可吸收丝素生物膜对大鼠的免疫毒性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1667

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：

丝素生物膜：是以蚕丝提取物制成的一种天然高分子生物材料，主要成分为由乙氨酸、丙氨酸、丝氨酸、酪氨酸等18种氨基酸组成的丝素蛋白，具有良好的生物相容性、缓慢的生物降解性及较低的炎症反应性，被广泛应用于骨、血管、人工韧带、神经组织、眼角膜等医学组织工程及化妆品和药物缓控释领域，显示了巨大的应用前景。

免疫毒性：免疫毒理学的目的是探讨外源性化合物和物理因素对机体(人和实验动物)免疫系统产生的不良影响及机制，外源性化合物对机体免疫系统的损伤作用包括免疫抑制和免疫增强等。免疫毒性检验可分为非功能性检验和功能性检验等多种类型，非功能性检验测定免疫器官质量及形态、淋巴组织变异程度、淋巴细胞数和免疫球蛋白水平或其他免疫功能标志物；功能性检验则测定细胞或器官活性，大体分为体液免疫应答和细胞免疫应答2大类。

背景：丝素生物膜的主要成分丝素蛋白是天然蛋白质，但对机体来说仍属异源蛋白，其免疫原性/毒性的强弱是决定其开发前景的重要因素。

目的：通过大鼠肌肉植入实验评价可吸收丝素生物膜及其降解产物对大鼠免疫系统的毒性作用。

方法：取10只Wistar大鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司提供)，右侧臀肌植入1 mm×10 mm的长条状丝素生物膜，观察植入物吸收情况，确定实验植入周期。将72只Wistar大鼠分为对照组与受试物组，每组36只，每组内雌雄各18只，受试物组在右侧臀肌植入1 mm×10 mm的长条状丝素生物膜，对照组不放置植入物，其余操作同受试物组，植入26周后，取其中一部分动物，进行免疫器官脏体比及组织病理学检查，以及脾淋巴细胞增殖能力、NK细胞活性、外周血T淋巴细胞及其亚群、细胞因子白细胞介素2和肿瘤坏死因子α检测；取另一部分动物，进行巨噬细胞红细胞吞噬率与吞噬指数、溶血空斑数检测。

结果与结论：①丝素生物膜植入大鼠肌肉26周基本全部吸收；②在雌性或雄性Wistar大鼠中，受试物组免疫器官外观、质量和组织病理学检查未见有生物学意义的明显改变，血液学指标(血红蛋白、红细胞计数、红细胞压积、血小板计数、白细胞计数及分类)、脾淋巴细胞增殖能力、NK细胞活性、外周血T淋巴细胞及其亚群、白细胞介素2和肿瘤坏死因子α水平与对照组比较差异均无显著性意义(P > 0.05)；③在雌性或雄性Wistar大鼠中，受试物组巨噬细胞红细胞吞噬率与吞噬指数、溶血空斑数与对照组比较差异均无显著性意义(P > 0.05)；④结果表明，丝素生物膜未引起大鼠机体的免疫抑制或免疫刺激等免疫毒性反应，对机体免疫器官、免疫细胞和免疫分子(细胞因子)无明显影响。

ORCID: 0000-0002-4471-9821(徐小玲)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 丝素生物膜, 丝素蛋白, 降解产物, 淋巴细胞, 免疫器官, 免疫毒性, 免疫刺激, 免疫毒性反应

Abstract:

BACKGROUND: Silk fibroin, the main component of silk fibroin biofilm, is a natural protein, but it is still a heterologous protein to the body. Its immunogenicity/toxicity is an important factor in determining the development prospects.

OBJECTIVE: To evaluate the toxicity of absorbable silk fibroin biofilm and its degradation products on the rat immune system by muscle implantation experiments in rats.

METHODS: Ten Wistar rats from Beijing Weitong Lihua Experimental Animal Technology Co., Ltd. were implanted with a long strip of 1 mm× 10 mm in the right gluteal muscle to observe the implant absorption and determine the implantation cycle. Seventy-two Wistar rats were assigned into control and experimental groups (n=36/group, 18 in either sexes). A long strip of 1 mm×10 mm was implanted into the rat right gluteal muscle in the experimental group, and the control group received no implantation. Some of the rats were taken for histological examination and calculate the organ/weight ratio, at 26 weeks postoperatively. The spleen lymphocyte proliferation ability, NK cell activity, cell classification of T lymphocytes, and levels of interleukin 2 and tumor necrosis factor α were detected. Another part of the animals was taken for macrophage phagocytosis of erythrocytes cell capacity and antibody producing cell count.

