机械因素对组织工程干细胞增殖和分化的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.19.019

中国组织工程研究 ›› 2016, Vol. 20 ›› Issue (19): 2864-2871.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.19.019

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机械因素对组织工程干细胞增殖和分化的影响

姜东¹，王继宏²

1内蒙古医科大学，内蒙古自治区呼和浩特市 010030
2内蒙古医科大学第二附属医院手足显微外科，内蒙古自治区呼和浩特市 010030

收稿日期:2016-03-15 出版日期:2016-05-06 发布日期:2016-05-06
通讯作者: 王继宏，博士，主任医师，内蒙古医科大学第二附属医院手足显微外科，内蒙古自治区呼和浩特市 010030
作者简介:姜东，男，1990年生，内蒙古自治区鄂温克自治旗呼伦贝尔市人，汉族，2013年内蒙古医科大学毕业，主要从事肌腱和周围神经修复方面的研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81441117)，课题名称：持续牵张应力刺激对兔跟腱损伤修复早期生物力学及相关因子表达的影响

Effects of mechanical factors on proliferation and differentiation of tissue- engineered stem cells

Jiang Dong¹, Wang Ji-hong²

1Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010030, Inner Mongolia Autonomous Region, China
2Department of Hand-Foot Microsurgery, Second Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010030, Inner Mongolia Autonomous Region, China

Received:2016-03-15 Online:2016-05-06 Published:2016-05-06
Contact: Wang Ji-hong, M.D., Chief physician, Department of Hand-Foot Microsurgery, Second Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010030, Inner Mongolia Autonomous Region, China
About author:Jiang Dong, Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010030, Inner Mongolia Autonomous Region, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81441117

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
肌腱干细胞：从人和鼠的肌腱组织中成功分离提取出这种细胞，并发现在体外培养时这种细胞表现出克隆形成能力、自我更新及多向分化潜能等细胞的普遍特性，而且植入体内后可生成肌腱样组织，于是将这种细胞群定义为肌腱干细胞。
牵张应力：牵张应力的加载装置主要是通过各种方法对培养基膜的牵拉，使黏附于基膜上的细胞被动伸展，应用此力学装置，能较好的模拟体内组织受牵拉时的力学环境，可以给予细胞静止性或周期性，单向或双轴的牵拉，牵张应力大小及时间频率可以量化，加载刺激时或刺激前后均可用显微镜观察细胞情况。

摘要
背景：随着组织工程技术的发展和再生肌腱研究的深入，将解决传统肌腱移植所引起的诸多问题。
目的：依据肌腱自身性质、干细胞的优缺点、机械力学系统的特点以及相应的力学系统对种子细胞的影响进行评价与展望。
方法：检索中国生物医学文献数据库(CBM)、中国知识资源总库(CNKI)系列数据库、中文科技期刊数据库、PubMed 数据库 2005年1月至2015年12月收录的肌腱组织工程相关综述和论文报告，检索词为组织工程(tissue engineering)，肌腱(tendon)，肌腱干细胞(tendon stem cell)，力学刺激(mechanical stimulation)，种子细胞(seeding cells)，最终纳入63篇文献进行分析。
结果与结论：①各种干细胞及相应的力学系统在组织工程的应用中各有优势和不足，研究者可根据研究需要加以选择；②肌腱干细胞在再生肌腱领域里应用有着广阔的前景，通过合适、精确、温和的机械力学刺激将肌腱干细胞培养成为满足需要的肌腱组织，将为医生和患者改善肌腱损伤后临床愈合效果提供另一种选择。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0003-2788-8997(王继宏)

关键词: 干细胞, 分化, 肌腱干细胞, 种子细胞, 体外培养, 力学刺激, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: With the development of tissue engineering technology and the deep research of tendon regeneration, many problems caused by traditional tendon transplantation will be solved.
OBJECTIVE: To evaluate and prospect the effects of corresponding mechanical systems on seeding cells based on the characters of tendon, stem cells as well as mechanical systems.
METHODS: CBM, CNKI, CqVip and PubMed databases were retrieved for reviews and articles related to tissue-engineered tendon published from January in 2005 to December in 2015. The keywords were “tissue engineering, tendon, tendon stem cell, mechanical stimulation and seeding cells” in Chinese and English, respectively. Finally a total of 63 articles were selected for overview.
RESULTS AND CONCLUSION: As all kinds of stem cells and the corresponding mechanical systems exhibit advantages and disadvantages when applied for tissue engineering, it is advisable to make appropriate choices according to the research needs. Tendon stem cells show a broad application prospect in tendon regeneration, which will grow into required tendon tissues through appropriate, accurate and gentle mechanical stimulations, thereby providing another alternative to improve the tendon healing.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Stem Cells, Mechanics, Cell Proliferation, Cell Differentiation, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

姜东，王继宏. 机械因素对组织工程干细胞增殖和分化的影响[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(19): 2864-2871.

