反应中发挥了关键角色，实验以间充质干细胞作为调控表达炎症因子的载体而影响软骨细胞的正常功能，通过构建野生型TDP43慢病毒载体并包装成慢病毒转染人间充质干细胞，分析其成软骨细胞能力；将TDP43慢病毒转染的间充质干细胞与人软骨细胞共培养研究软骨细胞的增殖能力和凋亡发生情况，通过基因表达和活性检测软骨细胞增殖和凋亡的关键分子信号通路，将有利于明确骨性关节炎中软骨细胞凋亡的原因及发生机制。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

1.1  设计  观察性实验。

1.2  时间及地点  实验于2016年7月至2017年12月在广东省中医院、广东省中医药科学院完成。

1.3  材料  人软骨细胞购买自Sciencell公司；DMEM高糖培养基、αMEM培养基(美国Life公司，Gibco)；流式细胞仪(FC500，美国贝克曼库尔特公司)；Lipofectamine 2000 (美国Life公司，Invitrogen)；GV358-GFP质粒、pHelper 1.0载体、pHelper 2.0载体(上海吉凯)；牛胰岛素(美国Sigma-Aldrich)；转化生长因子β(美国R&D公司)；Annexin V-FITC和PI(上海碧云天生物技术有限公司)；ABI 7500仪器(美国Applied Biosystems公司)；流式细胞仪(FC500，美国贝克曼库尔特公司)；cDNA合成试剂盒(日本Takara公司)。

废弃的人脐带组织来自广东省中医院，产妇及家属对实验知情同意并签署知情同意书。

1.4  实验方法

1.4.1  细胞培养与分化  

软骨细胞的培养：使用含体积分数10%胎牛血清和双抗的DMEM高糖培养基培养软骨细胞。

      脐带间充质干细胞的培养与鉴定：将脐带经体积分数75%医用乙醇浸泡两三分钟，生理盐水洗涤3次，用眼科剪剪碎至1 mm³左右，将组织块加入到细胞培养皿中，培养体系为含体积分数10%胎牛血清和1×青霉素链霉素的αMEM培养基，放置于37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中培养4 d后换液，之后每3 d换液1次，培养14 d细胞融合至80%-90%时，用胰酶消化传至下1代，按1瓶培养3瓶的比例传代，四五天传1代，共传3代。将获得的间充质干细胞经流式抗体染色，并在流式细胞仪上机检测其表面抗原CD90、CD44、CD73、CD45、CD14和CD34。

1.4.2  TDP43表达载体构建与慢病毒包装  采集健康志愿者外周血(与供者签署实验知情同意书)，加入淋巴细胞分离液1 800 r/min离心20 min，收集中间白膜层，经洗涤3次后获得单个核细胞。使用Trizol试剂提取总单个核细胞RNA，通过反转录试剂盒扩增获得cDNA，并经DNA聚合酶链式反应(PCR)扩增获得野生型TDP43基因，引物序列为：正义链：5'-GAG GAT CCC CGG GTA CCG GT-CGC CAC CAT GTC TGA ATA TAT TCG GGT AAC-3'；反义链：5'-TCC TTG TAG TCC ATA CC-CAT TCC CCA GCC AGA AGA CTT AG-3'(含AgeⅠ酶切位点)。PCR反应条件为：95 ℃ 3 min，95 ℃ 45 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，35个循环，72 ℃ 4 h。PCR产物通过凝胶电泳回收纯化，回收的片段使用AgeI/AgeI进行双酶切，用T4 DNA连接酶将TDP43目的基因PCR产物与AgeⅠ/AgeⅠ酶切后的GV358-GFP质粒进行连接，合成TDP43-Lv-GV358-GFP重组质粒，转化感受态DH5α后在液体LB培养基中培养，并将菌液进行PCR检测阳性后，送中国英杰公司测序鉴定。

