脐血间充质干细胞联合单倍体造血干细胞移植治疗再生障碍性贫血

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0663

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
单倍体造血干细胞移植：即供受者有一半的HLA位点相同，曾因为高排斥率、高抗宿主病、高感染率以及低生存率被认为是“临床禁区”。近10年，随着研究者们不断探索，在粒细胞刺激因子动员诱导免疫耐受的基础上，在预处理方案中加用抗人胸腺细胞球蛋白体内去T细胞，形成了“单倍体移植方案”，随着后期在复发、感染的防治、移植物抗宿主病的预防、供者的优化选择等方面的不断改进，取得了不亚于全相合造血干细胞移植的效果。
间充质干细胞联合造血干细胞移植：间充质干细胞是一种具有自我复制能力和多向分化潜能的干细胞，其能够与造血干细胞相互作用，提供造血干细胞生长所需的基质及生长因子，还能调节机体的免疫功能，抑制免疫排斥反应，促进免疫重建。中国已批准间充质干细胞可以用来促进恢复造血，与造血干细胞共移植提高白血病和难治性贫血等疾病的治愈率。

摘要
背景：目前再生障碍性贫血的主要治疗方案为免疫抑制治疗或造血干细胞移植。近年来随着造血干细胞移植技术的提高，HLA单倍体相合的异基因造血干细胞越来越多的应用于再生障碍性贫血的治疗。间充质干细胞是一种多能干细胞，能够与造血干细胞相互作用，提供造血干细胞生长所需的基质及生长因子。此外，还通过调节机体的免疫功能，抑制免疫排斥反应，促进免疫重建。
目的：观察脐血间充质干细胞联合HLA单倍体相合造血干细胞移植治疗重型再生障碍性贫血的疗效及安全性。
方法：自2015年4月至2017年11月采用HLA单倍体相合的骨髓及外周血造血干细胞移植治疗重型再生障碍性贫血患者6例。移植预处理方案采用氟达拉滨+环磷酰胺+兔抗人胸腺细胞球蛋白。移植物采用骨髓联合外周血干细胞，回输骨髓干细胞前6 h输注脐血间充质干细胞。移植物抗宿主病预防采用环孢素、短程甲氨蝶呤联合吗替麦考酚酯方案。
结果与结论：①6例患者中有1例于移植后+102 d死于重症感染，中性粒细胞于+48 d植活，血小板未植活。余5例无病生存，平均中性粒细胞植活时间为+11 d，平均血小板植活时间为+21 d；②6例患者中2例发生Ⅰ，Ⅱ度的移植物抗宿主病，3例巨细胞病毒血症，1例EB病毒感染；③结果表明，对于难治性、重型再障患者缺乏HLA全相合的亲缘及非亲缘供者时，脐血间充质干细胞联合单倍体造血干细胞移植可作为治疗的另一种选择值得探索。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0001-9014-1023(任娟)

关键词: 再生障碍性贫血, 单倍体, 造血干细胞移植, 间充质干细胞, 干细胞, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Nowadays the main therapy for severe aplastic anemia is immunosuppressive therapy or hematopoietic stem cell transplantation. With the development of hematopoietic stem cell transplantation technique, HLA-haploidentical hematopoietic stem cell transplantation is popularly used in the treatment of aplastic anemia. Mesenchymal stem cells as pluripotent stem cells can provide hematopoietic stem cells with ground substance and growth factors by interaction with hematopoietic stem cells in bone marrow. In addition, mesenchymal stem cells can inhibit the immunologic rejection and promote the immune reconstruction by regulating the immune function of the body.
OBJECTIVE: To explore the efficacy and safety of co-transplantation of umbilical cord blood mesenchymal stem cells and HLA-haploidentical hematopoietic stem cells for the treatment of severe aplastic anemia.
METHODS: From April 2015 to November 2017, six patients with severe aplastic anemia received fludarabine, cyclophosphamide and antithymocyte globilin as preconditioning before transplantation of HLA-haploidentical hematopoietic stem cells from the bone marrow and peripheral blood. Umbilical cord blood mesenchymal stem cells were infused before re-infusion of mobilized peripheral blood and bone marrow stem cells. Prophylaxis for graft-versus-host disease consisted of cyclosporine-A, short-course methotrexate as well as mycophenolate mofetil in patients.
RESULTS AND CONCLUSION: One of six cases died of severe infection at +102 days after transplantation, with neutrophil engraftment at +48 days, and platelets were not engrafted until died. The remaining five cases were in disease-free survival with the median neutrophil engraftment at +11 days, and the median platelet engraftment at +21 days after transplantation. Grade I to II acute graft-versus-host disease was observed in the two of six patients, and cytomegalovirus viremia in three patients as well as epstein-barr virus infection in one patient. Co-transplantation of umbilical cord blood mesenchymal stem cells and haploidentical hematopoietic stem cells can be a choice for refractory severe aplastic anemia without HLA-matched related or unrelated donor, which is worth exploring in the future.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Anemia, Aplastic, Hematopoietic Stem Cell Transplantation, Mesenchymal Stem Cell Transplantation, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

