微弧氧化涂层改性对3D打印钛合金支架细胞生物学的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0717

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (10): 1565-1572.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0717

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微弧氧化涂层改性对3D打印钛合金支架细胞生物学的影响

李炯炯¹，邹琴¹，胡釜¹，陈杰¹，李吉东¹，李述军²，郝玉琳²，李玉宝¹，左奕¹

¹四川大学纳米生物材料中心，分析测试中心，四川省成都市 610064；²中国科学研究院沈阳金属研究所，辽宁省沈阳市 110016

收稿日期:2017-11-14 出版日期:2018-04-08 发布日期:2018-04-08
通讯作者: 左奕，研究员，四川大学纳米生物材料中心，分析测试中心，四川省成都市 610064
作者简介:李炯炯，男，1991年生，河南省驻马店市人，汉族，四川大学在读硕士，主要从事生物材料的制备及表征。
基金资助:
国家863重点项目(2015AA033702)

Cytobiological effect of micro-arc oxidation coating on 3D-printed titanium alloy scaffold

Li Jiong-jiong¹, Zou Qin¹, Hu Fu¹, Chen Jie¹, Li Ji-dong¹, Li Shu-jun², Hao Yu-lin², Li Yu-bao¹, Zuo Yi¹

¹Analytical & Testing Center, Research Center for Nano Biomaterials, Sichuan University, Chengdu 610064, Sichuan Province, China; ²National Laboratory for Materials Science, Shenyang Institute of Metal Research, Chinese Academy of Sciences, Shenyang 110016, Liaoning Province , China

Received:2017-11-14 Online:2018-04-08 Published:2018-04-08
Contact: Zuo Yi, Researcher, Analytical & Testing Center, Research Center for Nano Biomaterials, Sichuan University, Chengdu 610064, Sichuan Province, China
About author:Li Jiong-jiong, Master candidate, Analytical & Testing Center, Research Center for Nano Biomaterials, Sichuan University, Chengdu 610064, Sichuan Province, China
Supported by:
the National 863 Project of China, No. 2015AA033702

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：

表面改性：是指在保持材料或制品原性能的前提下，采用物理、化学的方法改变材料组织结构或工件表面的化学成分赋予其表面新的性能，如亲水性、生物相容性、抗静电性能、染色性能等。

微弧氧化：具有工艺简单、处理过程对基体材料无影响等优点，微弧氧化工艺可在电解液环境中对Ti6Al4V多孔支架内外进行均匀的表面改性处理，原位生成氧化物陶瓷膜层，实现钛合金支架的表面改性和耐腐蚀性的提升。

摘要

背景：微弧氧化处理可提高钛合金植入体的生物学性能。目前研究多集中于钛合金片材，有关微弧氧化改性处理后3D多孔钛合金支架对细胞生长及分化的影响鲜有报道。

目的：研究微弧氧化表面改性对3D打印多孔钛合金支架表面细胞生物学性能的影响。

方法：将大鼠骨髓间充质干细胞分别接种于微弧氧化处理Ti₆Al₄V合金三维支架(实验组)与未经微弧氧化处理Ti₆Al₄V合金三维支架(对照组)上，培养4，7 d，进行扫描电镜观察、细胞骨架染色分析及细胞活力分析；培养4，7，11 d，检测细胞上清液中碱性磷酸酶和骨钙素水平；培养1，4，7，11 d，MTT法检测细胞增殖。

结果与结论：①培养4，7 d时，live/dead染色显示骨髓间充质干细胞在两组材料上生长良好；细胞骨架染色分析显示，实验组细胞骨架呈立体多角形，对照组支架表面的细胞以扁平梭形状沿支架宏观结构铺展；扫描电镜显示，实验组细胞排列较为紧密，细胞伸展状态良好，细胞间的板状伪足与丝状伪足交叉连接，以锚状结构牢固地黏附于材料表面；对照组细胞伪足间的连接较少，细胞外基质较少，平铺在材料表面生长；②随着培养时间的延长，两组细胞上清液中碱性磷酸酶与骨钙素水平逐渐升高；实验组培养7，11 d的碱性磷酸酶水平高于对照组(P < 0.05)，培养11 d的骨钙素水平高于对照组(P < 0.05)；③MTT检测显示，随着培养时间的延长，两组细胞数量逐渐增加；实验组培养7，11 d的细胞数量明显多于对照组(P < 0.05)；④结果表明，微弧氧化处理后的钛合金支架更有利于细胞的黏附、增殖与分化。

