镍钛合金听泡植入对豚鼠耳蜗及听功能的毒性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.21.018

摘要/Abstract

摘要：

背景：镍钛合金多作为自膨胀支架和封堵器的材料应用已很成熟，但镍钛合金作为听骨链重建材料的相关研究及临床应用至今少有报道。
目的：观察镍钛合金植入体在豚鼠听泡中的耳毒性。
方法：健康听敏纯白红目豚鼠50只，每只豚鼠其中一侧耳为镍钛合金植入组，其中25只对侧耳为钛植入组，另25只对侧耳为空白植入组。分别于植入后7，14，28，56，112 d随机处死含钛植入组和空白植入组的豚鼠各5只，对各组行近中轴位耳蜗石蜡切片苏木精-伊红染色观察耳蜗组织的形态变化，行耳蜗毛细胞核丫啶橙-碘化丙啶双重荧光染色观察毛细胞凋亡和缺失情况，行耳蜗基底膜扫描电镜观察毛细胞纤毛排列情况，透射电镜观察毛细胞细胞器形态，对各组的豚鼠植入前、不同时间点处死前均行听性脑干反应及畸变反应耳声发射检测。
结果与结论：各组植入后各时间点耳蜗组织形态无明显变化，未发现耳蜗毛细胞发生凋亡，基底膜耳蜗毛细胞纤毛排列整齐，外耳蜗毛细胞的细胞器未见明显异常。植入前及植入后7，14，28，56，112 d听性脑干反应阈值差异无显著性意义，且畸变反应耳声发射检测通过率均为100%。结果证实，镍钛合金听泡植入对豚鼠耳蜗形态及听功能无明显影响，提示镍钛合金无明显耳毒性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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关键词: 生物材料, 材料相容性, 镍钛合金, 耳毒性, 豚鼠, 听泡

Abstract:

BACKGROUND: As a self-expanding stent and occlude, nitinol has become very mature, but it has been rarely reported as a ossicular chain reconstruction material.
OBJECTIVE: To explore the ototoxicity of nitinol after implanted into the acoustic vesicle of guinea pigs.
METHODS: Fifty healthy guinea pigs with acute hearing were used in this study. One ear of each guinea pig was enrolled into the experimental group randomly, and the other ear of the guinea pigs was divided into control group I (titanium implantation group, 25 ears) and control group II (opened acoustic vesicle without implanting, 25 ears) equally. Five guinea pigs included in control I and control II groups were executed at days 7, 14, 28, 56, 112 after implantation randomly and respectively. The morphological observation to cochlea was carried by hematoxylin- eosin staining of cochlear slices. The apoptosis and deletion of hair cells were observed by acridine orange/propidium iodide fluorescent staining. The stereocilium arrangement was examined with scanning electron microscope. And the hair cell’s organelle was observed by transmission electron microscope. The auditory function was evaluated by auditory brainstem response and distortion otoacoustic emission response at pre-implantation and pre-execute.
RESULTS AND CONCLUSION: Hematoxylin-eosin staining showed that there was no obvious change or morphological variation in the cochlear tissues and cells after nitinol and titanium implantation into the acoustic vesicle. No hair cell apoptosis was observed by acridine orange/propidium iodide fluorescent staining. The scanning electron microscopy showed that stereocilias were arranged normally. No abnormal changes in the stereocilia and the organella of hair cells were observed by transmission electron microscopy. There was no significant difference between auditory brainstem response threshold before and at days 7, 14, 28, 56 and 112 after implantation. Meanwhile, the through rate of distortion otoacoustic emission response was 100% in each group. These findings indicate that no significant influence on cochlear morphology and auditory function is found, suggesting no ototoxicity of the nitinol implantation into the acoustic vesicle of guinea pigs.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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Key words: biocompatible materials, otitis media, alloys, ossicular replacement, toxic actions

中图分类号:

R318

张媛媛，肖自安，李秀国. 镍钛合金听泡植入对豚鼠耳蜗及听功能的毒性[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(21): 3380-3385.

Zhang Yuan-yuan, Xiao Zi-an, Li Xiu-guo. Ototoxicity of nitinol implantation into the acoustic vesicle of guinea pigs[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(21): 3380-3385.