将对数生长期的293T细胞种植在6孔板中，培养24 h后细胞融合率达到80%以上，弃上清；将20 μg TDP43-Lv-GV358-GFP载体DNA溶液与15 μg pHelper 1.0载体、10 μg pHelper 2.0载体加入到250 μL DMEM培养基中，配制成病毒预混合液；将10 μL Lipofectamine 2000加入到250 μL DMEM培养基中，配制成包装混合液；将两者混合后室温孵育20 min加入到293T细胞中，轻轻混匀后在37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中培养6 h，更换新鲜DMEM培养液，在37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中继续培养48 h，收集上清病毒液，20 000 r/min离心20 min后，即获得TDP43-Lv-GV358病毒液，采用荧光法测定病毒滴度。

1.4.3  TDP43慢病毒转染间充质干细胞  

慢病毒转染：将对数生长期的脐带间充质干细胞接种到6孔板中，细胞浓度为1×10⁸ L^-1，置于37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中培养过夜，加入不同转染复数的慢病毒，包括包装好的TDP43-Lv-GV358-GFP慢病毒、空白Lv-GV358-GFP慢病毒，转染复数分别为1，10，20，50和100，混匀培养后更换新鲜含体积分数10%胎牛血清的αMEM培养基，在37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中继续培养。培养第3天通过荧光倒置显微镜观察GFP荧光强度，锥虫蓝染色计数细胞活率，分析最佳转染复数值。取最佳转染复数值对脐带间充质干细胞进行慢病毒转染，8-12 h后更换新鲜培养基，获得转染成功的脐带间充质干细胞。

转染效率检测：预冷RIPA蛋白抽提试剂，加入蛋白酶抑制剂Roche裂解转染前后的脐带间充质干细胞，提取其总蛋白并定量。蛋白液按4∶1体积与5×SDS上样缓冲液混合，100 ℃变性5 min，进行12% SDS-PAGE凝胶电泳。PVDF膜用含5%脱脂奶粉的TBST室温封闭，2 h后弃封闭，加入TDP43多克隆小鼠抗体(1∶1 500)和鼠抗人RACK1单克隆抗体(1 000∶1)孵育过夜。洗膜3×10 min，加入抗鼠二抗(1∶1 000)，孵育后洗膜、显像，并以NAPH作对照。所有Westem blotting显像结果扫描成图片，使用Image J软件进行灰度分析。qRT-PCR检测转染前后脐带间充质干细胞中TDP43基因的表达(方法见1.4.5)。

1.4.4  脐带间充质干细胞的成软骨诱导分化  将TDP43慢病毒转染脐带间充质干细胞、空载体慢病毒转染脐带间充质干细胞、未转染脐带间充质干细胞分别接种至75 cm²培养瓶中，接种细胞数量为1×10⁶；加入成软骨细胞分化培养基，即αMEM培养基添加10 µg/L转化生长因子β、     50 nmol/L L-唾液酸和6.25 mg/L牛胰岛素，每隔2 d更换一次分化培养基。连续培养21 d后，将细胞以40 g/L多聚甲醛固定在载玻片上，D-PBS洗涤2次，0.1 mol/L醋酸钠-盐酸缓冲液(pH=1.0)清洗；置1%阿新蓝、0.1 mol/L醋酸钠-盐酸缓冲液(pH=1.0)溶液内染色30 min；0.1 mol/L醋酸钠-盐酸缓冲液(pH=1.0)充分冲洗，滤纸吸干；蒸馏水充分冲洗后显微镜下拍照。qRT-PCR检测细胞中Ⅰ型胶原a1、Ⅱ型胶原a1和Ⅲ型胶原a1基因的表达(方法见1.4.5)。

