异基因造血干细胞移植后发生移植物抗宿主病患者血清外泌体miRNAs敏感生物标志物的表达分析

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1764

中国组织工程研究 ›› 2019, Vol. 23 ›› Issue (21): 3418-3425.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1764

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异基因造血干细胞移植后发生移植物抗宿主病患者血清外泌体miRNAs敏感生物标志物的表达分析

刘娇¹，王大明¹，安泰学²，胡雪松²，李南凯²，汪洪富¹，马雯¹，聂赫中容¹，肖利佳¹，周义文¹，郑磊²

¹南方医科大学深圳医院，广东省深圳市 518100；²南方医科大学南方医院，广东省广州市 510510

修回日期:2019-03-26 出版日期:2019-07-28 发布日期:2019-07-28
通讯作者: 王大明，副主任技师，南方医科大学深圳医院，广东省深圳市 518100
作者简介:刘娇，女，1984年生，江西省萍乡市人，汉族，2009年中南大学湘雅医学院毕业，主管检验师，主要从事分子诊断研究。
基金资助:
广东省自然科学基金项目(2015A030313825)，项目负责人：王大明；广东省医学科研基金青年基金(A2017143)，项目负责人：马雯；深圳市科技创新委员会基础研究项目(JCYJ20170307174738825)，项目负责人：王大明；深圳市卫生计生系统科研项目(201506076)，项目负责人：邹红岩；深圳市卫生计生系统科研项目(201601040)，项目负责人：马雯；深圳市卫生计生系统科研项目(SZBC2017014)，项目负责人：聂赫中容；深圳市宝安区医疗卫生基础研究项目(2017JD184)，项目负责人：聂赫中容；深圳市宝安区医疗卫生基础研究项目(2018JD122)，项目负责人：刘娇

Expression profile analysis of miRNAs in serumal exosomes as sensitive biomarkers in patients with graft-versus-host disease following allogeneic hematopoietic stem cell transplantation

Liu Jiao¹, Wang Daming¹, An Taixue², Hu Xuesong², Li Nankai², Wang Hongfu¹, Ma Wen¹, Nie-He Zhongrong¹, Xiao Lijia¹, Zhou Yiwen¹, Zheng Lei²

¹Shenzhen Hospital, Southern Medical University, Shenzhen 518100, Guangdong Province, China; ²Nanfang Hospital, Southern Medical University, Guangzhou 510510, Guangdong Province, China

Revised:2019-03-26 Online:2019-07-28 Published:2019-07-28
Contact: Wang Daming, Associate chief technician, Shenzhen Hospital, Southern Medical University, Shenzhen 518100, Guangdong Province, China
About author:Liu Jiao, Laboratorian in charge, Shenzhen Hospital, Southern Medical University, Shenzhen 518100, Guangdong Province, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Guangdong Province, No. 2015A030313825 (to WDM); the Guangdong Provincial Medical Research Foundation for the Youth, No. A2017143 (to MW); Basic Research Project of Shenzhen Science and Technology Innovation Committee, No. JCYJ20170307174738825 (to WDM); Shenzhen Health and Family Planning System Research Projects, No. 201506076 (to ZHY), 201601040 (to MW) and SZBC2017014 (to NHZR); Medical and Health Basic Research Project of Shenzhen Baoan District, No. 2017JD184 (to NHZR) and 2018JD122 (to LJ)

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
外泌体：是一类介导体内生物信息分子传递的纳米级小囊泡，由Johnstone等于1987年提出。外泌体能在体内运载和传递生物信息分子，在免疫调节、心血管疾病和肿瘤等生理病理过程中发挥着重要的功能。
急性移植物抗宿主病：是异基因造血干细胞移植后常见的并发症，移植后约有50%的患者会发生急性移植物抗宿主病，通常以皮肤、肠道、肝脏等脏器损害为主，严重者可导致死亡。