任娟，赵娟，王晓宁. 脐血间充质干细胞联合单倍体造血干细胞移植治疗再生障碍性贫血[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(33): 5297-5302.

Ren Juan, Zhao Juan, Wang Xiao-ning. Co-transplantation of umbilical cord blood mesenchymal stem cells and haploidentical hematopoietic stem cells for treatment of severe aplastic anemia[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(33): 5297-5302.

图/表（结果） 1

2.1 造血重建 6例患者，中性粒细胞植活时间分别为+11 d，+41 d，+11 d，+10 d，+11 d，+12 d，平均植入时间+18 d；病例2血小板植入不良，病例1，3，4，5，6血小板植活时间依次为+21 d，+19 d，+24 d，+18 d，+23 d，平均植入时间为+21 d。

2.2 移植相关并发症 病例2白细胞植活阶段肺部感染，导致植入时间延长，后发展为重症肺炎，联合抗感染治疗中病情反反复复，+48 d出现巨细胞病毒血症，更昔洛韦抗病毒治疗后转阴，+54 d EB病毒感染，无淋巴结肿大，美罗华375 mg/m²，每周1次，2次后转阴，+102 d死于重症感染。余5例患者中有2例出现感染性发热，联合抗感染治疗后发热逐渐控制。此外，病例3、病例5分别于+28 d，+38 d出现巨细胞病毒血症，更昔洛韦抗病毒治疗后转阴。病例6于+31 d出现Ⅱ度出血性膀胱炎，给予水化、碱化尿液等对症支持治疗后逐渐恢复。

2.3 移植物抗宿主病 依据格鲁兹堡分级标准。病例3于+17 d出现Ⅰ度急性移植物抗宿主病(皮肤)，给予甲强龙1 mg/kg治疗后好转。病例4于+21 d出现Ⅱ度急性移植物抗宿主病(皮肤、胃肠)，给予甲强龙1 mg/kg+巴利昔单抗(舒莱)20 mg第1，3，8天治疗后好转。余病例无明显的急性移植物抗宿主病发生。

2.4 嵌合状态 病例2移植后+28 d时为63.3%供者嵌合率；+55 d时为100%供者型完全嵌合状态。余病例移植后+1至3个月检测均为100%供者型完全嵌合状态。

2.5 疾病转归及随访 病例2在+102 d死于重症感染。余5例患者随访时间4-30个月，中位随访时间18个月，其中3例患者已停用环孢素，1例环孢素减量中，4例患者血象、骨髓象均正常；1例患者血小板偏低，波动于(40-80)×10⁹L^-1。

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引言

再生障碍性贫血(以下简称再障)是一种典型的骨髓衰竭性疾病，以骨髓造血功能衰竭为特征，表现为外周血全血细胞减少。根据外周血细胞减少的程度可分为重型再障和非重型再障。重型再障患者预后较差，多因全血细胞减少继发的感染、出血等并发症而危及生命。

