新型输尿管支架材料的生物相容性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.25.012

摘要/Abstract

摘要：

背景：有研究表明，聚乙烯高分子合成的输尿管支架在体内实验中具有良好的生物相容性，但实验发现其毒副作用，诱导机体产生的炎症、热原、过敏反应均较明显，故对于新研发的L-乳酸、乙交酯、硫酸钡合成的新型输尿管支架在生物相容性、毒副作用、机体炎症反应等方面的探索是实验研究的重点内容。
目的：通过对临床上使用的聚乙烯高分子合成输尿管支架和L-乳酸、乙交酯、硫酸钡合成的新型输尿管支架在细胞毒性试验、动物体植入后引起的炎症反应以及过敏反应、热原反应、致死率等生物相容性方面的比较，为临床上引入新型输尿管支架材料提供一定的参考依据。
方法：实验分为3组，空白对照组不作任何处理，使用正常培养基培养；新型材料组细胞采用L-乳酸、乙交酯、硫酸钡合成材料浸提液进行培养；聚乙烯组细胞采用聚乙烯浸提液进行培养。
结果与结论：活细胞数目检测结果显示，在尿道上皮细胞培养皿中加入两种输尿管支架浸提液后，与空白对照组相比，毒性反应均明显增强(P < 0.05)，但两组毒性差异无显著性意义。苏木精-伊红染色结果显示，将两种材料植入大鼠体内2，6周后，肌肉组织均有明显的炎性浸润、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞增加，但植入新型材料组的炎性浸润和组织损伤明显少于植入聚乙烯组(P < 0.05)。酶联免疫吸附试验结果显示，植入两种材料6周后，大鼠血清中炎性因子白细胞介素10，23的含量均明显增高(P < 0.05)，但植入新型材料组的炎性因子表达量明显低于植入聚乙烯组(P < 0.05)。支架植入6周后，新型材料组的大鼠在实验过程中出现过敏反应和热原反应的数量均少于聚乙烯组。结果证实，L-乳酸、乙交酯、硫酸钡合成的新型输尿管支架材料能减少组织对于材料的炎症反应、过敏反应、热原反应，具有比聚乙烯合成材料更好的生物相容性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, 材料相容性, 输尿管支架, L-乳酸、乙交酯、硫酸钡合成材料, 聚乙烯合成材料, 生物相容性, 毒副作用, 细胞增殖率, 炎性因子, 过敏反应, 热原反应, 组织损伤

Abstract:

BACKGROUND: Studies have shown that polyethylene polymer-synthesized ureteral stents have good biocompatibility in vivo, but the side effects are found to induce the body to produce inflammatory, pyrogenic, and allergic reactions. Therefore, studies have mainly aimed to explore the biocompatibility, toxic and side effects, inflammation of newly developed ureteral stents synthesized by L-lactic acid, glycolide, and barium sulfate.
OBJECTIVE: Based on the biocompatibility comparisons on cell toxicity test, inflammatory reaction, allergic reaction, pyrogen reaction and mortality after implantation between the usage of polyethylene material and L-lactic acid, glycolide, barium sulphate syntheses, to provide a better reference to introduce a new clinical ureteral stent material.
METHODS: There were three groups in the experiment: blank control group, new material group, polyethylene group. Cells were cultured in normal medium, leach liquid of L-lactic acid, glycolide, barium sulphate syntheses and leach liquid of polyethylene, respectively.
RESULTS AND CONCLUSION: The toxic effects were significantly enhanced in the urethral epithelial cells that grew in the leach liquids of two materials compared with the blank control group (P < 0.05), but the two kinds of materials had no significant statistical difference in the toxicity test (P > 0.05). Hematoxylin-eosin staining results showed that there were obvious inflammatory infiltrations in muscle tissue and the number of neutrophils and eosinophils were increased when the two kinds of materials were implanted in the rats for 2 and 6 weeks (P < 0.05), but the inflammatory infiltration and tissue damage in the new material group was less than that in the polyethylene group (P < 0.05). ELISA results showed that the serum concentrations of interleukin-10 and interleukin-23 were significantly increased when the two kinds of materials were implanted in the rats for 6 weeks (P < 0.05), but the content of inflammatory cytokines in the new material group was less than that in the polyethylene group (P < 0.05). In the new material group, there was only one rat that developed allergic reaction and there was no pyrogen reaction or death; however, in the polyethylene group, there were three rats with presence of allergic reaction and one rat with pyrogen reaction but no death. These findings indicate that the new ureteral stent material synthesized with L-lactic acid, glycolide and barium sulphate can reduce inflammation reactions, allergic reactions and pyrogen reactions to the body, and has better biocompatibility than polyethylene composite material.