RESULTS AND CONCLUSION: (1) Silk fibroin biofilm was completely absorbed after implanted into the rat muscle for 26 weeks. (2) In female or male Wistar rats, the immune organs in the experimental group showed no significant changes in the appearance, weight and histological examination. There were no significant differences in the hematological indexes (hemoglobin, red blood cell count, hematocrit, blood platelet count and white blood cell count and classification), spleen lymphocyte proliferation, NK cell activity, the ratio of T lymphocytes and their subpopulations, and the levels of interleukin 2 and tumor necrosis factor α had no significant differences between two groups (P > 0.05). (3) In female or male Wistar rats, the macrophage phagocytosis of chicken erythrocytes cell capacity and antibody producing cell count showed no significant differences between two groups (P > 0.05). (4) These results indicate that silk fibroin biofilm causes no immunosuppression or immunostimulation on immune organs, immune cells and immune molecules (cytokines) of rats.

Key words: Silk, Toxicity Tests, Biofilms, Rat, Lymphocytes, Tissue Engineering

中图分类号:

徐小玲，潘望平，吕晓君，张菊，胡远华，何开勇. 可吸收丝素生物膜对大鼠的免疫毒性[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(14): 2190-2195.

Xu Xiaoling, Pan Wangping, Lü Xiaojun, Zhang Ju, Hu Yuanhua, He Kaiyong. Immunotoxicity of absorbable silk fibroin biofilm on rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(14): 2190-2195.

图/表（结果） 10

大鼠植入26周，植入物基本全部吸收，各组大鼠检测指标结果见如下。

2.1 受试物对大鼠免疫器官脏器系数的影响受试物组大鼠胸腺、脾脏、淋巴结形态及色泽正常，质地均匀，无肿块，胸腺/体质量比值、脾脏/体质量比值与对照组比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见表1。

2.2 各组免疫器官脏器组织病理学检查结果受试物组大鼠胸腺、脾脏和肠系膜淋巴结未见明显病理改变，见图1。

2.3 受试物对大鼠血液学指标的影响受试物组与对照组血液生化学指标相比差异均无显著性意义(P > 0.05)，见表2。

2.4 受试物对刀豆蛋白A诱导大鼠淋巴细胞转化的影响受试物组脾淋巴细胞增殖能力与对照组比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见表3。

2.5 受试物对大鼠NK细胞活性的影响与对照组比较，受试物组不能增强大鼠NK细胞活性(P > 0.05)，见表4。

2.6 受试物对大鼠外周血T淋巴细胞及其亚群的影响受试物组大鼠外周血T淋巴细胞亚群CD4⁺、CD8⁺细胞百分率及两者比例与对照组比较差异均无显著性意义(P > 0.05)，见表5，图2。

2.7 受试物对大鼠血清细胞因子的影响受试物组血清白细胞介素2、肿瘤坏死因子α质量浓度与对照组比较差异均无显著性意义(P > 0.05)，见表6。

2.8 受试物对大鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的影响受试物组吞噬率、吞噬指数与对照组比较差异均无显著性意义(P > 0.05)，见表7。

2.9 受试物对大鼠抗体生成细胞的影响受试物组溶血空斑数与对照组比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见表8。

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引言

材料方法

1.1 设计对比观察动物实验。

1.2 时间及地点实验于2016年7月至2017年1月在湖北省药品监督检验研究院生物安全检测中心完成。

1.3 材料可吸收丝素生物膜，白色，湖北赛罗生物材料有限责任公司生产，规格3 cm×4 cm，批号20150401。由生产厂家制成2 mm×10 mm，质量3.2-3.4 mg的无菌包装样品。

实验动物：11-12周龄SPF级Wistar大鼠82只，雌雄各半，雌性体质量240-280 g，雄性体质量370-450 g(购入时七八周龄，雌性体质量190-210 g，雄性体质量280- 320 g，适应4周后实验)，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，实验动物生产许可证号：SCXK(京)2012- 0001。饲养于SPF级实验动物室，温度20-25 ℃，相对湿度40%-70%，保持12 h昼夜节律，动物自由进食水。实验过程中动物使用和相关处置符合动物福利伦理要求。