Jiang Dong, Wang Ji-hong. Effects of mechanical factors on proliferation and differentiation of tissue- engineered stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(19): 2864-2871.

图/表（结果） 1

2.1 培养组织工程肌腱的干细胞 主要包括间充质干细胞、肌腱干细胞^[1-3]、胚胎干细胞。

2.1.1 间充质干细胞 Cohnheim等^[4-5]在140多年前发现骨髓中存在非造血干细胞，并且能分化为成纤维细胞和许多中胚层起源的细胞。间充质干细胞是在19世纪60到70年代首次提出的，Friedenstein等^[6]和他的团队在骨髓细胞培养时发现有一些细长的细胞不具备造血功能，却具有个体细胞增长的能力。间充质干细胞最初被人们定义为从成人骨髓中分离和培养的多功能干细胞，然而根据干细胞的细胞特征及研究方向其命名略有不同。在适当的条件下，间充质干细胞在体外可以分化为几个谱系的细胞，如成骨细胞^[7]、软骨细胞^[8]、脂肪细胞^[9]、肌细胞^[10]、神经细胞、胰腺和肝细胞谱系等。间充质干细胞在体内分布广泛，取材较为方便，在骨髓、脂肪^[11-12]、筋膜和骨骼肌组织中即可分离得到^[13]。骨髓间充质干细胞的表面抗原表达谱研究详尽，但是变异仍然存在于骨髓间充质干细胞种群，于是2006年国际细胞治疗协会(The International Society for Cellular Therapy)做出规定^[14]：骨髓间充质干细胞表面特异性抗原必须是CD105(+)，CD73(+)，CD90(+)，CD45(-)，CD34(-)，CD18(+)，CD14/CD11b(-)，CD79a/CD19(-)，这使其分选和纯化有了国际认同的统一标准。目前国际上普遍的分离间充质干细胞的方法包括：组织消化法、密度梯度离心法、免疫磁珠法和全骨髓贴壁法，前者应用较多。间充质干细胞具有诸多优点，首先是组织损伤修复作用，其可以在炎症递质的引导下迁移到受损伤部位参与组织修复^[15]，但在临床应用方面还有许多的障碍，主要有细胞工程技术的不成熟、费用昂贵、引入体内的安全性问题等，克服这些困难，还需要了解分子和细胞在生理和病理状态时的机制，如胚胎发育、炎症、伤口愈合、癌症转移等。解决这些细胞机制问题，将对干细胞的研究具有更强的导向性和效用性，并将取代某些不可治愈疾病当前的临床治疗方法。其次间充质干细胞是较原始的干细胞，免疫原性较低甚至可以忽略，这就削弱器官移植的配型障碍和增加移植物存活的机会^[16]，为临床治疗提供了另一种优质的疗法^[17-18]。

2.1.2 肌腱干细胞 传统的学术观念认为，肌腱仅由散在分布梭形腱细胞和纵行排列的胶原纤维组成。2007年de Mos等^[19]研究表明，肌腱细胞中存在一种具有多分化潜能、无限增殖的细胞。此后在研究人类和小鼠的肌腱细胞时，发现其拥有自我复制、更新、并向来自于同胚层组织细胞分化的能力，具有干细胞的特性，如具有克隆传代、多分化潜质和自我更新能力，在组织工程肌腱的研究中也是比较理想的种子细胞。目前研究主要集中在肌腱干细胞的提取、体外培养及分化(三系分化能力即成骨、软骨和脂肪的能力)。肌腱干细胞表面抗原标记物阳性表达的有^[20-22]：Sca-1和SSEA-4，CD29，CD44，CD90，CD105，STRO-1，CD146，Nucleostemin，Oct-4，CD14， CD31，CD34，CD18，CD117，CD45，Flk-1，CD144和CD106，不同物种来源的肌腱干细胞表面标记物略有不同。肌腱干细胞属于成体干细胞、单能干细胞，可从哺乳动物肌腱组织中获得^[23-25]，因此体外培养时组织细胞的来源广泛、分化调控相对简单、特定组织分化能力强。当下其广泛应用还存在很多难题，首先肌腱干细胞虽然来源广泛，但在组织中的含量过少，因此相关技术能力要求较高；其次虽然肌腱干细胞在腱组织受损时起主导的修复作用，但在健康的机体组织中其处于静止状态，只有当损伤因子打破细胞内外环境平衡，在神经和体液的调节下，肌腱干细胞苏醒并开始增殖和分化，以修复受损的腱组织。体外培养时，如何更有效的激活肌腱干细胞来缩短周期降低成本，需要研究者的不断努力。