图/表（结果） 4

2.1 实验动物数量分析 实验过程中由于死亡和中耳感染共脱失4只豚鼠，均补足数量至50只，最终50只豚鼠进入结果分析。

2.2 镍钛合金听泡植入后豚鼠耳蜗组织形态 苏木精-伊红染色光镜下观察显示，植入后112 d，Ti植入组耳蜗各回Cortis器结构完整，染色均匀，内外毛细胞形态无明显异常；螺旋神经节细胞核较大，胞浆丰富、均质，细胞形态均一，呈圆形或多角形，细胞数目多，排列紧密，细胞间质少，神经纤维分布均匀，排列规则；血管纹和螺旋韧带形态正常，结构清楚，显色均匀。见图1。

耳蜗毛细胞丫啶橙-碘化丙啶荧光染色观察显示，植入后112 d，各组各回基底膜3排外毛细胞和1排内毛细胞清晰可见，排列整齐，显绿色荧光，极少量外毛细胞缺失，毛细胞的核均未见明显呈凋亡改变的橙色荧光，见图2。

耳蜗基底膜扫描电镜观察显示，植入后112 d，各组植入后各时间点耳蜗螺旋器顶、中、底回内外毛细胞纤毛显示清楚，形态正常，排列整齐，外毛细胞的静纤毛呈“V”型，内毛细胞静纤毛略呈弓形，无明显纤毛倒伏、断裂，极少量内毛细胞纤毛紊乱，倒伏，极少量最外排外毛细胞纤毛缺失。见图3A。透射电镜观察显示，植入后112 d，各组耳蜗毛细胞静纤毛结构清楚，表皮板厚度均匀一致，细胞器结构正常。细胞核无肿胀，染色质分布均匀，细胞器形态正常。见图3B。

2.3 豚鼠镍钛合金听泡植入前及植入后ABR阈值比较 结果Ti植入组及空白植入组各时间点16 kHz短纯音ABR阈值均在23-35 dB SPL之间。植入前后ABR波形典型，重复性好。

NiTi植入组、Ti植入组及空白植入组，同一组内植入后各时间点ABR阈值与植入前比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见表1。

2.4 豚鼠镍钛合金听泡植入前及植入后DPOAE比较 DPOAE测试结果显示，在L₁/L₂为65/55 dB SPL时，f₂从0.75，1，2，3，4，6，8 kHz各测试频率点的DPOAE的检出率为100%，且反应幅值大。

结果说明，植入前及植入后7，14，28，56，112 d畸变反应耳声发射检测通过率均为100%。

2.5 镍钛合金听泡植入后生物相容性及不良反应分析 实验结果发现NiTi及Ti植入体表面均有新生骨骼样组织生长，呈纤维状物与听泡壁及听小骨相连，周围无明显肉芽组织，植入材料表面无蚀斑和颜色改变，有新生骨骼样组织形成，从植入后7 d的植入材料表面零星点状或条索状，逐渐增多交织成网状，到植入后112 d时形成板状，能谱分析证实为骨组织。植入物周围纤维包膜或新生骨的形成常被认为是材料与组织之间的理想反应，是提示材料生物相容性良好的一个指标。NiTi表面成骨反应性能良好，在听泡中有很好的生物相容性^[3]。植入后7，14，28，56，112 d豚鼠无明显不良反应发生。