ORCID: 0000-0001-9931-1199(李炯炯)
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 微弧氧化表面改性, 粗糙度, 细胞骨架, 生物材料, 3D打印钛合金支架, 增殖和成骨分化

Abstract:

BACKGROUND: Micro-arc oxidation (MAO) treatment can improve the biological properties of titanium alloy implants. Previous studies mostly focused on the evaluation of titanium alloy plate, while the effects of the MAO-modified 3D titanium scaffold on the cell growth and differentiation were rarely reported.

OBJECTIVE: To investigate the effect of MAO coating on the biological performance of cells seeded onto the 3D-printed porous titanium alloy scaffold.

METHODS: Rat bone marrow mesenchymal stem cells were seeded onto the MAO-modified Ti6Al4V alloy scaffolds (experimental group) and unmodified scaffolds (control group). After 4 and 7 days of culture, cell/scaffold constructs were retrieved and processed for the assessment of cell morphology by using scanning electron microscopy, cytoskeletal staining analysis and cell viability assay were also evaluated. At 4, 7 and 11 days of culture, the levels of alkaline phosphatase and osteocalcin in the cell supernatant were detected. At 1, 4, 7 and 11 days of culture, the cell proliferation rate was measured using the MTT assay.

RESULTS AND CONCLUSION: (1) At 4 and 7 days of culture, live/dead staining showed that the bone marrow mesenchymal stem cells grew well on the two kinds of scaffolds. The analysis of cytoskeleton staining showed that the cytoskeleton of the experimental group was stereo and polygonal, while the cells on the scaffold surface in the control group were flat and spindle-shaped, spreading along the macro structure of the scaffolds. Under the scanning electron microscopy, the cells in the experimental group arranged closely and spread in a good condition, with interconnected lamellipodia and filopodia that firmly adhered to the scaffold surface in an anchor-shaped structure; in the control group, less filopodia interconnected, less extracellular matrix, and flat and sheet-like cells were observed. (2) With the time increase, the levels of alkaline phosphatase and osteocalcin increased gradually in both groups. The alkaline phosphatase level in the experimental group was significantly higher than that in the control group at 7 and 11 days of culture (P < 0.05), while the osteocalcin level was higher in the experimental group than the control group at 11 days of culture (P < 0.05). (3) With the prolongation of culture time, the number of cells in the two groups increased gradually. The number of cells cultured in the experimental group was significantly higher than that in the control group at 7 and 11 days of culture (P < 0.05). To conclude, the MAO-modified titanium alloy scaffold is favorable for cell adhesion, proliferation and differentiation.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Alloys, Biology, Stem Cells, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

李炯炯，邹琴，胡釜，陈杰，李吉东，李述军，郝玉琳，李玉宝，左奕. 微弧氧化涂层改性对3D打印钛合金支架细胞生物学的影响[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(10): 1565-1572.

Li Jiong-jiong, Zou Qin, Hu Fu,Chen Jie, Li Ji-dong, Li Shu-jun, Hao Yu-lin, Li Yu-bao, Zuo Yi. Cytobiological effect of micro-arc oxidation coating on 3D-printed titanium alloy scaffold[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(10): 1565-1572.

图/表（结果） 8

2.1 支架表面与切面形貌分析 3D打印支架孔隙相互贯通且结构清晰，孔径尺寸为400-500 μm。两种支架在放大较低倍数时，未能观察到明显差异(图1A，B，E，F)。但是，放大到较高倍数后，可观察到支架表面差异明显。微弧氧化工艺处理后的支架有大量的火山口状微孔，表面凹凸不平(图1C)。这些孔径大小不一，微孔直径均小于5 μm。而未改性的支架，微观表面相对平坦和光滑(图1G)。从横截面照片(图1D)中，可见厚度1.9 μm的粗糙涂层分布于钛合金支架基底上。