摘要
背景：当前国内外关于人类造血干细胞移植后外泌体miRNA和移植物抗宿主病发生的相关性研究甚少。国内研究匮乏，外泌体来源的核酸分子有望成为新型生物标志物预测急性移植物抗宿主病的发生。
目的：探讨异基因造血干细胞移植后发生急性移植物抗宿主病患者外周血血清外泌体中候选基因miRNAs的差异表达。
方法：收集2017年8月至2018年5月异基因造血干细胞移植后发生急性移植物抗宿主病以及未发生急性移植物抗宿主病患者共30例，其中急性移植物抗宿主病组20例，非急性移植物抗宿主病组10例。提取移植前后血清外泌体及miRNA，基因芯片杂交后图像采集和数据分析。
结果与结论：与对照组相比，移植前后呈上升或下降趋势且信号差异倍数超过10倍的miRNAs在急性移植物抗宿主病组有11个miRNAs上升，26个下降。hsa-miR-3976、hsa-miR-122-5p、hsa-miR-3125明显上调，hsa-miR-941、hsa-miR-4687-5P和hsa-miR-4769-5p明显下调。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-3848-3779(王大明)

关键词: 异基因造血干细胞移植, 急性移植物抗宿主病, 外泌体, miRNA, 基因芯片, 生物标志物, 广东省自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: There are few studies, especially in China, addressing the correlation between exosome miRNAs and graft-versus-host disease (GVHD) following human hematopoietic stem cell transplantation. Exosome-derived nucleic acid molecules are expected to become new biomarkers for predicting the occurrence of acute GVHD (aGVHD).
OBJECTIVE: To investigate the differential expression of candidate gene microRNAs in peripheral blood serum exosomes of aGVHD patients with after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation.
METHODS: A total of 30 patients with aGVHD and without aGVHD after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation from August 2017 to May 2018 were enrolled, including 20 in aGVHD group and 10 in non-aGVHD group. Serum exosomes and miRNAs were extracted before and after transplantation. Image acquisition and data analysis were performed after gene chip hybridization.
RESULTS AND CONCLUSION: After microarray hybridization microRNAs showed an over 10-fold upward or downward trend before and after transplantation. Compared with the control group, 11 microRNAs increased and 26 decreased in the aGVHD group. hsa-miR-3976, hsa-miR-122-5p, and hsa-miR-3125 were significantly up-regulated, while hsa-miR-941, hsa-miR-4687-5P and hsa-miR-4769-5p were significantly down-regulated.

Key words: allogeneic hematopoietic stem cell transplantation, acute graft-versus-host disease, exosomes, miRNA, gene chip, biomarker, Natural Science Foundation of Guangdong Province

中图分类号:

R457

刘娇，王大明，安泰学，胡雪松，李南凯，汪洪富，马雯，聂赫中容，肖利佳，周义文，郑磊. 异基因造血干细胞移植后发生移植物抗宿主病患者血清外泌体miRNAs敏感生物标志物的表达分析[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(21): 3418-3425.

Liu Jiao, Wang Daming, An Taixue, Hu Xuesong, Li Nankai, Wang Hongfu, Ma Wen, Nie-He Zhongrong, Xiao Lijia, Zhou Yiwen, Zheng Lei. Expression profile analysis of miRNAs in serumal exosomes as sensitive biomarkers in patients with graft-versus-host disease following allogeneic hematopoietic stem cell transplantation[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(21): 3418-3425.

图/表（结果） 5

2.1 提取外泌体表征

2.1.1 透射电子显微镜观察结果 如图1A，B所示，外泌体在电镜下呈大小不等(30-200 nm)的圆形或椭圆形囊泡样结构，由染色较深的双层膜外膜和染色较浅的内层低电子密度物质组成，符合外泌体的描述。

2.1.2 Western blot检测结果 将提取的外泌体进行Western blot实验，检测其表面外泌体标志蛋白。Calnexin (分子质量约90 kD)为细胞膜表面高表达，TSH101(分子质量约30 kD)为普遍认同的外泌体表面标志物。CD9和CD63为外泌体膜上参与外泌体运输的四跨膜蛋白。如图1C所示，TSG101、CD9、CD63在外泌体中均有表达，符合外泌体的描述。

2.1.3 纳米粒度分析结果 在(10⁸-10⁹)颗粒/mL浓度下利用纳米粒度分析仪对外泌体进行分析，颗粒粒径主要集中在60-200 nm，符合已有对外泌体的描述，见图1D。

2.2 miRNA芯片结果分析

2.2.1 基因芯片筛选移植后发生急性移植物抗宿主病组与未发生急性移植物抗宿主病对照组差异表达miRNAs 研究选取了20例急性移植物抗宿主病样本与10例未发生急性移植物抗宿主病样本进行miRNA表达谱芯片分析，生物学信息分析提示筛选得到在2组之间差异表达倍数大于1.5的miRNAs有206个，其中表达上调的miRNAs有113个，表达下调的miRNAs有93个，其分子聚类图见图2，可以从中获得6条已筛选出的miRNA的差异倍数，见表2。