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引言

慢性中耳炎性疾病患者的听力下降主要原因为听骨链连续性的中断。理想的听骨链重建材料应具备使用方便、易于获得、良好的传声性能和良好的生物相容性4大特点，用合适的材料进行听骨链重建是鼓室成形成的关键部分。Wullstein在1952年应用异质材料进行听骨链重建，他将聚乙烯丙烯酸共聚物小柱放置于活动的镫骨足板和鼓膜移植物之间，试图重建听力传导，但排异率极高。之后耳科医生多采用自体听骨或乳突骨皮质进行听骨链重建，但是由于自体移植物易与周围的组织骨化连接，手术的远期效果不甚理想，特别是经常伴有胆脂瘤的复发。
近年来，多种不同材质的听骨假体材料相继问世，其中以生物陶瓷、高分子聚乙烯、钛合金最为常用，其中尤以钛质听骨更为广大的耳科医生所认同。镍钛形状记忆合金由于具有独特的形状记忆效应超弹性和耐腐蚀性密度接近人体组织被广泛应用于整形外科口腔科和心血管介入科。镍钛合金是近年来发展起来的新型复合记忆合金材料，具有质量轻、生物组织相容性好、弹性系数近似骨质、生物体内稳定、与CT和MRI等影像学检查无冲突等诸多优点^[1] 。然而，听力提高不理想，人工听骨脱位、脱出以及不能满足患者复杂多变的鼓室情况等问题依然普遍。耳科学家和材料学家在屡次的失败中进行不断探索和积累经验，筛选着更为理想的听力重建材料。多种人工听骨的相继问世为需要听骨链重建的患者提供了更多的选择，也为耳科医生带来了挑战，选择合适的听骨假体对于听骨链的成功重建可谓至关重要^[2] 。
随着医学材料学的发展，具有良好的生物相容性及传音性的新型生物材料越来越多地应用于听骨链重建手术中去。目前临床上可应用于听骨链重建的材料种类较多，新型材料也不断产生。除植入材料本身优良的物理性能外，如何进一步方便操作、最大程度降低或减少耳毒性也是筛选植入材料的首要考虑因素。医用镍钛形状记忆合金(Nitinol，NiTi)是一种易处理、易保存、生物性能稳定、生物相容性好的新型智能生物材料，利用其形状记忆特性，可以制成特殊形状的环抱器或固定装置，便于手术安装或操作^[3] 。有些研究结果也表明镍钛合金应用于听力重建可以取得较好的临床效果，说明其声传导性能优越^[4] 。课题组前期研究已经证实NiTi在豚鼠听泡很好的生物相容性，但有微量的Ni释放^[5] 。文章将重点探讨镍钛合金听泡植入对豚鼠可能造成的耳毒性。

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材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：于2008年10月至2009年4月在中南大学耳科研究所完成。

材料：

实验动物：选择中南大学实验动物中心提供的健康、听觉灵敏的纯白红目豚鼠50只，体质量150-200 g，SPF级饲养。

NiTi：原子比Ni 52%，Ti 48%。由中南大学材料学院李周教授提供，对照材料纯钛(Ti)购自宁波慈北医疗器械有限公司。植入前dH₂O清洗15 min 3次，dH₂O浸泡24 h，环氧乙烷消毒。

主要溶液： ①体积分数10%EDTA-Na₂溶液：将EDTA-Na₂ 20 g溶于200 mL蒸馏水中，加热，搅拌，至完全溶解，加NaOH调pH值为7.6，室温下保存。②10 mol/L碘化丙啶(propidium iodide，PI)液：PI原粉10 mg加蒸馏水10 mL，调pH值为6.8，充分溶解后贮于棕色玻璃瓶中，置冷暗处保存。③100 mol/L吖啶橙(acridine orange，AO)液：吖啶橙原粉100 mg，加0.01 mol/L PBS 10 mL，调pH值为6.8，充分溶解后贮于棕色玻璃瓶中，置冷暗处保存。

方法：

分组及干预：将50只豚鼠共100只耳随机分为3组，NiTi植入组：豚鼠用体积分数1%戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔注射全身麻醉后，耳郭根部皮肤切口，打开听泡，将NiTi用肌膜部分包裹后埋植于听骨链处，共50耳。Ti植入组：同法在听泡埋植Ti，共25耳。空白植入组：打开听泡，不埋植材料，共25耳。植入后肌注青霉素，分别在植入后7，14，28，56，112 d随机处死含Ti植入组和空白植入组的豚鼠，每个时间点NiTi植入组10耳，Ti植入组和空白植入组各5耳。所有豚鼠分别于手术前及处死前双耳行脑干听觉诱发电位(auditroy brain stem，ABR)和畸变产物耳声发射(distortion product otoacoustic emission，DPOAE)测试。

ABR测试：ABR测试前准确称质量，用体积分数1%戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔注射麻醉后，于隔音电屏蔽中(隔音室本底噪声为30 dB SPL)，采用KeyPoint ABR测试系统进行测试。采用银针型电极，记录电极置于豚鼠颅顶外耳道连线与颅顶正中线交叉处皮下，参考电极置于给声侧乳突皮下，地极置于鼻尖部皮下。各电极刺入皮下约8 mm。给声耳机置于自制ABR动物测量架上，距测试耳外耳道口约15 mm。采用短纯音(tone pip)16 kHz刺激，扫描时间 10 ms，刺激重复率10 Hz，叠加1 000次，带通滤波范围100-3 000 Hz。刺激强度从90 dB SPL开始，自高向低强度进行5 dB SPL递减，以恰能引出重复性好的Ⅲ波的最小声压级为听反应阈。