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Key words: Tissue Engineering, Biocompatible Materials, Ureter, Stents

中图分类号:

R318

刘敏，颜伟，李慧峰，朱同玉. 新型输尿管支架材料的生物相容性[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(25): 3996-4001.

Liu Min, Yan Wei, Li Hui-feng, Zhu Tong-yu. Liu Min, Master, Associate chief physician, Department of Urology, Qingpu Branch of Zhongshan Hospital Affiliated to Fudan University, Shanghai 201700, China[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(25): 3996-4001.

图/表（结果） 4

2.1 两种输尿管支架的细胞毒性 CCK8实验结果显示，在尿道上皮细胞培养皿中加入两种输尿管支架浸提液后，与空白对照组相比，吸光度明显下降(P < 0.05)，根据材料毒性评分标准，两者毒性反应均明显增强(P < 0.05)，但仍符合合格材料的标准。两种材料的毒性差异无显著性意义(P > 0.05)，见表1-3。

2.2 输尿管支架植入后大鼠膀胱平滑肌组织内炎性浸润和组织损伤情况由苏木精-伊红染色结果可知，将两种材料植入大鼠体内2，6周后，膀胱平滑肌组织均有明显的炎性浸润、炎性细胞，中性粒细胞和嗜酸性粒细胞均明显增加，见图2。
空白对照组、聚乙烯植入组、新型材料植入组炎性浸润面积分别为(12.26±1.25)，(38.64±3.96)，(26.32± 2.53) μm2，3组间比较差异有显著性意义(P < 0.05)，平滑肌组织形态不完整，有融合现象，但植入新型材料组的炎性浸润和组织损伤明显少于植入聚乙烯组且平滑肌组织形态完整。

2.3 输尿管支架植入后大鼠血清中炎性因子的表达由ELISA实验结果可知，植入两种材料6周后，大鼠血清中炎性因子白细胞介素10，23的水平明显增高，但植入新型材料组的炎性因子表达量明显低于植入聚乙烯组(P < 0.05)，见表4。

2.4 植入两种输尿管材料6周后大鼠过敏反应、热原反应及死亡情况的比较由实验统计可得，植入新型材料组的大鼠在实验过程中仅有1只发生过敏反应，未发生热原反应、无大鼠死亡情况；而植入聚乙烯组的大鼠在实验过程中有3只出现过敏反应、1只大鼠出现热原反应、无动物死亡情况发生。
支架植入6周后，新型材料组的大鼠在实验过程中出现过敏反应和热原反应的数量均少于聚乙烯组(P < 0.05)，见表5。

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引言

输尿管支架的临床应用已经有多年的历史，它的植入可以缓解输尿管梗阻和输尿管阴道漏，20世纪80年代，临床上主要应用橡胶作为输尿管支架的主要材料，但有研究表明，橡胶类的输尿管支架会导致严重的尿道狭窄^[1-3]。于是，较柔软、无异味、硬度高、半透明，在体内不易发生降解等化学变化的材料聚乙烯作为人工高分子合成聚合物的代表被引入了输尿管支架的临床应用，但有研究表明，其毒副作用较大，生物相容性一般、且诱导机体产生的炎症、热原、过敏反应均较明显^[4-7]，所以研制新型的具有良好生物相容性、低毒副作用的材料成为需要实验探究的问题。
L-乳酸是以玉米淀粉为原料，经过生物发酵精制而成的一种有机酸，为无色澄清黏性液体，水溶液显酸性反应，因其左旋的特征，具有很好的生物相融性，能与哺乳动物相融，可直接参与人体代谢并且无任何不良反应^[8-10]。乙交酯是一种聚合单体，临床上作为生物降解的高分子材料中的一类，广泛应用于手术缝合线、药物控制释放、组织工程等许多领域[^11-13]。硫酸钡作为临床上一种常用的对比剂，有利于医生对体内输尿管支架的降解进行监测。L-乳酸、乙交酯及硫酸钡三者的合成物应该具有各自材料的优势性能，例如良好的组织相容性、生物可降解性、体内作用可监测性，它很有可能是一种新型的、具有良好生物相容性的输尿管支架材料^[14-15]。
实验通过对聚乙烯高分子合成输尿管支架和L-乳酸、乙交酯、硫酸钡合成的新型输尿管支架在细胞毒性试验、动物体植入后引起的炎症反应以及过敏反应、热原反应、致死率等生物相容性方面的比较，为临床上引入新型输尿管支架材料提供一定的参考依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