实验用主要仪器和试剂：XS6001S动物秤(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)；3K15台式冷冻离心机(Sigma公司)；G154DW高压灭菌锅(致微(厦门)仪器有限公司)；TC20细胞计数仪(美国BIO-RAD)；VS-1300L-U超净工作台(苏州安泰)；HF90二氧化碳培养箱(上海力康)；ELX800酶标仪(美国Bio-Tek有限公司)；BX53荧光显微镜、AU400全自动生化仪(日本OLYMPUS公司)；XT-2000i血细胞分析仪(日本SYSMEX公司)；Navios流式细胞仪(贝克曼库尔特商贸有限公司)；RPMI1640细胞培养液(GIBCO公司)；小牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；刀豆蛋白A、DMSO、MTT(Sigma公司)；Hank’s液、2×Hank’s液(吉诺生物医药技术有限公司)；绵羊红细胞(武汉生物制品研究所有限公司)；补体(豚鼠血清)和鸡红细胞(湖北省药品监督检验研究院实验室制备)；SA缓冲液(青岛捷世康生物科技有限公司)；苏木精-伊红染色液试剂盒(珠海贝索生物技术有限公司)；YAC-1细胞(中国典型培养物保藏中心提供)；乳酸脱氢酶检测试剂盒(深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司)；大鼠血清白细胞介素2检测试剂盒和大鼠血清肿瘤坏死因子α检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

1.4 实验方法将72只Wistar大鼠分为2组，即对照组和受试物组，每组36只，每组雌雄各18只。植入前1 d，剃去所有大鼠臀部右侧约2 cm×3 cm区域的毛，植入当天以2%活力碘消毒皮肤，在右侧臀肌直接用20 G的植入套针穿过皮肤，受试物组将沿肌纤维将对折制成的1 mm× 10 mm长条状受试物(可吸收丝素生物膜)植入肌肉内，深约2 cm；对照组套针内不放置植入物，其余操作同受试物组。另取10只Wistar大鼠，臀部肌肉植入受试物，用于观察植入物的吸收情况。待受试物完全吸收后，处死所有大鼠进行检测。

取2组中的一部分大鼠(实验组9只雌性与9只雄性大鼠，对照组9只雌性与9只雄性大鼠)，进行以下实验：免疫器官脏体比及组织病理学检查、大鼠外周血T淋巴细胞及其亚群测定、刀豆蛋白A诱导的大鼠淋巴细胞转化实验、NK细胞活性测定、细胞因子白细胞介素2和肿瘤坏死因子α的检测；取剩余部分大鼠，进行以下实验：抗体生成细胞检测、腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验。

1.5 主要观察指标

1.5.1 免疫器官脏器系数及组织病理学检查

大体解剖和脏器系数：植入26周后，植入物基本完全吸收。植入26周结束时取大鼠，称质量，麻醉放血后进行大体解剖，观察淋巴结、胸腺、脾脏有无异常，称量胸腺、脾脏质量，并计算脏器系数，脏器系数(%)=脏器质量/体质量×100%。