2.2.2 Target Summary分析 由已经筛选出来的6条miRNA，预测其在mirdbv5库中的全部靶基因，将其按照target score由高到低排序，取其中70分以上的相关靶基因816个；预测6条miRNA在taregetscan库中全部相关靶基因，将其按照cumulative Weighted Context++Score由小到大排序，取其中大于-0.31的相关靶基因1 468个；然后再取2个库中挑选出来靶基因中的交集即为筛选出来的相关性最高的靶基因，见图3。

2.2.3 GO分析和Pathway分析 GO分析是一个对基因和蛋白质的功能进行限定和描述并且分类的词汇标准，分为3部分：细胞组件(CC)、分子功能(MF)、生物学途径(BP)。将GO分析3个部分中上调条目的数据分别按富集分数(EnrichmentScore)由高到低排序，挑选出分数高即为显著性高的条目，以富集分数为纵坐标作图(柱状图)，见图4；再将下调条目的数据同样由高到低排序，挑出显著性高的条目，以富集分数为纵坐标作图，见图5。

Pathway(PW)分析是对富集的靶基因定位到KEGG通路的功能分析。将得到的pathway分析进行数据整理，见表3，根据其富集分数(EnrichmentScore)以及显著性(P值)可作点阵图，见图6，7。

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引言

20世纪80年代，Johnstone等^[1]发现网织红细胞在成熟过程中分泌的小囊泡可以传递转铁蛋白，并首次将这种囊泡亚型命名为exosome(即外泌体)，人体内多种细胞及体液均可分泌外泌体，包括内皮细胞、免疫细胞、血小板、平滑肌细胞、造血干细胞等。当其由宿主细胞分泌到受体细胞时，外泌体可通过其携带的蛋白质、核酸、脂类等来调节受体细胞的生物学活性。外泌体中的蛋白可介导外泌体与靶细胞特异性结合并经细胞信号转导，在免疫、凝血、肿瘤等生理病理过程中发挥作用。microRNA (miRNA)是一种小的非编码RNA分子，大小为19-22个核苷酸，在转录后水平调控基因表达^[2]。

造血干细胞移植是许多血液病的唯一治疗方法，其术后并发症包括复发、移植物排斥反应、感染、移植物抗宿主病。近年来造血干细胞移植后生存率提高，而急性移植物抗宿主病仍然是严重的并发症，基因内的单核苷酸多态性对感染性病原体产生免疫反应，残留的同种异体抗原或相关基因药物代谢与造血干细胞转归的关系已经进行了相关研究^[3]。急性移植物抗宿主病是异体造血干细胞移植后早期死亡的重要并发症之一，其表现并不特异，所以鉴别诊断具有重要意义。近年来组学技术爆炸式发展，这在很大程度上促进化学、工程和生物信息学的技术进步。血浆生物标志物可以作为诊断急性移植物抗宿主病和判断预后的工具^[4]。只有少数的miRNA可以作为有效的血液病抑制因子，国外发现了一组功能上相互关联的miRNA表现为急性淋巴细胞白血病细胞数量减少^[5]。还有研究发现miR-223表达水平低的患者预后较差^[6]。目前，外泌体中的生物标志物有很大的潜力可用于个性化医疗。该研究从造血干细胞移植后发生急性移植物抗宿主病的急性白血病患者血清中提取相关外泌体和miRNA进行基因筛选，得到一系列的miRNAs通过临床样本进行验证。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 分子生物学实验观察。

1.2 时间及地点 实验于2017年8月至2018年5月在南方医科大学深圳医院临床检验医学中心完成。

1.3 对象

1.3.1 病例收集 经医院伦理委员会同意，随机选取2017年8月至2018年5月在研究单位附属医院血液科进行造血干细胞移植(外周血干细胞移植)的白血病患者30例作为研究对象，见表1。所研究病例免疫抑制治疗方案相同、供受者均为汉族人群。收集整理造血干细胞移植资料，包括患者病例号、供患者基本信息(包括双方的HLA-A、-B、-C、-DRB1和-DQB1位点高分辨配型结果、ABO血型、RH血型、性别、年龄、民族、体质量、籍贯等信息)和患者移植前后生存情况(包括移植前体检状态、疾病诊断分期、预处理方案、移植时间、输入细胞和使用药物情况、移植物抗宿主病预防方案、植入情况、是否出现移植物抗宿主病、合并症及定期复查信息等)。