设计：随机对照动物实验。
时间及地点：于2014年1月至2015年1月在复旦大学药学院实验动物中心完成。
材料：
实验动物：健康7周龄SD大鼠30只，雌雄各半，体质量200-280 g，购于上海邦耀生物科技有限公司，动物许可证号：SCXK(沪)2014-0011。
输尿管支架：聚乙烯高分子合成输尿管支架(型号：双J Fr8，由J型管、导丝、推进器和夹子组成)、L-乳酸、乙交酯、硫酸钡合成的新型输尿管支架(型号：双J Fr4.8，由J型管、导丝、推进器和夹子组成)均由美国泰利福医疗器械公司购置(图1)。

输尿管支架材料学实验相关仪器及试剂：
仪器及试剂	来源
CCK8，ELISA试剂盒	上海博谷生物科技有限公司
苏木精伊红苏木精-伊红染色试剂盒	碧云天生物技术研究所
人尿道上皮细胞，M199培养基	上海复蒙基因生物科技有限公司

实验方法：
浸提液的制备：将两种输尿管合成材料各减下30 mm长度，用PBS冲洗3次，放入紫外操作台中照射6 h；置于60 mm培养皿中，加入2 mL培养基M199，于体积分数5%CO₂、37 ℃的培养箱中培养24 h，获得浸提液。
分组及处理：实验分为3组，空白对照组在细胞实验中使用正常M199培养基；聚乙烯组在细胞实验中使用含有聚乙烯浸提液的M199培养基；新型材料组在细胞实验中使用含有新型材料(L-乳酸、乙交酯、硫酸钡合成新型材料)浸提液的M199培养基，每组10只。
空白对照组在动物实验中不埋植输尿管装置；聚乙烯组在动物实验中埋植3 cm聚乙烯合成输尿管于大鼠膀胱平滑肌组织内；新型材料组在动物实验中埋植3 cm新型合成输尿管于大鼠膀胱平滑肌组织内。于6周后麻醉断颈处死大鼠。

CCK8进行细胞毒性检测：人尿道上皮细胞以 3.5×10⁵ L^-1的细胞浓度铺于96孔板上，加入获取的浸提液(每孔加入200 μL)分别培养12，24，48，72，144 h之后，在96孔板中加入CCK8溶液各20 μL，继续放入培养箱中培养3 h后终止，在酶标仪450 nm处读取各孔的吸光度。计算细胞的相对增殖率绝对值︱RGR︱=︱实验组吸光度-空白组吸光度︱/空白组吸光度×100%^[16-17]。

材料毒性评分标准^[18]：
︱RGR︱(%)	毒性分级
100及以上	0级(合格)
75-99	1级(合格)
50-74	2级(有待进一步分析)
25-49	3级(不合格)
1-24	4级(不合格)

苏木精-伊红染色观察炎性浸润和平滑肌组织损伤情况：取大鼠肌肉组织做冰冻切片，切片后在室温干燥 10 min，于37 ℃烘箱烤片90 min，切片放入苏木精中浸泡3 min，自来水冲洗1 min，用1%盐酸酒精分化30 s，自来水冲洗2 min，镜下观察是否着色；体积分数1%十二水磷酸氢二钠溶液返蓝1 s，自来水冲洗2 min，伊红着色30 s，浸入体积分数80%无水乙醇2 min，体积分数95%无水乙醇Ⅰ中2 min，体积分数95%无水乙醇Ⅱ中2 min，体积分数100%无水乙醇Ⅰ中2 min，体积分数100%无水乙醇Ⅱ中 2 min，最后浸入二甲苯中4 min，稍吹干后滴加中性树胶封固，镜下观察，通过200倍视野下，划定出炎性浸润区域所占的面积^[7]。
ELISA检测血清中炎性因子的表达：将不同浓度的标准品各0.1 mL依次加入一排7孔中，加入稀释的待检测样品0.1 mL，置于37 ℃孵育90 min，甩去酶标板中的液体。将准备好的抗体工作液按每孔0.1 mL依次加入，置于 37 ℃孵育60 min，用PBS洗涤3次，每次浸泡1 min左右；将准备好的ABC工作液按每孔0.1 mL依次加入，置于 37 ℃孵育30 min，用PBS洗涤5次，每次浸泡1 min左右；按每孔90 μL依次加入TMB显色液，置于37 ℃避光反应15-20 min；按每孔100 μL依次加入TMB终止液，此时蓝色立刻转为黄色，用酶标仪在450 nm处测定吸光度^[18-20]。
主要观察指标：各组吸光度值(A450 nm)、细胞相对增殖率、炎性细胞的浸润情况和炎性因子白细胞介素10，23水平。
统计学分析：计量资料以x±s表示，采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析，组间数据差异的采用t 检验，以P < 0.05表示差异有显著性意义。