2.2 支架表面能谱和元素含量分析涂层的化学组成主要由电解液成分和基底材料决定。由微弧氧化过程中通过电解液在支架表面引入了磷元素，可显著提高材料的矿化诱导能力^[23-24]。另外，微弧氧化处理后材料表面氧元素的含量也比未改性支架表面含量高近2.5倍(图2)。

2.3 表面微弧氧化膜成分分析由X射线衍射图谱(图3A)中可看出，氧化膜层主要由锐钛矿型TiO₂构成，有少量的金红石型TiO₂，钛衍射峰由基体材料产生。不同于能谱，在X射线衍射谱中未观察到含磷的结晶衍射峰，可能磷化合物以非晶形式存在于涂层中。

X射线光电子能谱图(图3B)观察元素时，在533.2 eV处检测到极强的O1s峰，在459.8 eV处检测到Ti2p峰。Al2p与Al2s峰分别在103.5 eV、155.0 eV处。未检测到钒元素，是由于在表面氧化膜层含量过低的原因，而检测到的C1s和N1s峰则是受到空气中成分的影响所致。

X射线光电子能谱图谱中(图3C)钛在Ti 2p3/2和 Ti 2p1/2两处有双峰，高能量的Ti 2p1/2的峰在464.0 eV处，而低能量的Ti 2p3/2的峰在458.4 eV处，均为Ti-O键的峰。O1s结合能(图3D)集中在530.4 eV和532.0 eV处。

2.4 表面粗糙度分析表1中表面粗糙度数据表明，微弧氧化处理的试样和未改性处理的支架试样的轮廓算术平均偏差值(Ra)和微观不平十点高度值(Rz)均存在显著差异 (P < 0.05)。因此，微弧氧化改性处理显著地增加了材料表面的粗糙度。

2.5 接触角分析实验组和对照组表面接触角结果分别为(76.57±2.37)°和(68.02±5.39)°。结果表明，接触角虽有小幅度增大，仍低于90°，钛合金支架在表面微弧氧化处理后仍可称之为亲水性材料。接触角在10°-80°之间的表面属于中等润湿表面，细胞在中等润湿的材料表面黏附能力相对较强^[25]。与文献[26]中钛合金平板表面微弧氧化后出现接触角下降不同，此次实验三维支架表面微弧氧化后的接触角增加。原因可能是相对于平板结构，支架的大孔占比远高于微孔，液滴更易从光滑表面的未改性支架进入大孔实现浸润，表现为接触角比改性支架的更小。

2.6 细胞活性测试和形态学分析细胞接种培养4 d以后，在两种材料的荧光图片上(图4A，B，G，H)，均能看到明亮的绿色，反映出细胞较强的生命活力，说明细胞在材料上生长状态良好，几乎看不到红色荧光响应，可能因支架孔隙相对细胞较大，黏附性差的凋亡细胞在染色冲洗时从支架上脱落流失。细胞在支架材料上分布较为均匀。

真核细胞细胞质中错综复杂的纤维网构成细胞骨架，细胞的黏附状态与细胞骨架纤维紧密相关。研究中的钛合金支架多孔结构尺寸为400-500 μm，远大于细胞直径，微弧氧化处理后支架表面形成了直径为0.5-5 μm的微孔，这些微米和亚微米尺寸的多孔结构对细胞超微结构产生更为显著的影响。在实验组支架表面，细胞骨架结构立体分明，被染成红色的细胞肌动蛋白呈多边形形态(图4C)。在未对照组支架表面的细胞，肌动蛋白呈片状荧光响应(图4I)。

由扫描电镜图片可看到，在实验组支架材料表面黏附的细胞伸展成细长形或多角形不一，丝状伪足结构明显，细胞伸展状态良好，形态多样化(图4D-F)。不同于对照组支架上的细胞形态(图4J-L)，在实验组支架上的细胞有更多板状伪足且部分伪足直接锚进表面微孔内，与材料黏附更加牢固。