DPOAE测试：DPOAE测试前采用消毒过的婴儿探头放在外耳道口并保持密闭，测试在屏蔽隔声室内进行，环境噪声≤25 dB SPL。取f₂为0.75，1，2，3，4，6，8 kHz作为测试和分析频率，f₂/f₁=1.22，初始音强度为L₁=65 dB SPL，L₂=55 dB SPL。DPOAE的幅值大于本地噪声6 dB SPL作为测出反应的判断标准。

耳蜗组织形态学观察：体积分数1%戊巴比妥钠 (40 mg/kg)腹腔注射全身麻醉，取仰卧位固定，打开胸腔暴露心脏，剪开右心耳，依次用生理盐水，注入40 g/L多聚甲醛PBS固定液(0.1 mol/L，pH 7.4)经左心室进行半身灌注处死，快速取出听泡。于解剖显微镜下用细针挑去听骨及鼓膜，蜗尖钻孔，开放圆窗和卵圆窗，再以40 g/L多聚甲醛PBS固定液从两窗和蜗尖灌流5次，最后将标本置于同种固定液中4 ℃冰箱过夜。第2天取出标本，0.1 mol/L pH 7.4 PBS反复冲洗，置于体积分数10% EDTA-Na₂溶液中脱钙，每天更换脱液，连续7-10 d至充分脱钙为止。制作石蜡切片，行苏木精-伊红染色。取基底膜行扫描电镜及透射电镜观察。豚鼠深度麻醉后快速断头取听泡，行耳蜗从蜗尖和两窗反复灌入预先配置好的丫啶橙-碘化丙啶染液，取基底膜在荧光显微镜下观察。

主要观察指标：ABR和DPOAE测试评价豚鼠植入前及处死前的听力状况。耳蜗石蜡切片苏木精-伊红染色光学显微镜下观察耳蜗组织的形态，耳蜗毛细胞核丫啶橙-碘化丙啶荧光染色观察毛细胞凋亡和缺失情况；行耳蜗基底膜扫描电镜，观察毛细胞纤毛排列情况；透射电镜观察毛细胞细胞器形态。

统计学分析：计量资料以x(_)±s表示，采用SPSS 16.0 for Windows统计学软件进行数据处理。组间均属差异的比较采用两样本t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