讨论

关于输尿管支架生物材料的研究都在探讨如何能提高输尿管支架材料的生物相容性以减少对人体的伤害。临床上输尿管支架的应用很广泛，这是因为输尿管支架能保证尿液从肾脏排到膀胱和引流梗阻；支架逐渐地扩张输尿管，也使输尿管镜检查术和其他内窥镜下的外科操作更加容易；大的结石被打碎，支架可以防止大量的结石碎片涌入输尿管。支架使碎片缓慢通过，可更有效且能避免阻塞；支架还能防止大的肾盂结石排入输尿管，这是冲击波碎石的一个重要因素，因为冲击波能更容易打碎肾盂结石，但是它也有很多缺点，例如阻塞、纽结、移动和感染^[21-23]。
聚乙烯作为人工高分子合成聚合物的代表被引入了输尿管支架的临床应用，但研究表明，其毒副作用较大，生物相容性一般、且诱导机体产生的炎症、热原、过敏反应均较明显^[24-26]。L-乳酸是以玉米淀粉为原料，具有很好的生物相融性，可直接参与人体代谢并且无任何不良反应；乙交酯是一种可以生物降解的高分子材料，广泛应用于医疗设备中；硫酸钡是临床上一种常用的对比剂。有报道表明，3者所合成的新型输尿管支架应具有良好降解性能、稳定、刺激性小、且具有可追踪性^[27-30]。
实验结果显示，在尿道上皮细胞培养皿中加入两种输尿管支架浸提液后，与空白对照组相比，毒性反应均明显增强，两种材料在毒性试验中无显著差异，说明新型材料毒性不比聚乙烯材料高，为进入临床应用提供一定参考；苏木精-伊红染色结果显示；将两种材料植入大鼠膀胱平滑肌组织内2；植入6周后，平滑肌组织均有明显的炎性浸润、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞增加，但植入新型材料组的炎性浸润和组织损伤明显少于植入聚乙烯组，说明植入新型材料对组织的炎症反应较小，有良好的组织相容性。
白细胞介素10抑制单核巨噬细胞释放炎症递质，可增强抗炎性因子释放，抑制单核巨噬细胞的抗原递呈作用，在炎症反应中起到了重要的调控作用^[31-40]；白细胞介素23可作用于活化T细胞、记忆性T细胞和树突状细胞，产生干扰素γ和白细胞介素12等细胞因子，对自身免疫反应性疾病有重要作用，两种炎性因子都是炎症通路的重要分子。ELISA结果显示，植入两种材料6周后，大鼠血清中炎性因子白细胞介素10，23的水平明显增高，但植入新型材料组的炎性因子表达量明显低于植入聚乙烯组，也说明新型材料的植入对诱导机体产生的炎症反应较轻，使患者有良好的顺应性；植入新型材料组的大鼠在实验过程中仅有1只发生过敏反应、无热原反应、无死亡情况，而植入聚乙烯组的大鼠在实验过程中有3只出现过敏反应、1只出现热原反应、无死亡情况，充分说明植入新型材料在安全性、生物相容性等方面具有比聚乙烯更突出的优势。
文章研究结果表明，L-乳酸、乙交酯、硫酸钡合成的新型输尿管支架材料没有毒性的增加，还能减少组织对于材料的炎症反应、过敏反应、热原反应，具有比聚乙烯合成材料更好的生物相容性。

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