细胞接种培养7 d以后，细胞数目明显增多。在两种材料的荧光图片上，较密集地布满代表细胞活性良好的绿色(图5A，B，G，H)，说明材料具有较好的细胞相容性。

在实验组支架表面，被染成红色的蛋白微丝呈网状结构，由微丝组成的骨架结构呈立体多角形(图5C)。而对照组支架表面的细胞以扁平梭形状沿支架宏观结构铺展，肌动蛋白红色响应较强(图5I)。由此可见，细胞骨架的结构和铺展状态等超微结构与支架微表面粗糙度有关。当细胞黏附于较粗糙的表面时，通过伪足可锚接于微弧氧化表面的沟和孔洞，无需排列良好的肌动蛋白网架。而在未改性支架的光滑表面上黏附时，细胞需伸展出肌动蛋白纤维，才能将自己稳定于材料的表面，因此观察到在未改性支架表面的肌动蛋白粗大清晰(红色荧光响应更强)。此时，由于应力纤维的强力伸展，细胞被施加一定张力，表现为未改性支架表面扁平伸展的细胞骨架结构。

由扫描电镜图片可看到，在实验组支架材料表面黏附的细胞排列较为紧密，开始出现细胞间的重叠，细胞伸展状态良好，支架表面细胞突出材料表面较为明显，胞浆饱满，细胞间的板状伪足与丝状伪足交叉连接，以锚状结构牢固地黏附于材料表面(图5D-F)；对照组支架材料上的细胞伪足间的连接较少，细胞外基质较少，平铺在材料表面生长(图5J-L)。

李玉梅等^[27]以微弧氧化处理的纯钛圆片进行相关研究也表明，微弧氧化改性钛表面黏附的细胞形状较不规则，无一定的方向性，而未处理的圆片微表面相对光滑，成骨细胞易被牵伸，并沿材料的二维平面伸展。由此可见，无论基材是三维支架还是二维平面体，微表面的粗糙度才是细胞黏附的关键。相对于未改性支架的光滑微表面黏附的细胞，微弧氧化改性后形成的粗糙微表面，不仅更适于细胞黏附，还利于细胞以三维立体状态生长增殖，细胞超微结构形态表现更好。

2.7 碱性磷酸酶和骨钙素定量结果分析 图6A数据显示，培养第4天时，两组碱性磷酸酶活性无明显差异；随着时间的延长，碱性磷酸酶活性均增加，但实验组含量碱性磷酸酶活性高于对照组；培养7，11 d时，实验组碱性磷酸酶活性明显高于对照组(P < 0.05)。结果表明，微弧氧化改性钛合金支架表面后，有效地促进了骨髓间充质干细胞的初期成骨分化。图6B中骨钙素数据显示，随培养时间的增加，不同支架表面上的细胞骨钙素均呈递增趋势，实验组骨钙素水平均略微高于对照组，在培养第11天时出现显著差异(P < 0.01)。

2.8 细胞增殖骨髓间充质干细胞在两组支架表面上的生长趋势基本相同，随着培养时间的延长，细胞数目均增多。在第1，4天时，不同支架表面的细胞增殖无统计学差异(P > 0.05)；在第7，11天时，实验组支架上生长细胞总数要多于对照组(P < 0.01)，见图7。

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引言

钛合金材料具有比强度高、易加工、生物相容性和耐腐蚀性好的特点，被广泛应用于植入人体医疗器械和假体等^[1]。但是，钛合金强度过高引发应力屏蔽现象，长期植入后骨吸收松脱，导致植入失败。为使钛合金达到或接近人骨的弹性模量和强度，有效减轻骨修复过程中的应力屏蔽，在钛合金中引入孔隙，制成钛合金多孔结构。电子束熔炼技术作为3D打印技术之一，利用电子束能量源进行选择性熔化烧结进行逐层堆积的原理，可根据三维模型对材料的力学强度和孔结构大小及分布进行特定设计，是较为理想的金属多孔材料制备方法^[2-4]。前期研究中，Li等^[5]制备了不同密度的Ti₆Al₄V多孔材料，孔隙率在60%-85%，发现在比模量相关不大的情况下，采用电子束熔炼技术法制备开孔结构具有比其他传统金属泡沫更高的比强度。刘邦定等^[6]采用该支架进行了骨修复实验，对比观察发现1.0 mm孔径材料比的大孔径材料有更多的新骨形成。