目前认为异常活化的T淋巴细胞是造成造血干/祖细胞损伤，导致再障发生的“元凶”^[1-3]。此外，遗传背景在再障的发生中也可能起到一定的作用，如端粒酶基因的缺失、某些体细胞的突变等^[4]。基于上述发病机制，现阶段重型再障的主要治疗手段为免疫抑制治疗(immunosuppressive therapy，IST)或异基因造血干细胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT)。免疫抑制治疗的目的在于通过抑制异常活化的T细胞，避免造血组织的进一步损伤，促进受损的造血干/祖细胞恢复造血。目前常用的免疫抑制剂为抗人胸腺细胞球蛋白/抗人淋巴细胞球蛋白(ATG/ALG)和环孢素A，两者联合用药治疗再障有效率可达60%-80%^[5-6]。但免疫抑制治疗存在许多不足之处，如起效慢，通常起效时间在6-9个月，个别病例3个月起效，也就意味着至少需要观察3-6个月方能评估疗效，在此期间，需频繁输注血制品支持治疗，不少患者出现铁负荷过载、产生抗血小板抗体等。此外，仍有30%左右的患者免疫治疗无效或治疗后复发^[6]，甚至继发恶性克隆性血液学改变，发展成为阵发性睡眠性血红蛋白尿、骨髓增生异常综合征、白血病等^[7]。另一种主要治疗手段是异基因造血干细胞移植，该方案通过补充和替代数量减少及受损的造血干细胞，重建免疫系统从而达到治疗重型再障的目的，其5年生存率为70%-80%，甚至>90%，克隆性血液学异常发生少^[8-9]。目前对于年龄<35岁，有HLA全相合同胞供者首选异基因造血干细胞移植。但同胞间HLA全相合的概率只有25%，随着独生子女的增加，HLA相合的概率进一步减少，限制了同胞全相合造血干细胞移植在临床上的应用。近年来，造血干细胞技术在不断探索中取得了长足的进步，建立了非体外去T细胞的单倍体异基因造血干细胞移植体系，该体系广泛用于治疗恶性血液病，取得了不亚于全相合移植的疗效^[10-13]。由于再障患者骨髓微环境差，增加了移植物植入的难度，且长期贫血，脏器耐受性差。此外，细胞免疫系统紊乱以及输血依赖，增加了移植物抗宿主病的发生率^[14-16]。因此，目前各移植中心对于再障的半相合造血干细胞移植尚处于探索阶段，未形成成熟的移植模式。如何提高植入成功率、降低移植物抗宿主病发生率成为再障患者HLA单倍型相合移植成功的重点。

借鉴国内外同行的经验，西安交通大学第一附属医院血液科对6例重型再障患者进行了HLA单倍型相合异基因造血干细胞移植治疗，获得了5例无病存活、1例死亡(死于继发感染)的疗效，现在此进行经验总结，目的在于进一步探讨新的移植模式治疗重型再障的安全性及可行性。

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材料方法

1.1 设计 回顾性病例分析。

1.2 时间及地点 于2015年4月至2017年11月在西安交通大学第一附属医院完成。

1.3 对象 纳入6例重型再障患者(表1)，男4例，女2例。纳入标准：①诊断标准参照张之南等^[17]《血液病诊断及疗效标准》(第3版)；②有造血干细胞移植指征，无合适的HLA全相合供者；③行单倍体异基因造血干细胞移植患者。

1.4 方法

1.4.1 预处理方案 氟达拉滨(Flu)30 mg/(m²·d)(-5 d至-2 d)；环磷酰胺(CTX)30 mg/(kg·d)(-5 d至-2 d)；兔抗人胸腺细胞球蛋白(ATG)2.5 mg/(kg·d)(-5 d至-2 d)。

1.4.2 供者骨髓及外周血单个核细胞动员及采集 在受者(患者)预处理的-3 d开始给予供者粒细胞集落刺激因子10 μg/(kg·d)动员造血干细胞，共5 d，动员第4天，即患者预处理结束1 d后，从供者双侧髂后上棘采集骨髓血10-15 mL/kg计数后回输。6例患者中，4例供受者ABO及RHD血型一致，骨髓血直接静脉回输于患者，1例患者供受者血型次要不合，进行了去浆处理，另1例患者供受者血型主要不合，进行了去红细胞处理后静脉回输于患者。动员第5天，通过COPEⅡ代血细胞分离机采集供者外周血造血干细胞，计数并静脉回输于患者。输注单个核细胞数及CD34⁺细胞数见表2，输注前给予地塞米松、葡萄糖酸钙、异丙嗪预防性抗过敏处理。