1.4.5  干细胞与软骨细胞共培养  取人软骨细胞，调整细胞浓度为1×10⁸ L^-1，接种于0.3 μm孔径transwell6孔板外室中，每孔2 mL；取TDP43慢病毒转染脐带间充质干细胞、空载体慢病毒转染脐带间充质干细胞、未转染脐带间充质干细胞，调整细胞浓度为2×10⁸ L^-1，分别接种于transwell6孔板内室中，每孔1 mL；内、外孔均加入含体积分数10%胎牛血清的DMEM/高糖培养基，在37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中连续培养12 d，每天倒置显微镜下观察细胞形态变化。

共培养软骨细胞增殖分析：共培养第0，3，6，9，12天，用含EDTA的0.25%胰酶消化细胞，锥虫蓝染色，在使用Countstar细胞计数仪计数细胞数量，每次重复取样，计数3次，计算细胞增殖水平。

共培养软骨细胞凋亡检测：共培养第3天，用Annexin V-FITC和PI进行细胞凋亡检测分析。消化计数3×10⁵人软骨细胞，用1×PBS(pH=7.4)洗涤2次后重悬于20 μL结合缓冲液中，加入5 μL Annexin V-FITC与PI混合液，混匀后在4 ℃冰箱染色30 min，用1×PBS洗涤2次后，用600 μL 1×PBS重悬后直接在流式细胞仪上机检测。软骨细胞用DMSO处理后用作阴性对照。

qRT-PCR检测信号通路基因表达：共培养第3天，通过Trizol试剂提取软骨细胞总RNA，利用第1链cDNA合成试剂盒反转录PCR获得cDNA。经NANO-200超微量核酸分析仪定量后，取该cDNA 20 ng，10 μL GoTaq○RqPCR Master Mix和0.2 μmol每个引物，体系20 μL，引物序列见表1；在95 ℃ 3 min，95 ℃ 45 s，60 ℃ 45 s，72 ℃30 s，40个循环，利用ABI 7500仪器进行检测。每个样本检测3次，每个样本使用2^-dCt公式计算表达差异。

1.5  主要观察指标  TDP43慢病毒转染脐带间充质干细胞对软骨细胞增殖、凋亡与凋亡信号通路的影响。

骨性关节炎是多种病因引起的疾病，但具有相似的病理学改变。早期骨性关节炎过度负重诱发了其他的正常关节破坏，骨性关节炎应激病变与软骨退行性病变密切相  关^[15]。炎症反应也属于应激病变中的一种，持续炎症反应产生的前列腺素通过免疫细胞超敏反应产生促进了攻击性现象^[16]，造成软骨细胞病变；并且炎症反应所产生的活性氧簇在骨性关节炎中也可能具有负面作用^[16]。

骨性关节炎中免疫细胞及其产生的细胞因子在软骨代谢中有着重要的作用，免疫细胞和炎症因子是干预骨性关节炎的首要因素^[17]。体内外大量研究证实了间充质干细胞能分化为中胚层细胞类型，形成软骨、骨和脂肪^[18]；同时间充质干细胞可旁分泌抗炎症的细胞因子^[19]，能与免疫细胞相互作用抑制免疫细胞的炎症反应及其引起的超敏反应；同时也通过诱导调节性T细胞CD4⁺CD25⁺细胞增生而发挥免疫抑制活性^[20]。许多研究利用骨髓和脂肪来源间充质干细胞改善膝骨性关节炎患者的功能和疼痛，患者出现透明样软骨再生和新生，软骨细胞损伤大小持续减少，而且具有很少的不良反应^[21]。随着患者的年龄增大，间充质干细胞的质量和数量均明显减少，而且其增殖和分化功能也有显著降低。健康间充质干细胞的缺失也被看成是骨性关节炎加重的一个关键因素^[22]。因而实验选择将间充质干细胞与人软骨细胞进行共培养，研究其炎症活性抑制作用和对软骨细胞的保护作用。某些研究表明了与软骨细胞共培养诱发的机制可能依赖于可溶性因子的协同作用，如转化生长因子β2和纤维生长因子^[23]，而另外的研究推测为依赖转化生长因子β信号通路的^[24]。