虽然可有效应对钛合金支架力学屏蔽问题，但钛合金基体腐蚀产生的铝、钒金属离子释放问题仍可能对机体产生病理性危害^[7]。对支架进行表面改性，既可提高钛合金的磨耐蚀性，还能改善其生物学性能。常用的表面改性技术，以等离子喷涂^[8-10]、溶胶凝胶处理等为主^[11-13]。近年来，微弧氧化技术受到人们的关注，具有工艺简单、处理过程对基体材料无影响等优点。微弧氧化工艺可在电解液环境中对Ti6Al4V多孔支架内外进行均匀的表面改性处理，原位生成氧化物陶瓷膜层，实现钛合金支架的表面改性和耐腐蚀性的提升^[14-16]。

组织细胞的黏附、扩增及分化能力取决于材料的表面特性^[17]，体外实验可为体内植入提供有价值的生物响应指针。前人主要在致密平面块材上对钛合金材料微弧氧化涂层进行生物评价^[18]。Lim等^[19]微弧氧化处理金属钛后，发现可增加成骨细胞碱性磷酸酶活性。也有报道认为，微弧氧化处理钛合金片材后，成骨细胞碱性磷酸酶活性并无明显变化^[20]。目前，对于表面微弧氧化改性后的3D打印多孔钛合金支架材料，鲜少报道宏观支架三维结构及支架表面微纳结构和成分对细胞相容性带来的影响。

影响材料与细胞组织结合的重要因素包括植入物表面的结构、粗糙度、化学组成和亲水性等。因此，实验基于3D打印的多孔Ti₆Al₄V支架，对微弧氧化涂层改性前后的相关表面特性进行表征研究，通过骨髓间充质干细胞考察了不同支架表面的体外细胞学性能，深入分析支架三维结构及表面特性对干细胞生长、增殖及分化的影响。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计细胞形态学观察实验。

1.2 时间及地点实验于2015年1月至2016年12月在四川大学和中国科学研究院沈阳金属研究所完成。

1.3 材料

实验动物：2月龄健康SD大鼠，体质量为100-120 g，雌雄不拘，由四川大学华西医学部动物实验中心提供，许可证号：SCXK(川)2013-026。

钛合金支架材料：实验所用的基体材料为电子束熔炼技术打印制备的Ti6Al4V钛合金多孔支架材料，试样大小14.0 mm×1.8 mm。将制得的未改性表面支架和微弧氧化表面支架材料(沈阳金属所制备)分别用丙酮、乙醇、去离子水在超声波中清洗，风干备用。

实验主要试剂与仪器：胎牛血清、α-MEM培养基(美国Gibco，Life Technologies)；Alexa Flour^®532 phalloidin、MTT、Live/Dead ^®reagent Assay Kit(美国Molecular Probes,Life Technologies)；碱性磷酸酶、骨钙素(上海酶联生物科技有限公司)；JSM-6500LV型扫描电镜(日本Oxford)；TE2000-U倒置显微镜、共聚焦显微镜(日本Nikon)；XSAM800型X射线光电子能谱(英国 Kratos)；DX-2500型X射线衍射仪(中国丹东方圆仪器有限公司)；TR100A粗糙度测量仪(北京时代中仪科技)；JY-82A型静态接触角测量仪(承德鼎盛试验机检测设备有限公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 钛合金支架微弧氧化涂层的制作采用自行研制的30 kW直流脉冲微弧氧化装置进行表面处理，其中石墨和Ti6Al4V合金分别作为阴极和阳极。电解液由0.2 mol/L乙酸钠(CH₃COONa)、0.015 mol/L甘油磷酸钠五水合物(C₃H₇Na₂O₆P•5H₂O)和0.01 mol/L乙二胺四乙酸二钠盐二水合物(C₁₀H₁₄N₂Na₂O₈•2H₂O)构成。电源模式为单正向方波脉冲，加载电压为400 V，氧化时间10 min。在微弧氧化过程结束后，用去离子水冲洗样品并在冷空气下干燥，获得微弧氧化处理钛合金支架(实验组)。以未经微弧氧化处理的钛合金支架为对照。