1.4.3 移植物抗宿主病预防 环孢素A+甲氨蝶呤+吗替麦考酚酯方案。环孢素A 1.25 mg/kg，每12 h 1次，-7 d开始，维持血药浓度在(150-250) ng/L，如无急性移植物抗宿主病，+12个月后逐渐减量，1年半减停；吗替麦考酚酯500 mg，2次/d，-1 d开始，+1个月减半，+1.5个月停用；甲氨蝶呤15 mg/m²(+1 d)，10 mg/m²(+3 d，+6 d，+11 d)；甲强龙1 mg/(kg·d)围绕造血重建期。

1.4.4 间充质干细胞输注 输注供者骨髓干细胞前6 h输注脐血来源间充质干细胞1×10⁶/kg(山东脐血库提供成品)，输注前常规给予地塞米松、异丙嗪预防性抗过敏处理，输注时间30 min(80-100 mL)。间充质干细胞的使用获得相关上级单位的批准和家属的同意。

1.4.5 支持及并发症预防治疗 ①支持治疗：血红蛋白低于70 g/L时配输红细胞悬液纠正贫血，血小板低于20×10⁹ L^-1或有出血表现时配输机采血小板预防出血，为减少异基因造血干细胞移植后相关的移植物抗宿主病，红细胞悬液及机采血小板均经25 Gy Co照射；②肝静脉闭塞综合征预防：前列腺素E 10 μg/d，+1个月停用；③病毒感染预防：阿昔洛韦0.4 g，2次/d，停用免疫抑制剂后停药，如出现巨细胞病毒血症，在此期间根据患者情况更换为更昔洛韦/膦甲酸钠；④真菌感染预防：氟康唑200 mg，1次/d，回输后改为卡泊芬净50 mg，1次/d，移植后肠道功能恢复，酌情选用伏立康唑/伊曲康唑/泊沙康唑口服制剂，无特殊感染情况，+2.5个月时停用；⑤感染预防：肠道除菌。诺氟沙星200 mg，3次/d，盐酸小檗碱片0.3 g，3次/d，白细胞植活后即停用；预处理期间哌拉西林6 g，每12 h 1次，如出现发热按粒细胞缺乏伴发热处理；⑥卡氏肺孢子虫感染预防：复方新诺明0.96 g，2次/d，+1个月后改为每周二、五服药。

1.4.6 植活检测 连续3 d中性粒细胞计数≥ 0.5×10⁹ L^-1为白细胞植活；连续7 d血小板计数≥20×10⁹ L^-1并脱离血小板输注为血小板植活。

1.4.7 嵌合状态检测 +30 d，+60 d，+90 d采用短串联重复序列STR-PCR检测嵌合状态。

1.5 主要观察指标 造血重建时间、移植相关并发症、移植物抗宿主病、嵌合状态、疾病转归。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

异基因造血干细胞移植是治疗再障的主要手段之一，能够达到疾病治愈的目的，减少复发及克隆性改变。在中国，由于独生子女家庭较多，HLA血缘全相合比例不到30%，非血缘关系的人群中，HLA相合的概率小于1/10万，制约了血缘全相合造血干细胞移植的临床应用。近年来，HLA单倍型相合的异基因造血干细胞移植被广泛用于治疗恶性血液病，取得了良好的效果。由于再障患者骨髓微环境差，移植物植入难度大，长期贫血，多脏器储备功能减低，对预处理耐受性较差，且多数重症患者呈输血依赖，反复输注血制品引起的免疫改变增加了移植物抗宿主病的发生率^[14-16]，上述因素使得再生障碍性贫血半相合造血干细胞移植难度系数增加。因此，如何减少预处理的毒副作用、提高植入成功率、降低移植物抗宿主病发生率，成为再障患者单倍体相合移植成功的重点。