急性移植物抗宿主病筛选标准：发生于移植后100 d内及供者白细胞输注后，主要表现为黄斑、丘疹和红斑皮疹、胃肠道症状及淤胆型肝炎。共有20例患者移植后发生急性移植物抗宿主病。采集上肢肘部外周血，每个标本离心后取上层血清800 μL，冻存于-80 ℃冰箱。

1.3.2 实验试剂 外泌体提取试剂盒Exoquick(广州吉泰生物有限公司)；exoRNA提取试剂盒Trizol-LS(Ambion公司)；PBS(广州一科生物科技有限公司)；TSG101标志蛋白(广州天骏生物科技有限公司)。

1.3.3 实验仪器及耗材 台式低温离心机(德国Eppendor公司)；常温、冷冻离心机(德国Eppendor公司)；移液器(德国Eppendor公司)；普通PCR仪(德国Eppendor公司)；Nanosight NS-300纳米颗粒分析仪(英国马尔文公司)；H-7650透射电子显微镜(日本HITACHI公司)；超低温冰箱(中国海尔公司)；Axon GenePix 4000B芯片扫描仪。15 mL普通离心管(Coring公司)；9 mL超高速离心机配套离心管(Beckman公司)；普通注射器(广州天骏生物科技有限公司)；EP管和枪头(美国Axygen公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 外泌体的提取 ①按是否发生急性移植物抗宿主病分为急性移植物抗宿主病组20例和对照组10例；②将冻存于-80 ℃冰箱的血清标本取出进行冰上复融，避免反复冻融，直到血清完全融化，1 200×g离心30 min，吸取上清到新管；1 200×g离心30 min，吸取上清到新管；随后进行超速离心，30 000×g离心27 min，弃去上清；PBS重悬后，30 000×g再离心27 min，弃去上清，加入200 μL PBS重悬沉淀；随后进行高速离心，3 000×g离心15 min，滤去细胞或者碎片；③将离心后的上清液转移至另外一个洁净的试管，滴加ExoQuick试剂(与标本的比例为63∶250)，混匀后静置，4 ℃孵育30 min；④再次离心(1 500×g，30 min)，吸去上清液后，加入100 μL PBS重悬沉淀，即为提取出来的外泌体。

1.4.2 外泌体颗粒浓度及大小分析 ①取外泌体样本用PBS稀释20 000倍，使样品被稀释至(10⁸-10⁹)颗粒/mL，打开纳米颗粒分析仪；②对纳米颗粒分析仪进行清洗及校准，用标准品[100 nm聚苯乙烯胶乳球(97±3) nm]校准后，用PBS清洗管道直到视野中无亮点粒子出现；③用2 mL注射器吸取样品300-500 μL缓缓推入管道，直至液流稳定，视野内无过大过亮粒子；④用NTA软件拍摄记录每个颗粒的布朗运动轨迹，随后进行相应分析；⑤输出结果。

1.4.3 Western blot检测外泌体的蛋白表达

(1)外泌体蛋白抽提与定量：①应用凯基全蛋白提取试剂盒提取外泌体的内蛋白。将10 μL磷酸酶抑制剂、1 μL蛋白酶抑制剂和5 μL 100 mmol/L PMSF滴入1 mL Lysis Buffer中，混匀，置于冰块上备用。取配置好的裂解液加入外泌体悬液中，冰上裂解5 min，4 ℃、14 000×g的离心力下离心15 min，上清液即为蛋白质提取物；②蛋白浓度定量：采用凯基Bradford蛋白定量试剂盒进行样本浓度的测定。取待测样本5 μL，滴加考马亮蓝溶液195 μL，混匀，静置2 min，595 nm下比色测定吸光度值，按照所测吸光度值，在标准曲线查得相对应的蛋白质含量(μg)，除以样本总体积(5 μL)即为样本实际浓度，计算出含蛋白的溶液体积就是Westem Blot上样量；③蛋白样品变性：在蛋白提取物中按蛋白样品与SDS缓冲液4∶1的比例滴加5×SDS缓冲液，沸水煮5 min，-20 ℃冰箱储存。