2.1.3 胚胎干细胞 1981年Evans和Kaufman在怀孕小鼠的胎盘中首次分离得到小鼠的胚胎干细胞^[26]。随后Martin以免疫外科法从鼠囊胚滋养层得到胚胎干细胞^[27]。Brook等^[28]进一步完善了小鼠胚胎干细胞的分离方法，以致从许多品系小鼠包括近交系和突变系，均可获得胚胎干细胞。1998年Thomson等^[29]在小鼠胚胎干细胞研究基础上成功用女性囊胚组织建立人胚胎干细胞系。目前国内外研究人员已从仓鼠、大鼠^[30]、兔^[31]、猪、牛^[32]、山羊等分离获得了胚胎干细胞，胚胎干细胞具有多能性，特点是可以通过细胞分化发育成为外胚层、中胚层及内胚层3种胚层的组织细胞，对胚胎的发育和分化起着至关重要的作用^[33]。已有研究证明胚胎干细胞可以分化为生命体的所有细胞，包括前面提到的间充质干细胞、肌腱干细胞及其他一些具有特定属性的干细胞等^[34]。胚胎干细胞较其他干细胞具有最广泛和原始的分化潜能。在目前的研究中已发现其胞浆中的甲胎蛋白和TLMA活性较高，而且在未分化成熟的胚胎干细胞中Oct3/4、TDGF、Sox2、LeftyA、Thy-1、FGF4、Rex1、SSEA3、SSEA4、TRA-1-81、TRA-2-54 和 GCTM-2高表达，这些为胚胎干细胞分离和纯化提供准确的标记。但是胚胎干细胞存在伦理道德方面的争议，另外由于其具有全能分化潜力，在进行损伤组织修复时会由于细胞内环境的紊乱，激活它的病理性增殖、分化潜能，脱离机体监控，进而成瘤或致畸。Maya-Espinosa等^[35]在研究大鼠时发现，胚胎干细胞会修复因脑卒中受损的纹状体，促进神经元的分化，这为人类神经细胞的修复提供重要的基础。Khan等^[36]在研究小鼠胚胎干细胞时发现，其具有促进心肌细胞再生和调节心肌细胞分化的能力进而促进心肌修复。

除上述3种细胞外，成纤维细胞、角质细胞、上皮细胞、成骨细胞等均可以成为“再生肌腱”的种子细胞。这些细胞虽然有来源广泛、伦理限制小、致畸胎率低等优点，但它们属于成体已分化的细胞，再分化能力不足；其次培养出的组织容易属性混乱及不可避免的免疫原性，因此需要更高要求的组织工程细胞培养技术。

2.2 力学因素及组织工程机械应力分类

2.2.1 诱导分化因素简述 细胞在体外培养过程中受到会诸多因素的影响，例如生长因子、体液离子、体外冲击波、热休克、机械应力等，不同因素会诱导其向不同方向分化。由于人体肌肉系统随时随地都在做着物理运动，力学刺激充斥着细胞生存的微环境。因此机械力学刺激是调节“细胞再生肌腱”比较重要的一环。

2.2.2 应力系统分类 细胞培养过程中的微环境应力刺激，主要是通过外界力学装置传导系统施加。目前广泛应用的力学系统主要有：①细胞流体切应力系统又称流体剪切应力系统。正常机体在运动过程中，组织液受到重力、渗透压力、肌肉及其他组织牵拉、收缩的压力，导致组织液在细胞周围不规则流动使细胞受力。根据这一流变原理将细胞培养在多通道循环流动小室中，以尽量模拟细胞在体内受切应力的微环境。目前国内外常见的细胞流体切应力模型有：STR-4000多通道微流控流体切应力加载模型和Flexflow流体切应力同时抻拉细胞的平行板流室模型。②静止应压力系统，细胞的生活空间某种程度上可以认为是相对封闭的，因此在外力作用下细胞表面会均匀受到体液的正性压力或负性压力。将细胞和组织培养在封闭的培养容器中，可以通过液体或气体对培养物施加压力，其优点是培养物受力均匀、不必与培养基粘连。目前常见的应压力系统主要是固静止压力系统和周期分段调节静止应压力系统。③牵张应力系统，肌肉收缩最直观的表现就是细胞受到牵拉，从而激活离子通道进行细胞信号的传导，从目前的文献可以看出此系统在细胞培养及分化过程中起着比较重要的作用。实验时将种子细胞接种在细胞支架上，再对支架施加温和的牵张应力，然后在培养基中培养。徐源^[37]通过家兔的实验证实，在牵张应力系统培养下的再生肌腱生物结构及力学性能更接近生理状态下的肌腱。应力牵张系统主要有持续应力牵张系统和周期应力牵张系统。此外还有离心力培养系统和单个细胞微观吸吮技术。前者力学指标量化困难、力学刺激不易控制。后者操作过程过于复杂，技术性要求高。因此从实用性和科学性的角度看前3类系统更有应用的价值。