目前临床上进行听力重建常用的听骨赝复物可分为：自体材料、异体材料及人工合成材料3种^[6-7] 。自体材料具有较好的生物相容性和声导性，但自体听骨加工塑形困难、残留微小病灶易致植入后感染或发生粘连影响传音效果。异体材料也具有良好的生物相容性，植入前可雕刻成不同的形状，但由于贮存条件要求较高、伦理学问题等因素亦限制了其应用。人工合成材料如多孔高分子聚乙烯的显著优点是质轻且多孔，适合组织长入，但不稳定性、易脱位；羟基磷灰石生物相容性和组织亲合性好，质地硬，能很好地传递振动能量；但是质量大，易碎，手术时修剪困难，且易脱位^[8] ；钛质人工听骨有生物相容性和组织亲合性佳、耐久性好、重量轻、可塑性强、不易脱位等优点^[9] 。
听骨赝复物材料在保证这些优点的前提下，如何进一步方便操作、使其手术固定更简化，最大程度降低或减少耳毒性，也是选择听骨赝复物制作材料需要考虑的首要内容。目前临床上已有钛合金的听骨材料的应用。NiTi作为一种集感知和驱动为一体的新型功能材料，具有许多优点，例如强度高、比重低、抗疲劳性能佳、形状记忆效能、超弹性及生物相容性好等^[10-11] 。并且，研究已经证明了应用NiTi形状记忆功能可以制成特殊形状的环抱器或固定装置，便于手术安装或操作^[12] 。用于制作听骨赝复物有其独特的优点，能够取得良好的听力重建效果^[13-14] ，这也是镍钛合金比钛合金具有的优势。豚鼠听觉发达，能识别多种多频率的声音，而且豚鼠的听泡结构包括耳蜗及听骨链链接与人类的中耳及内耳均有相似之处，豚鼠是耳科动物实验的首选^[15] 。
医用NiTi由近等原子比的镍元素(Ni)和钛元素(Ti)组成。Ti对人体是非必需的，也是无害的。Ti不会显著激活或抑制引发毒性反应的各种酶，大量研究均未发现Ti对组织和细胞的毒性^[16] 。Ni虽然是人体必需的营养元素，但缺乏和过量都会导致疾病^[17] 。过量Ni具有细胞生物学毒性，生殖毒性、致癌性。镍化合物的急慢性毒性研究表明，Ni对机体的一般毒性不具有器官特异性，主要与接触和排泄门户有关，譬如羰基镍化合物毒性可表现为对肺脏的损害，长期慢性高Ni状态对肾脏有损害^[18] 。
课题组前期研究已发现NiTi植入体周围无明显炎性反应，植入后7 d NiTi表面出现零星的新生骨骼样组织，随着时间延长，表面新生骨呈网状，最后呈薄板状，与Ti表面的新生骨骼样组织在生长模式和丰度基本相同。植入的NiTi和Ti材料表面在植入112 d后仍未见腐蚀斑点，无明显颜色变化，说明无明显的生物退变性。NiTi表面新生骨组织含有极微量镍(Ni)及钛(Ti)，可能由于实验采用的NiTi未通过表面特殊处理造成的，这一结果也与文献报道的金属植入体在接触的人体组织中可能有金属离子溶出相吻合^[3] 。但生物材料学家发现对NiTi进行表面处理，如在NiTi表面形成致密稳定的氧化物TiO₂，或表面镀膜，可以抑制或减少Ni的释放^[19] 。Ni是动物必须的元素，但能够通过消耗谷胱甘肽、与蛋白质巯基结合、产生活性氧和一氧化氮可以产生毒性，导致神经退化^[20]。
细胞形态学观察是评价细胞毒性的方法之一^[21] 。本次实验的结果表明NiTi植入组、Ti植入对照组和空白植入对照组在手植入后7-112 d耳蜗各回Cortis器结构和内、外毛细胞形态正常，螺旋神经节细胞形态和神经纤维的分布也无明显改变，血管纹和螺旋韧带形态正常。耳蜗基底膜扫描电镜观察内外毛细胞静纤毛排列情况，发现纤毛排列整齐，各组均表现为极少量第一排外毛细胞纤毛缺失，考虑为标本制备过程中撕扯盖膜时人为损伤。透射电镜观察毛细胞及支持细胞的细胞核、细胞器形态正常。说明NiTi听泡植入后释放的微量Ni对豚鼠耳蜗组织和细胞形态无明显影响。本次实验在观察NiTi听泡植入对耳蜗组织和细胞形态无明显影响的基础上，通过丫啶橙-碘化丙啶双重染色法进一步排除了这种微量Ni导致毛细胞凋亡的可能。丫啶橙-碘化丙啶双重染色法能很好地显示凋亡细胞及存活细胞^[22] 。本次实验显示3个组在不同的时间点均无明显凋亡毛细胞的存在，说明豚鼠听泡植入NiTi后释放的Ni不导致耳蜗毛细胞凋亡的发生。
为了观察听泡内释放的微量Ni是否影响豚鼠听觉功能，实验选择了手植入前后听觉反应阈和听觉毛细胞功能作为观察指标。ABR是客观评价听功能的方法之一^[23] ，DPOAE具有检出率高，快速，灵敏，反应稳定和频率特异性好的特点，被认为是反映耳蜗外毛细胞功能状态和耳蜗非线性机制的最有效的指标^[24]。实验采用短纯音ABR和DPOAE方法，对NiTi植入组、Ti植入对照组和空白植入对照组在手植入前和手植入后的7，14，28，56，112 d的5个时间点进行了检测，发现NiTi植入组和2个对照组豚鼠ABR反应阈在手植入后不同时间点与手植入前比较均无明显差异，DPOAE在手植入前与手植入后的5个时间点的通过率均为100%。以上结果提示，镍钛合金听泡植入对豚鼠外毛细胞功能和听觉功能无明显影响。本次实验中，豚鼠手植入前后ABR阈值均在23-35 dB SPL之间，比文献报道的正常豚鼠ABR阈值偏高^[25] ，可能是由于豚鼠麻醉深度、刺激电极的放置、测试参数设置、耳机和测试仪器类型的差异所致。
综合以上结果可以看出，镍钛合金听泡植入虽然可造成新生骨组织含有极微量镍(Ni)及钛(Ti)，但是未引起豚鼠听泡形态学变化，也未诱导耳蜗基底膜毛细胞发生凋亡或对毛细胞纤毛及细胞器造成明显损害。并且对豚鼠外毛细胞功能和听觉功能无明显影响，由此可以证实镍钛合金听泡植入对豚鼠无耳毒性。

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