(2)电泳：①灌胶：10%分离胶滴加TEMED立即摇匀后可以进行灌胶，用去离子水液封。当胶和水两者之间有一条折射线时，说明已经凝胶了。等胶完全凝固后倒去胶上的去离子水并用吸水纸吸干。4%的2 mL浓缩胶滴加TEMED立刻摇匀即可灌胶。用积层胶将剩余空间灌满，然后把梳子插入浓缩胶中。待到浓缩胶凝固后，手分别捏住梳子的两边垂直往上轻轻拔出；②上样：电泳槽中加入配好的电泳缓冲液，用微量进样器贴壁吸取样本，将加样器针头插至加样孔中缓缓注入样品，其中第一个泳道应加Markert指示剂4 μL；③电泳：先启用低电压恒压电泳(80 V 15 min)上层胶，溴西蓝进入下层胶时使用高电压恒压电泳(120 V，60 min)，电泳时溴蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳。

(3)转膜和封闭：将蛋白质转移到PVDF膜，转膜槽浸置在冰浴中，200 A转移1 h。电转完毕后将PVDF膜浸泡于配制好的5%脱脂奶粉封闭液中，然后在室温条件下，摇床80 r/min封闭3 h，TBST洗膜5 min，共洗3次。

(4)一抗、二抗孵育：加入TSG101一抗稀释液，置于4 ℃冰箱的摇床上孵育过夜，次日TBST洗膜6次，每次5 min，加入稀释好的辣根过氧化物酶标记的二抗稀释液，室温条件下孵育1.0-2.0 h，TBST洗膜3次，每次10 min。

(5)化学发光显影：按1∶1的比例把曝光液A、B液混合，各约0.5 mL，置于平皿中，将膜上的TBST在滤纸上轻轻吸干，放入混匀的曝光液中，使膜在曝光液中充分浸泡。使用ChemiDocXRS显像系统扫描条带，观察各条带表达情况。

1.4.4 透射电子显微镜观察 取20-40 μL外泌体重悬液滴于电镜专用的铜网上，20 μL 2%的磷钨酸负染10 min置于透射电子显微镜下观察外泌体形态并且拍照。

1.4.5 外泌体中RNA的提取及分析 此步骤由康成生物公司进行。①将用Exoquick提取的外泌体加PBS重悬于离心管中，加入750 μL Magzol-ISReagent和10 μL Linear Acrylamide，用加样枪吹吸混匀10-15次以裂解样品，室温静置5-10 min；②注入200 μL氯仿，剧烈震荡15 s，室温静置2 min；③12 000×g，4 ℃条件下离心15 min，形成上层含RNA的水相，中间层和下层含DNF及蛋白的有机层；④小心吸出上清液于离心管中，滴加约1.5倍的无水乙醇，流涡混匀20 s；⑤准备2 mL的收集管，装入 Hipure RNA Micro Column，转移约1/2体积的混合液，8 000×g离心30 s；⑥弃滤液，把柱子放回收集管。将剩余混合液转移至柱子当中，8 000×g离心30 s；⑦再弃滤液，把柱子放回收集管，加入Buffer RWT 600 μL，8 000×g离心30 s；⑧再弃滤液，把柱子放回收集管，13 000×g离心3 min，使柱子里的基质被甩干；⑨移出柱子至1.5 mL离心管，加入15-30 μL DEPG至柱子的膜中央，室温放置2 min， 13 000×g离心1 min，再弃去柱子，将得到的RNA样本存放于-80 ℃冰箱中。

1.4.6 制备荧光标记探针与芯片杂交 此步骤由康成生物公司进行。

(1)抽提的RNA通过质检后，使用miRCURYTM Array Power Labeling kit(Cat #208032-A, Exiqon)对miRNA进行标记。具体步骤如下：①1 μg的RNA加水至2 μL，再加入1 μL的CIP buffer and CIP酶(Exiqon)，混合后置于37 ℃ 30 min；②将样品置于95 ℃ 5 min终止反应，加入3 μL的labeling buffer，1.5 μL的fluorescent label (Hy3^TM)，2.0 μL的二甲基亚砜，2.0 μL的labeling enzyme，在16 ℃下反应1 h；③将样品置于65 ℃ 15 min终止反应。

(2)标记完成后，将样品与miRCURYTM LNA Array (v.19.0)(Exiqon)芯片杂交，根据Exiqon的实验方法进行。①25 μL的样品与25 μL的杂交缓冲液混合，95 ℃下变性2 min，然后置于冰上2 min；②与芯片在56 ℃下杂交16-20 h，杂交系统为Nimblegen Systems, Inc., Madison, WI, USA；③杂交完成后，使用Wash buffer kit(Exiqon)清洗芯片。