TDP43是大多数细胞中普遍存在并表达的核蛋白，被鉴定为人免疫缺陷病毒的结合蛋白1型TAR DNA元件^[25]。SWARUP等^[26]使用酵母单杂交系统从脂多糖激活的人单核细胞cDNA库中筛选结合肿瘤坏死因子α启动子DNA结合域，脂多糖诱导肿瘤坏死因子α表达之前TDP43 mRNA已表达提高，其在单核细胞中表达上升也导致了肿瘤坏死因子α表达增加，肿瘤坏死因子α可以激活核因子κB产生大量的促炎症因子^[27]，表明TDP43可能是炎症反应中促使肿瘤坏死因子α表达提高的新的因素。YANG等^[28]研究发现TDP43在胶质细胞中高表达，与核因子κB亚基p65相互作用共定位于细胞核上激活p65表达，从而产生大量的促炎症因子。这些研究出示TDP43在炎症应激中被激活，诱导炎症因子分泌而对正常细胞产生细胞毒性。

实验通过TDP43基因包装的慢病毒转染间充质干细胞，间充质干细胞具有正常分化为软骨细胞的能力，TDP43蛋白降解为截短型TDP43/p35蛋白。将软骨细胞与TDP43慢病毒转染脐带间充质干细胞共培养后促进了软骨细胞RACK1基因的表达，其高表达的TDP43并未促进软骨细胞增殖，而引起了软骨细胞凋亡。RACK1表达提高抑制了p38激酶而激活了JNK激酶，细胞凋亡是通过JNK-AP-1-Bcl-xl信号通路激活的。结果揭示了在骨性关节炎中炎症反应引起了应激反应，TDP43可能起到负调控作用，促进软骨细胞凋亡。这一发现与神经退行病变中TDP43的作用相一致，YAN等^[29]发现氧应激和先天性免疫是TDP43相关神经退行性疾病的内在因素，其在两者相反作用的细胞保护p38和细胞毒性JNK信号通路中起到关键的平衡作用。然而RACK1可以调控JNK和p38两者信号通路，发挥细胞保护和凋亡的作用^[30]，因而TDP43对JNK和p38相反作用的调控可能是通过RACK1来实现的。

实验将野生型TDP43在脐带间充质干细胞中表达并与软骨细胞共培养，诱发软骨细胞生物学功能的改变，分子信号中激活RACK1表达并参与骨性关节炎疾病的进展。基于骨性关节炎疾病的进展，TDP43信号和RACK1的鉴定为其提供了新的分子机制。一直以来骨性关节炎发病机制的研究集中在炎症反应和软骨病变等方向，而由于炎症因子激活产生的氧应激造成的软骨损伤可能是骨性关节炎持续作用的主要因素，将针对关键目的基因或蛋白进行基因治疗或抗体靶向治疗，逆转或抑制其作用从而有效治疗骨性关节炎。

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文题释义：

TTDP43：一种高度保守、广泛表达的核蛋白，多功能地与DNA和RNA结合参与RNA转录、选择性剪接，并可调节细胞中mRNA的稳定性，可从细胞核到细胞质中形成泛素阳性包涵体，对肌萎缩侧索硬化症和额颞叶变性具有神经毒性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

骨性关节炎与炎症因素介导的软骨细胞凋亡密切相关，炎症免疫问题贯穿其发生发展的全过程。在缺血缺氧条件下TDP43 可能为MAPK信号通路关键的负调控因子，但其在骨性关节炎中对JNK及p38 MAPK信号通路作用并不清楚。研究采用TDP43慢病毒转染间充质干细胞体外分析如何通过TDP43/p35表达下调RACK1活性，调控信号通路p38 MAPK和JNK并抑制其活化的软骨细胞凋亡及其分子机制，明确骨性关节炎发病的分子机制理论。

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