该研究入选的6例重型再障患者半相合造血干细胞移植获得了5例无病存活的疗效，有效率83%，5例患者均脱离输血依赖，造血重建时间与目前各中心报道的再障全相合造血干细胞移植时间接近。现将再障患者半相合造血干细胞移植特点总结如下：①预处理方案的选择：减小了环磷酰胺的剂量，加入了氟达拉滨；②回输前输注间充质干细胞改善骨髓微环境；③移植物采用骨髓联合外周血，增加回输的单个核细胞数及CD34⁺细胞数；④造血重建期给予小剂量甲强龙抑制免疫反应；⑤延长环孢素使用时间，减少移植物抗宿主病的发生。

再障是非恶性克隆性血液病，其预处理方案的重点不在于清除恶性克隆，而在于免疫抑制，一方面抑制“疯狂”活化的T细胞；另一方面抑制免疫系统对“植入物”的排斥，以保证“移植物”的顺利植入。最常用的预处理药物为环磷酰胺±抗胸腺球蛋白^[18]。单用环磷酰胺植入失败率大于10%，加入抗胸腺球蛋白不仅可以抑制免疫系统，保障稳定植入，还可以清除体内以及移植物中T细胞，降低疾病复发及移植物抗宿主病风险，但增加了感染的风险。氟达拉滨对淋巴细胞具有高度的选择性，是一种强效免疫抑制剂。近年来一些初步的结论显示，加入氟达拉滨预处理可能有利于改善预后。George教授通过14例重型再障患者证实相对于既往以环孢素/抗胸腺球蛋白为预处理方案，氟达拉滨联合环磷酰胺±抗胸腺细胞球蛋白的预处理方案提高了患者的总生存和无时间生存率^[19]。作者所在移植中心在预处理方案选择方面加入了氟达拉滨30 mg/m²，同时将环磷酰胺减剂量为30 mg/kg，结果显示患者耐受性良好，预处理期间无不良事件发生，6例患者异基因干细胞均全部植入。

间充质干细胞是一种具有自我复制能力和多向分化潜能的成体干细胞。骨髓中的间充质干细胞能够与造血干细胞交互作用，提供造血干细胞生长所需的基质及生长因子。此外，还通过影响机体免疫反应，调节机体的免疫功能，抑制免疫排斥反应，促进免疫重建。间充质干细胞广泛存在于机体的不同组织中，可在体外分离、扩增。中国已批准间充质干细胞可以用来促进恢复造血，与造血干细胞共移植能够提高白血病和难治性贫血等疾病的治愈率。英国一项动物实验结果显示应用脐血间充质干细胞明显降低了移植物抗宿主病发生率^[20]。国内外相关的临床研究也显示间充质干细胞联合造血干细胞移植，其造血恢复快，急性移植物抗宿主病发生率较低^[21-22]。国内解放军总医院第一附属医院应用脐血间充质干细胞联合单倍体造血干细胞联合治疗30例难治、复发或高危恶性血液病患者，也取得了良好效果^[23]。目前在clinical trial上有40余项注册关于间充质干细胞应用于造血干细胞移植的临床研究，已完成的几项临床研究均显示在间充质干细胞应用期间无不良反应及输注相关风险，患者耐受性良好。基于上述理论及实践经验，作者所在移植中心在回输骨髓造血干细胞前6 h给予输注脐血间充质干细胞，输注后未发生不良事件，除去死亡病例，余5例中性粒细胞植活时间为+10 d至+12 d，平均中性粒细胞植活时间+11 d，血小板植活时间为+18 d至+24 d，平均植活时间+21 d，提示再障半相合移植造血重建时间不差于全相合造血干细胞移植，但病例数尚少，还需进一步临床实践证实其可靠性。