(3)使用Axon GenePix 4000B芯片扫描仪扫描芯片。

1.5 主要观察指标 基因芯片热图分布情况。

1.6 统计学分析 将数据导出，对数据进行GO(Gene Ontology)分析、Pathway分析，可以得出发生急性移植物抗宿主病的差异表达基因，筛选出其中荧光表现强度差异达10倍变化(Fold change增加或减少10倍以上)的基因，即为显著性高且稳定的差异表达基因。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

外泌体为直径40-100 nm，是体内多种细胞分泌的双层膜结构小囊泡^[7]，在体内稳定存在且半衰期长，能运送RNA和蛋白质等生物信息物质至靶器官^[8]，外泌体实际上提供了一种细胞间的交流机制^[9]，在免疫调节的生理病理中发挥着非常重要的作用^[10]。在某些特殊的生理或者病理状态下，细胞会选择性地将一部分蛋白以及遗传物质包裹进入外泌体内，而后将其释放到细胞外环境中^[11]。外泌体可由多种细胞分泌，其内含有非编码微小RNA，可通过改变细胞受体的表型来影响细胞活动^[12]；miRNA是一类介导mRNA转录后沉默的非编码小RNA，参与细胞的命运调控^[13]。它们的异常表达与许多人类疾病的发病机制有关，干细胞造血作用是由一个复杂的分子机制网络控制的高度调控过程，并调节细胞的分化、增殖和凋亡^[14]。miRNA还可保护易在循环系统中失活或降解的信息物质，将它们安全转移至特异性的靶细胞中参与信号调节。外泌体中可运载大量不同种类的核酸，如miRNA、rRNA、DNA、IncRNA等^[8]；通常运载200 nt以下的核酸碎片，其中miRNA参与体内各种生物学过程，调控了1/3以上的基因表达^[10]。miRNAs是一类非编码的小RNA分子^[15]，可通过转录抑制或诱导信使RNA的降解负向调节基因表达^[16]。它们广泛存在于人类血液、尿液、胸腹腔积液等多种体液样本中，并提供丰富、稳定、灵敏且特异的生物信息，由于能够在循环系统中进行传递和保护RNA而引起了研究者的关注，并逐渐成为了近几年的研究热点，研究人员在个性化医学中发现了大量的生物标记物，尽管许多难题依然存在，比如外泌体miRNA提取，但是不久的将来在临床实践中应用广泛。

异基因造血干细胞移植是治疗白血病、淋巴瘤、再生障碍性贫血以及自身免疫性疾病的有效治疗方法^[17]，如急性髓系白血病目前的诊断方法不利于疾病的早期发现，且诊断结果重复性较差，已有大量研究显示，细胞外miRNA富集在外泌体中，且受其表面膜的保护而具有很好的稳定性，是理想的分子标志物^[18]。调节基因表达的一种机制网络是由miRNA调控的^[19]。当外泌体循环时，这些外泌体的miRNA可以被邻近的细胞或遥远的细胞吸收，随后进行受体细胞调节^[20]。急性移植物抗宿主病是继移植后的严重并发症^[21]，发病率从30%到60%不等，尽管在HLA型、供者选择和移植物抗宿主病预防方面有所改善，但它仍然是导致移植相关发病率和死亡率的主要原因^[21]，Xiao等^[22]首先报道了异基因造血干细胞后急性移植物抗宿主病患者血浆中的miRNAs(miR-423、miR199a-3p、miR-93*、miR-377)表达增高，可能成为监测和诊断急性移植物抗宿主病的生物标记物。miRNA将不同的细胞类型、不同的生物机制和稳态路径联系起来^[23]。国外有研究发现，造血功能的系统性丧失在一定程度上是急性白血病外向miRNA被运到祖细胞的结果。急性髓系白血病细胞释放的外泌体对造血祖细胞有直接影响^[24]，可以通过生物信息传递，间接抑制剩余造血干细胞和祖细胞功能，急性移植物抗宿主病的严重程度显著影响移植早期的预后^[25]。国外研究发现，miR-126在人体内可抑制细胞周期进展，阻止分化，调节正常造血干细胞的循环，靶向PI3K/AKT/MTOR信号通路，维持白血病干细胞静息，从而促进化疗耐药^[26]。在未来，对异基因造血干细胞移植患者的预处理过程和移植物抗宿主病防治的个体化干预，可有助于减少移植物抗宿主病的发生或减轻其严重程度^[27]。干细胞来源外泌体调控血管生成和促进损伤细胞修复有望成为组织损伤修复的治疗新策略^[28]。Koutova等^[29]在急性髓系白血病患者血浆样本中鉴定到的差异表达miRNAs(miR-199b-5p、miR-625、miR-655、miR-326、miR- 361-5p)与作者研究结果一样，呈表达上调。