2.3 力学刺激对种子细胞的影响 1893年Julius Wolff在前人研究的基础上阐述到骨组织对力学刺激具有很强的适应性。随着刺激的性质和程度的不同，其内部结构及外部形态也会发生适应性并遵循数学规律的改变。Julius Wolff定律对后人关于相关领域研究有着里程碑式的意义^[38]。后来Ilizarov发现给予组织持续温和应力刺激时会使某些组织细胞代谢活跃和返祖，再次分类及分化^[39]。随着医学的发展这两大基本定律早已应用于组织工程。目前的研究成果可以得知：力学刺激对种子细胞的增殖和分化有促进和调节作用，其机制是一个复杂而精密的过程，需要在力学微环境下表达的、高度有序的细胞因子(第一信使、第二信使^[40])参与细胞信号通路，调节基因的转录和表达^[41]，产生各种功能蛋白质调节生理进程^[42]。

2.3.1 牵张应力对于种子细胞的影响 1992年Hynes等^[43]在研究成体干细胞时证实：牵张应力是通过经典信号传导途径诱导种子细胞(成纤维细胞)增殖和分化，即细胞外基质-整合素-细胞骨架复合系统。在真核生物中细胞骨架系统包括微管、微丝、中间纤维、核基质、核纤层和细胞外基质。同样牵张应力也是通过上述传导通路最终影响间充质干细胞、肌腱干细胞、胚胎干细胞。Simmons等^[44]实验时给间充质干细胞施加0.25 Hz、3%张力后细胞的增殖减慢，但3%的牵张力可以促进其向成骨细胞分化^[45]，10%的张力则会使其向平滑肌细胞分化，复杂张力则会使细胞向成骨细胞分化^[46]。2007年有学者在研究大鼠间充质干细胞时发现^[47]：当频率为1 Hz、8%张力、持续60 min时对间充质干细胞具有最强的增殖作用。黎润光等^[48]给人间充质干细胞施以张力时发现：在48 h前12%的张力促进细胞增殖的效果更强，18%的张力则会抑制细胞的增殖，但在48 h之后随着时间的增加抑制作用会成为主要的矛盾。后来学者发现细胞内的F-肌动蛋白^[49]，在初始力学微环境下会变得十分活跃，但随着时间的延长其会失活。杨广华等^[50]在研究小鼠肌腱干细胞(图2)时发现：0.5，1，3 Hz的牵张频率对于其增殖与未受力组相比基本相同，但2 Hz却促进肌腱干细胞增殖。有研究表明在4%应变力的作用下肌腱干细胞向肌腱组织分化，当应变力8%时，肌腱干细胞既可以向肌腱组织分化又可以向脂肪组织、软骨组织及骨组织分化^[51]。Shi等^[52]通过实验发现2%的应力刺激可使其向成骨组织分化。胚胎干细胞体外培养时同样也会因张力频率及大小的不同，对增殖分化有一定的影响，在此不一一赘述。

根据目前的研究成果可以得出这样的结论：在受到一定范围的牵张应力时，牵张应力对干细胞增殖和分化的正性作用占主导，而超过这个范围则被负性作用替代，所以细胞骨架复合系统对牵张应力的变化是十分敏感的，其在应力的响应中起主要作用。牵张应力刺激越来越成为人们在组织工程领域研究的重点，从各个学者的研究成果来看，牵张应力是影响生理状态下肌肉细胞及骨细胞等受力的主导因素，进而影响细胞代谢、增殖、分化以及逆分化。