1.4.2 微弧氧化处理钛合金支架的表征

氧化膜理化性质分析：采用扫描电镜观察喷金后的对照组与实验组钛合金支架的形貌。同时用扫描电镜附带的能谱仪测支架表面涂层的元素成分和含量。通过X射线衍射仪分析表面涂层，分析条件为：铜靶(λ=0.154 18 nm)，管电压40 kV，管电流25 mA，扫描速度为0.03 (°)/min，扫描范围是15°-90°；采用X射线光电子能谱仪测试支架表面的化学键合能，设置半峰宽1.4 eV，所得数据用XPS Peak Fit 4.1软件分析，解析微弧氧化膜Ti2p峰和O1s峰。

粗糙度分析：采用粗糙度测量仪，测量实验组与对照组各5枚试样的表面粗糙度，试样大小为10.0 mm×1.0 mm (3D打印二维成型样，Z轴填充间距为0 mm)，扫描长度为 6 mm，取样长度2.5 mm，记录轮廓算术平均偏差(Ra)和微观不平十点高度(Rz)值。

接触角分析：采用静态接触角测量仪分别测量两组材料各5枚试样的表面接触角，试样大小为10.0 mm×1.0 mm (3D打印平面成型样，Z轴填充间距为0 mm)。实验采用静态液滴法，实验液体为蒸馏水。

1.4.3 支架与细胞共培养

骨髓干细胞的提取：参照文献方法^[21-22]，采用贴壁法分离骨髓间充质干细胞。取SD大鼠，处死后转至无菌条件下迅速取出双侧股骨和胫骨，抗生素消毒后剪去两端骨骺显露骨髓腔，用含体积分数20%新生牛血清的α-MEM培养基反复冲洗骨髓腔制得细胞悬液。将细胞悬液吹打均匀后转置于细胞培养瓶中，放置于37 ℃的CO₂恒温培养箱中。通过观察细胞形态判定为干细胞。

支架与细胞共培养：取第3代骨髓间充质干细胞，以2×10⁷ L^-1的细胞浓度分别接种于实验组和对照组材料上。

1.4.4 共培养后的检测

扫描电镜观察：共培养4，7 d后，将细胞用2.5%戊二醛固定后，梯度乙醇脱水，临界点干燥后喷金，用扫描电镜观察。

细胞骨架染色分析：共培养4，7 d后，细胞用3.7%甲醛固定5-10 min，接着用0.1%Trion X-100/PBS室温通透处理3-5 min，PBS冲洗后加入浓度为0.15 μmol/L的 Alexa Fluor ^®532鬼笔环肽试剂对不同支架上共培养的细胞骨架进行染色分析。

细胞活力分析：所用的Live/Dead 染色试剂，采用calcein-AM/EthD-1双染细胞的方法。对共培养4，7 d后的细胞进行染色，避光孵育30 min后用荧光显微镜观察。

碱性磷酸酶和骨钙素检测：采用双抗体夹心法酶联免疫吸附试验(Elisa)测定。细胞接种在材料上4，7，11 d后，分别收集上清液和裂解液，实验组和对照组各自测定碱性磷酸酶和骨钙素活性。使用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度值，随后计算相对碱性磷酸酶和骨钙素活性。

细胞增殖：采用四唑盐比色法(MTT法)检测与不同材料共培养的细胞增殖情况。于共培养1，4，7，11 d，吸弃培养板中原有培养基，加入MTT溶液。孵育4 h以后弃上清液，加入450 μL二甲基亚砜震荡5 min，另孵育30 min，再次震荡使溶液混合均匀。将溶液移至96孔板中，使用酶标仪在490 nm波长下测定吸光度值。

1.5 主要观察指标经微弧氧化后，钛合金支架表面形貌、接触角、粗糙度及表面成分的变化；经微弧氧化前后，钛合金支架与骨髓间充质干细胞共培养后，细胞在不同支架上的黏附形态、活性、增殖及分化差异。

1.6 统计学分析采用SPSS 10.0统计学软件对实验数据进行处理，结果以x(_)±s表示，并用Origin 8.5软件进行绘图。采用单因素方差(t-Student)分析。P < 0.05即表示差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