国外多中心研究显示再障患者外周血干细胞移植比较骨髓干细胞移植的移植物抗宿主病发生率高，效果差^[24-28]，可能是由于动员后的外周血造血干细胞含有更多的T细胞(可达骨髓中的10倍以上)，故存在较高移植物抗宿主病发生率^[28]。再障患者骨髓微环境受损，骨髓干细胞含有更多基质细胞成分，对于修复受损的造血微环境有利^[29-30]，但骨髓造血干细胞数量有限，很难取得足够的骨髓干细胞，而外周血造血干细胞采集相对便捷，容易获取，且采集数量大，采用单细胞分离技术，对供者血容量及血细胞影响小，移植后造血重建较快。作者所在移植中心采取了骨髓联合外周血造血干细胞移植，结合了2种不同来源移植物的优势，一方面可改善、修复骨髓微环境，促进植入，另一方面补充足够的造血干细胞，促进造血恢复。就此6例患者来说，效果满意。此外，增加了输注的单个核细胞及CD34⁺细胞数(平均单个核细胞10.09×10⁸/kg；CD34⁺细胞5.5×10⁶/kg)，即播种了较多的种子，增加了植活的概率。

目前针对造血重建期是否应用激素存在争议，一方面，造血重建过程应用小剂量激素可减少植入综合征的发生，促进植活；另一方面，激素增加了感染的风险。作者考虑到白细胞早植活，从另一个角度来说也能减少感染的概率及力度，故在造血重建期，给予甲强龙1 mg/(kg·d)。6例患者中有3例发生感染，2例经强效、联合抗感染得以控制，1例感染反复、迁延，最终死于重症感染。所有患者均无植入综合征发生。总结经验，造血重建期是否应用小剂量激素需根据患者情况，因地施宜。

移植物抗宿主病是半相合异基因造血干细胞移植后的一个主要并发症。受多种因素影响，如HLA位点不合的程度、供受者性别不合、预处理方案的强度、急性移植物抗宿主病预处理方案等。北京大学血液病研究资料显示，清髓预处理方案下，单倍体与同胞全相合骨髓联合外周血造血干细胞移植比较，总体移植物抗宿主病发生率相似。单倍体移植后Ⅱ-Ⅳ级和Ⅲ-Ⅳ急性移植物抗宿主病发生率分别为55%和23.1%。由于再障本身系非恶性克隆性疾病，与移植物抗宿主病相伴随的移植物抗白血病效应相对无需强调，故移植物抗宿主病的预防及处理可以更为积极。作者所在移植中心采用目前经典的移植物抗宿主病预防方案：环孢素、短程甲氨蝶呤联合吗替麦考酚酯，将环孢素延长至1年后减量，1年内维持其血药浓度在有效范围内(150-250 ng/L)。在回顾的6例患者中2例发生了Ⅰ-Ⅱ度急性移植物抗宿主病，抗移植物抗宿主病治疗后好转，无明显的慢性移植物抗宿主病发生。但由于病例数太少，还不足以说明该移植方案降低了移植物抗宿主病发生率，尚待临床进一步总结、验证。

回顾6例患者的移植过程，总结如下：①再障患者长期处于粒细胞缺乏状态，易出现各种潜在感染，在移植期间，这些潜在的感染灶可能成为影响移植成功的重要因素。重症感染可引起植入失败，也可以导致已植入的干细胞再次被排斥。如何有效的预防及治疗感染是再障患者移植的一个重要环节；②目前多项研究证实供者特异性抗HLA抗体(DSA)与植入不良密切先关^[31-32]，6例患者有4例在移植前未行DSA检测(包括死亡病例)。今后的工作中，已将DSA作为移植前常规检测。

综上所述，研究观察病例数少，但结果表明氟达拉滨、兔抗人胸腺细胞球蛋白及环磷酰胺联合的预处理方案，能够达到安全有效的免疫抑制状态，保障稳定植入、降低后期移植物抗宿主病风险，间充质干细胞配合骨髓+外周血干细胞移植能够改善骨髓微环境，促进植入，且进一步降低移植物抗宿主病发生率。对于难治性、重型再障患者、免疫抑制治疗无效或复发、无HLA全相合供者，单倍体造血干细胞移植可作为一种治疗选择，值得更进一步探索。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程