2.3.2 流体剪切应力对于种子细胞的影响 Nonaka等^[53]在2002年时给予干细胞不同性质的剪切应力，结果干细胞的形状各异，分化的组织类型也有不同。如果对胚胎干细胞施加剪切力则会影响它的造血功能^[54]。Yamamoto等^[55]研究发现流体剪切应力可以影响斑马鱼早期血管的生成。Kreke等^[56-57]研究证实在流体剪切应力系统中培养的干细胞比在静止状态下培养的干细胞分化增殖能力强。但是Kreke等^[58]根据严谨的实验结果提出流体剪切应力对于增殖无影响，但可以促进干细胞向成骨细胞分化，与很多学者的观点有出入，但仍然证明了流体剪切应力的作用。在流体剪切力的作用下特别是以1.5 Pa时干细胞的肌钙蛋白表达量增高，影响钙离子生理效果，同时流体剪切力的频率也会影响细胞内钙离子的浓度，干预细胞信号的转导影响生理进程^[59-60]。目前众多的实验结果表明，不同性质及施加不同时间的剪切应力可使干细胞向骨组织、软骨组织、平滑肌组织及其他组织转化，其将会是组织工程力学刺激中不可或缺的成员及重要的调节因素。

2.3.3 压应力对于种子细胞的影响 2013年有学者发现，在流体静水压下培养间充质干细胞与非流体静水压相比，其增殖速度明显加快^[61]。Chowdhury等^[62]发现在压应力的作用下，胚胎干细胞中的OCT3/4基因转录因子含量下降，对细胞的分化起正性作用。但到目前为止，仍然对其影响机制知之甚少。目前在压应力系统下培养细胞过程中其分化和增殖的代谢废物容易潴留，会影响培养基的pH值、离子浓度等，对研究结果造成很大的误差，这将是应用此系统时要着力解决的难题。

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引言

材料方法

1.1 文献检索和筛选要求

1.1.1 检索数据库

科学数据库：美国《医学索引》(Medline)、中国期刊全文数据库。

临床试验数据库：科克伦对照试验注册中心(CENTRAL)、临床试验注册资料库(Clinical Trials.gov)。

系统评价数据库：科克伦(Cochrane)图书馆。

专业数据库：诊断测试索引数据库(MEDION)、骨关节登记数据库。

1.1.2 检索数据库的选择理由 上述数据库更准确和全面的收录了与实验课题相关的文献，使综述的内容更具说服力和参考价值。

1.1.3 检索途径、检索词及各检索词的逻辑关系 为全面、准确地检索出撰写该综述的相关文献，文章写作过程中综合考虑了检索途径、检索词的选择和各检索词间逻辑关系的配置，制定了科学的检索策略。

检索途径：主题词检索。

检索词：组织工程(tissue engineering)；肌腱(tendon)；肌腱干细胞(tendon stem cell)、力学刺激(mechanical stimulation)；种子细胞(seeding cells)。

检索词的逻辑组配：“组织工程”AND“力学刺激”AND“种子细胞”“肌腱干细胞”OR“力学刺激”；“力学刺激”OR“种子细胞”AND“肌腱”。

检索途径、检索词、检索词的逻辑组配的确定理由：使用分类检索途径、检索词和逻辑关系缩小了检索范围，使检索的文献目的性更强、精度更高。“肌腱干细胞”OR“力学刺激”，“力学刺激”OR“种子细胞”AND“肌腱”的逻辑组配，避免相关文献的遗漏，使文章更全面地反映研究的问题。

检索的时间范围：2005年1月至2015年12月。

1.2 文献筛选流程和筛选标准

文献筛选流程：按照图1的步骤进行。

文献的筛选标准：①各研究假设和研究方法相似。②有肌腱相关研究开展。③各研究对模型数量有明确规定。④文献期刊必须是国家核心期刊和科技核心期刊。⑤近5年的文献优先入选。

文献的筛选标准的制定理由：①实验具有参照。②其相关研究结果具有可信性。③实验标准明确。④综述内容新颖可信度高。

排除的文献：①重复报告。②存在研究设计缺陷，质量差。③数据不完整、结局效应不明确。④统计方法错误且无法修正。

排除理由：①提高文献收集质量。②使综述结果具有可信性。③使文献具有参考价值。

筛选偏离的描述、原因及对结果的影响：在筛选过程中将是否有体外力学培养系统装置专利的相关研究团队纳入筛选标准，但在文献搜索的过程中发现文献选择偏离了轨道。因为拥有该专利的团队毕竟是少数，关注的重点不尽相同，影响文献收集的基数，因此将其去除。

文献筛选结果的输出形式：文献检索和筛选结果的输出采用文献的引用形式，且保持了格式的一致性，文献的引用形式包括作者、题名、期刊名称、发表年代、卷数(期数)、页码等。

检索偏离的描述、原因及对结果的影响：在检索的过程中搜索到相关细胞因子对于肌腱修复的作用，影响了检索的速度。其次组织工程是一个大的课题，不仅仅有人工组织肌腱，还包括许多其他的人体器官，在检索的过程中增加了工作量。

机械因素对组织工程干细胞增殖和分化的影响

Effects of mechanical factors on proliferation and differentiation of tissue- engineered stem cells

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