讨论

与骨组织形成稳定的“骨结合”是确保种植体植入后实现修复远期成功的先决条件^[28]。利用3D打印的方法可快速制备不同形状的多孔植入体，通过对孔隙率、孔径、孔形貌的调整可协调其密度、强度和弹性模量，实现与被替换骨组织的力学性能相匹配。前期研究中，Li等^[5，29]制备了不同密度的均匀菱形十二面体结构Ti6Al4V多孔材料，发现多孔支架的疲劳强度随其相对密度的增大而提高，孔隙率随密度的增高而减小。采用该支架进行骨修复实验研究^[30]，植入3个月结果表明，电子束熔炼技术技术制备钛合金支架有很好的力学性能和生物相容性，治疗绵羊早期踝坏死有效，长期疗效还需进一步观察。Li等进一步在微弧氧化和热处理结合的表面活化处理工艺中，考察了不同电解液组成、电解液温度、电压电流、氧化时间、频率等对表面涂层的影响，研究发现微弧氧化涂层与支架基体有良好的结合力，强度为20-30 MPa；同时，当膜厚小于20 μm(氧化时间小于10 min)，覆盖微弧氧化膜的样品与未表面改性的基体支架相比，疲劳降低≤5%，经微弧氧化处理的样品与未改性支架相比依然具有良好的力学性能。此次实验在李述军等优化工艺、制备支架及微弧氧化涂层的基础上，主要对比探讨不同支架的表面涂层特性对骨髓基质干细胞增殖和分化的影响，以期为后续动物实验的开展提供参考。

表面改性处理来提高种植体的骨结合能力，主要是通过改变材料表面的化学成分或组织结构的方式，增加了材料与骨的结合面积，实现了与骨的化学结合^[31]。通过微弧氧化工艺对钛合金表面改性处理时，表面局部温度可达到 2 000-5 000 ℃，表面形成致密涂层结构稳定性强^[32]。微弧氧化处理后的钛合金其耐磨、耐蚀等性能得到明显改善，同时可抑制有害金属元素在种植体周围的释放，提高其生物相容性^[33]。另外，其微观尺度的表面多孔结构和涂层的化学成分可通过改变电解液的成分或氧化电压、时间(氧化时间、电压)、频率等电化学参数来进行相对便捷的调整^[34-36]。以往研究表明，种植体表面的化学成分、形貌及粗糙度等对其表面共培养细胞的早期黏附、增殖和分化起着非常重要的作用^[37-38]，但这些研究均集中于平板材料的表面涂层改性。骨结构是三维支架组织，应用于骨组织功能修复和改善的3D打印钛合金支架，其主体结构为三维空间架构，细胞和组织的生长空间也是立体空间。因此，探讨微弧氧化改性表面的钛合金支架的三维空间及其微表面对骨类(成骨类)细胞，尤其是骨髓干细胞(间充质干细胞)的黏附、增殖和分化的影响极其重要。

由微弧氧化涂层表面成分分析结果显示，以锐钛矿型TiO₂为主，伴有少量的金红石相。金红石和锐钛矿均是TiO₂的同素异构体，其中锐钛矿为室温稳定相，合成的金红石和锐钛矿，在温度更高的条件下锐钛矿会转化为热力学更稳定的金红石。郭宝刚等^[39]考察了氧化时间对微弧氧化膜结构与性能的影响，发现随氧化时间的延长，金红石相的比例增大。微弧氧化涂层中的孔隙率与大小与氧化过程中产生的氧气量有关^[40]。经微弧氧化后钛合金膜层微孔表面及宏观结构呈现多级孔洞结构，该结构一方面有利于磷等成骨元素的附着，另一方面也有利于骨组织的机械嵌合^[41]。

此外，微弧氧化改性表面的样品，表面膜层粗糙度轮廓算术平均偏差Ra值为(14.91±1.29) μm，也明显大于未处理样品的Ra值(12.31±1.46) μm。Kunzler等^[42]研究发现随着种植体表面粗糙度的上升，与骨结合的表面积也在增大，也有利于细胞增殖率的提高增加。微弧氧化处理后还改变了表面接触角的大小，对后续实验中细胞在材料表面伸展形态亦有一定影响。