该研究以中国汉族人群为对象，提取移植前后患者血清外泌体，用基因芯片法筛选与移植物抗宿主病相关的敏感性标志物miRNAs，为临床医生预测患者移植后是否出现移植物抗宿主病提供客观的理论依据，从而指导医生及时临床医疗干预，提高患者生活质量和无病生存率。由于急性移植物抗宿主病严重威胁异体造血干细胞移植患者的术后生存率，且尚无有效的标志物对急性移植物抗宿主病进行诊断，因此该研究收集移植后发生急性移植物抗宿主病与对照组血清标本，提取外泌体miRNA，利用基因芯片比较分析急性移植物抗宿主病患者血清外泌体中异常表达的miRNA，分析与急性移植物抗宿主病相关的miRNA分子，筛选出有望作为急性移植物抗宿主病诊断标志物的外泌体miRNA分子。

研究结果提示实验成功富集了血清外泌体。在进行基因芯片分析中，采取检测混合血清的策略，将各样本取相同量的血清进行混合，尽量使各样本对结果的影响相同。

GO分析结果显示急性移植物抗宿主病组较对照组上调或者下调的GO条目，其中着重分析生物过程(BP)和分子功能(MF)部分，可发现其中的GO ID为0023023的分子功能，即MHC protein complex binding功能是上调的，而MHC分子结合了TCR受体之后，能够特异性地激活T细胞，引发后续一系列的免疫反应，而这与急性移植物抗宿主病的发病机制息息相关，由此可以初步判断参与调控此功能的miRNA-3125与急性移植物抗宿主病的相关性，为下一步的深入研究提供了理论基础。Pathway分析中下调的hsa04657通道，即白细胞介素17信号通路，白细胞介素17为Th17细胞的主要效应因子，介导炎症免疫反应，此通路的下调与宿主免疫能力低下互为因果，移植物组织中的免疫活性细胞才能对宿主发起攻击；因此可得知参与调控此通路的miRNA-4687-5p和miRNA-4769-5p与急性移植物抗宿主病也是有紧密联系。hsa03420通路的上调，即Nucleotide excision repair上调，与核酸复制或者表达功能的上调密切相关，在急性移植物抗宿主病患者体内，不断有细胞因为免疫攻击而死亡，同时又不断有新细胞产生，因而可推断参与调控此通路的miRNA-3976与急性移植物抗宿主病密切相关，其余2个miRNA也分别可从GO分析和Pathway分析的结果中寻得与急性移植物抗宿主病相关联的功能通道。因此，这6个miRNA可列为外周血中候选的miRNA基因敏感生物标志物。实验选取外泌体作为诊断标志物，优点在于其分布广泛存在于多种体液中，取材方便并且其脂质双分子层结构对内含物有一定保护作用，能有效防止miRNA被降解。结合芯片结果和急性移植物抗宿主病的文献报道，该研究初步筛选6条急性移植物抗宿主病差异表达的外泌体miRNA。后续将收集异体造血干细胞移植标本，对6条潜在标志物分子进行大样本的qPCR验证，评价其诊断效能，将新型外泌体诊断标志物应用于急性移植物抗宿主病诊断，提高急性移植物抗宿主病诊疗能力和发病机制研究，造福白血病患者。

该实验对异基因造血干细胞移植前后外泌体miRNA敏感生物标志物的筛选研究，只是刚刚开启了造血干细胞的移植密码，后续可对移植前后患者血清提取的miRNA做进一步实验和分析，将外泌体miRNA和急性移植物抗宿主病之间的潜在相关性得到更好的挖掘。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

异基因造血干细胞移植后发生移植物抗宿主病患者血清外泌体miRNAs敏感生物标志物的表达分析

Expression profile analysis of miRNAs in serumal exosomes as sensitive biomarkers in patients with graft-versus-host disease following allogeneic hematopoietic stem cell transplantation

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