组织病理学检查：取大鼠的胸腺、脾脏和肠系膜淋巴结，放入体积分数4%中性甲醛中固定，进行苏木精-伊红染色，阅片。

1.5.2 血液学指标植入26周结束时，取大鼠EDTA抗凝全血，检测血红蛋白、红细胞计数、红细胞压积、血小板计数、白细胞计数及分类。

1.5.3 刀豆蛋白A诱导的大鼠淋巴细胞转化实验植入26周结束时，无菌取脾(1/4大鼠脾脏)，置于盛有适量无菌Hank’s液平皿中，用镊子轻轻将脾磨碎，制成单个脾细胞悬液。经200目筛网过滤，1 000 r/min离心10 min，Hank’s液洗2次，弃上清，将细胞浆弹起，加入0.5 mL灭菌水20 s，裂解红细胞后，再加入0.5 mL 2倍Hank’s液及3 mL Hank’s液，1 000 r/min离心10 min，弃上清，用1 mL RPMI1640完全培养液重悬细胞，计数，调整细胞浓度为2×10⁹ L^-1。将细胞悬液分2孔加入24孔培养板中，每孔1 mL，一孔加100 mg/L刀豆蛋白A液50 μL，另一孔作为对照，置体积分数5%CO₂、37 ℃孵箱中培养72 h。培养结束前4 h，每孔轻轻吸去上清0.7 mL，加入0.7 mL不含小牛血清的RPMI1640培养液，同时加入MTT(5 g/L)50 μL/孔，继续培养4 h。培养结束后，每孔加入DMSO 0.1 mL，吹打均匀使紫色结晶完全溶解。然后分装到96孔培养板中，每个孔分装成3-6孔作为平行样，用酶联免疫检测仪，以570 nm波长测定吸光度值(A)。用加刀豆蛋白A孔的A值减去不加刀豆蛋白A孔的A值代表淋巴细胞的增殖能力。

1.5.4 NK细胞活性测定植入26周结束时，采用乳酸脱氢酶法测定NK细胞活性。实验前24 h将靶细胞(YAC细胞)进行传代培养，应用前以Hank’s液洗3次，用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为4×10⁸ L^-1。取1.5.3制备的脾细胞悬液，调整细胞浓度为2×10¹⁰ L^-1。

取靶细胞和效应细胞各100 μL(效靶比50∶1)，加入U型96孔培养板中，靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各100 μL，靶细胞最大释放孔加靶细胞和2.5%Triton各 100 μL，各项各设3个复孔，放入37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中培养4 h，1 500 r/min离心10 min，吸上清100 μL，全自动生化分析仪检测乳酸脱氢酶含量。NK细胞活性(%)= (反应孔乳酸脱氢酶含量-自然释放孔乳酸脱氢酶含量)/(最大释放孔乳酸脱氢酶含量-自然释放孔乳酸脱氢酶含量)×100%。

1.5.5 大鼠外周血T淋巴细胞及其亚群测定植入26周结束时，取4只流式管，分别标记为空白、CD3单染、CD4单染、CD8单染，各管加入相应的抗体，空白管不加抗体。另取流式管若干，每管加入大鼠EDTA抗凝全血100 µL，分别加入CD3(FITC)、CD4(APC)、CD8(PE)单克隆抗体各2 µL，充分混匀后室温避光孵育30 min。加入2 mL溶血剂，混匀后避光反应10 min，直至液体澄清，400×g离心5 min，弃上清，加2 mL的PBS洗涤1次，400×g离心5 min，弃上清，加0.4 mL含20 g/L多聚甲醛的PBS，重悬摇匀后上机分析。计算CD4⁺/CD8⁺的比值。

1.5.6 细胞因子白细胞介素2和肿瘤坏死因子α检测植入26周结束时，取不加抗凝剂的全血，2 500 r/min离心 10 min，取血清，采用ELISA试剂盒检测血清中白细胞介素2和肿瘤坏死因子α质量浓度。

1.5.7 腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验植入期结束前 4 d，大鼠每只腹腔注射10% 绵羊红细胞1 mL，实验当天，腹腔注入预热的含体积分数10%小牛血清的Hank’s液 15 mL，按摩腹部，吸出腹腔液，1 000 r/min离心8 min，弃上清，用体积分数10%小牛血清的Hank’s液调整细胞浓度至5×10⁸ L^-1。将细胞悬液置入放有盖玻片的6孔板中， 2 mL/孔，37 ℃二氧化碳培养培养2 h，用预热的PBS洗涤2次去除未贴壁细胞。每孔加入体积分数10%小牛血清的Hank’s液2 mL后，加入5%鸡红细胞1 mL，至培养箱孵育 1 h，取出盖玻片，苏木精-伊红染色，用40×显微镜计数并计算吞噬率和吞噬指数。吞噬率为每100个巨噬细胞中，吞噬鸡红细胞的巨噬细胞所占的百分率；吞噬指数为平均每个巨噬细胞吞噬鸡红细胞的个数。

1.5.8 抗体生成细胞检测受试物全部吸收当天处死大鼠，取出大鼠脾脏，放在盛有Hank’s液的小平皿内洗去毛发，加入Hank’s液约3 mL，轻轻撕碎脾脏，制成细胞悬液，过200目细胞筛网，1 000 r/min离心10 min，用Hank’s液洗2遍，将细胞悬浮在2 mL RPMI1640培养液中，再稀释100倍，计数细胞，调整细胞浓度为5×10⁹ L^-1。