骨髓间充质干细胞是近年来细胞学研究中应用最广泛的一种成体干细胞，具有能较灵敏地感应到材料表面微形貌和基质成分的不同，产生相应的细胞形态变化。在微弧氧化处理的支架表面，细胞突出支架表面明显，肌动蛋白微丝网络结构清晰可辨，细胞骨架构象立体，形态多样，含有大量的多角星形细胞，伴有柱状伪足延伸，形成锚状结构牢固地黏附于材料表面，细胞外基质中也有丝状纤维相互连接，丰富的胞浆和立体结构有助于干细胞趋于成骨分化。而在相对光滑的未改性支架表面上黏附生长时，细胞需伸展出肌动蛋白纤维，才能稳定于材料表面，由于应力纤维的强力伸展，细胞被施加一定张力，呈扁平状铺延生长的形态，细胞外基质较少，培养后期抑制生长明显。另外，在微弧氧化改性支架相对粗糙的表面上，骨髓间充质干细胞以分泌功能的细胞形态呈现，可更好地促进细胞外类骨基质的形成和矿化，促进种植体植入后的骨整合。

碱性磷酸酶活性是成骨细胞早期分化的标志，是骨形成、代谢和再生等过程中的重要酶，其作用是水解有机磷释放出无机磷，促进骨无机矿物成分生物磷灰石的形成，有利于矿物盐的沉积。骨钙素是由骨类细胞合成分泌的一种重要非胶原蛋白，是一种维生素K依赖酶修饰的骨基质蛋白，它能准确反映成骨细胞的成骨功能^[43]。骨钙素水平灵敏地反映骨组织的转换，是代表代谢瞬间变化的特异性生化指标。矿物质的沉积与骨细胞数目呈正相关关系，该指标出现在成骨细胞分化的末期阶段^[44]。在微弧氧化改性处理支架上的细胞有更多的分泌碱性磷酸酶和骨钙素，也说明经过微弧氧化处理的材料可以诱导骨髓间充质干细胞更多向成骨方向分化。研究结果表明，微弧氧化改性支架促进了骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶和骨钙素的表达，实现更多的细胞黏附增殖，可望协调碱性磷酸酶水解有机磷和骨钙素与钙的结合，进一步促进骨髓基质干细胞分化，通过调节类骨磷灰石晶体的生长，实现细胞外基质的沉积，有助于支架植入后骨结合的形成。与丁思阳等^[45]纯钛片材研究结果类似，微弧氧化处理后在表面形成的多孔复合形态，不仅能促进成骨细胞的增殖及分化，还显著提高了成骨细胞的成骨相关蛋白表达和增殖。

以上对比实验结果表明，经微弧氧化处理后的钛合金支架具有多级孔隙结构，其微孔结构和表面生物活性物质赋予了支架更优的细胞活性和分化特性，黏附生长的细胞呈胞浆丰满的立体三维结构，其增殖和成骨分化表型均优于未处理钛合金支架。微弧氧化改性后的钛合金支架表面对骨细胞具有较强的吸附和增殖能力，主要有以下两方面原因：第一，微弧氧化处理的钛合金多级支架结构更有利于细胞的黏附和增殖，一级宏观大孔结构可供细胞进入，营养和废物顺利进出，其表面具特征性的火山口样的二级微孔结构利于细胞攀爬，向内延伸的内孔结构利于成骨细胞的伪足伸入和黏附增殖；第二，经微弧氧化处理后钛合金支架表面，其氧化涂层内含有更多量的磷元素，可化学诱导成骨分化。实验从细胞微结构水平初步证实微弧氧化表面可维持细胞骨架的立体三维基本形态，有利于保持细胞活性，并探讨了支架微结构和表面成分是细胞生物学特性的主要影响因素，但对于对细胞活性影响的黏附作用机制尚未深入，仍需从分子水平及体内实验进一步探讨。在此次实验微弧氧化工艺参数下改性的钛合金支架，可进一步推广应用于骨组织修复研究，以改善钛合金植入体的离子溶蚀和长期植入后松脱问题。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

微弧氧化涂层改性对3D打印钛合金支架细胞生物学的影响

Cytobiological effect of micro-arc oxidation coating on 3D-printed titanium alloy scaffold

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