空斑的测定：将表层培养基(取1 g琼脂糖加双蒸水至100 mL)加热溶解后，放45 ℃水浴保温，与等量2倍浓度Hank’s液混合，分装小试管，每管0.5 mL，再向管内加体积分数10%绵羊红细胞(用SA液配制)50 μL，脾细胞悬液(5×10⁹ L^-1)20 μL，补体100 μL，迅速混匀，倾倒于平皿上，做平行片，待琼脂凝固后，将平皿放入二氧化碳培养箱中温浴3 h，最后取出玻片，大体计数平皿上的空斑数。

1.6 统计学分析结果采用SPSS 17.0软件进行统计分析，数据用x(_)±s表示，比较对照组和受试物组的差异性。计量资料采用ONE-WAY ANOVA，方差齐性采用Dunnett多重分析，方差不齐采用Dunnett’s T3多重分析；计数资料采用非参数检验。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

讨论

致敏实验和免疫毒性实验是评价生物材料对机体免疫系统的影响是2个不同机制的实验，由于免疫系统组成的复杂性和功能的多样性，对于动物源性材料来说，单一的致敏实验显然不能全面地评价免疫毒性的各个方面，不能为材料的临床使用提供全面有效的安全性保证^[10-15]。免疫系统包括复杂的器官和细胞，正常情况下处于微妙的平衡状态，与有免疫毒性的物质接触会打破这种平衡，对机体产生不利影响^[16-18]。免疫毒性研究的目的就是探讨外源性物质对机体免疫系统产生的不良影响及机制，免疫毒性检验可分为非功能性检验和功能性检验等多种类型^[19-20]。

非功能性检验测定免疫器官质量及形态、淋巴组织变异程度、淋巴细胞数和免疫球蛋白水平或其他免疫功能标志物；功能性检验则测定细胞或器官活性，大体分为体液免疫应答和细胞免疫应答2大类^[21-25]。随着药物免疫毒性评价法规和技术的发展，以及医疗器械安全问题的不断出现，医疗器械免疫毒性评价问题越来越引起人们的重视，目前国内还没有一套生物材料免疫毒性的标准化评价体系，更缺乏相应的评价方法和有效的动物模型^[26-27]。

研究以丝素生物膜为实验材料，通过长期肌肉植入实验，从免疫病理学、细胞免疫、体液免疫和非特异性免疫4个方面观察受试物对动物免疫系统的毒性作用，以期为生物材料的免疫毒性评价提供一种有效而灵敏的检测技术。免疫病理学检查采用血液学指标检测、淋巴器官称质量及组织病理检查等方法；细胞免疫采用了淋巴细胞转化实验；体液免疫选用的是抗体形成细胞实验(也称空斑形成细胞实验)；非特异性细胞免疫采用的是NK细胞活性测定和巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验。还采用流式细胞术进行了T淋巴细胞及其亚群测定，以评价机体免疫功能是否失调；细胞因子的测定选取了肿瘤坏死因子α和白细胞介素2进行检测。肿瘤坏死因子α是一种由巨噬细胞对细菌感染或其他免疫源反应自然产生的细胞因子，能杀伤和抑制肿瘤细胞，促进中性粒细胞吞噬，是重要的炎症因子；白细胞介素2是所有T细胞亚群的生长因子，可促进活化B细胞增殖，故为调控免疫应答的重要因子^[28-30]。

研究免疫毒性研究结果显示，丝素生物膜对大鼠初级免疫器官胸腺、脾脏和肠系膜淋巴结无明显影响，对大鼠T淋巴细胞及其亚群的比例无影响，与传统的免疫功能指标，大鼠脾淋巴细胞转化、抗体生成细胞、NK细胞活性、腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞等具有较好的一致性。按照ISO/TS 10993-20:2005《医疗器械免疫毒理学试验原则与方法》及ICH S8《人用药物免疫毒性研究》，可认为丝素生物膜未引起大鼠机体的免疫抑制或免疫刺激等免疫毒性反应，对机体免疫器官、免疫细胞和免疫分子(细胞因子)无明显影响，因此在临床应用时发生免疫毒性的风险很低，研究结果为丝素蛋白类生物膜在生物医学领域的应用提供了实验依据。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程