深低温冷冻保存血小板的最佳温度及时限

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0642

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (33): 5368-5372.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0642

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深低温冷冻保存血小板的最佳温度及时限

杨振宇¹，李正发²，付凌梅¹，朱祥明¹

¹云南昆明血液中心，云南省昆明市 650106；²云南省第一人民医院，云南省昆明市 650000)

修回日期:2018-05-31 出版日期:2018-11-28 发布日期:2018-11-28
通讯作者: 李正发，教授，硕士生导师，云南省第一人民医院，云南省昆明市 650000
作者简介:杨振宇，男，1979年生，云南省昆明市人，2017年昆明理工大学毕业，硕士，副主任技师，主要从事成分输血技术研究与管理。
基金资助:
云南省第一人民医院奥新基金项目(2014DS006)

Optimal temperature and storage time span for cryopreservation of platelets

Yang Zhen-yu¹, Li Zheng-fa², Fu Ling-mei¹, Zhu Xiang-ming¹

¹Yunnan Kunming Blood Center, Kunming 650106, Yunnan Province, China; ²the First People’s Hospital of Yunnan Province, Kunming 650000, Yunnan Province, China

Revised:2018-05-31 Online:2018-11-28 Published:2018-11-28
Contact: Li Zheng-fa, Professor, Master’s supervisor, the First People’s Hospital of Yunnan Province, Kunming 650000, Yunnan Province, China
About author:Yang Zhen-yu, Master, Associate chief technician, Yunnan Kunming Blood Center, Kunming 650106, Yunnan Province, China
Supported by:
the Aoxin Foundation of Yunnan Provincial First People’s Hospital, No. 2014DS006

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
保存时限：机采血小板常规保存时间最多为5 d，从献血员的招募、采集、检验等到供应临床需要两三天，也就是说，它的真正使用时间只有约2 d，如不能及时用于临床将造成过期浪费，因此临床上机采血小板供应比较紧张。冰冻血小板为临床血小板的使用提供了新的思路，也能有效解决这一矛盾。
保存温度：机采血小板的保存温度为(22±2) ℃，在这一温度下，最多只能保存5 d，且存在细菌污染的风险，程序降温、超低温(-179 ℃)液氮冻存细胞是维持细胞生物活性、功能的最理想方法，但不适合存量较大 (250 mL左右)的血小板冻存，因此-80 ℃深低温冰箱冻存是冰冻血小板较理想的保存方法。

摘要
背景：临床对血小板的需求量急剧增加，新鲜液态血小板无法保障临床需求，特别是特殊血型、急诊患者和偏远地区的需求。
目的：探讨用5%二甲基亚砜深低温冰冻保存血小板的最佳保存温度、时限及复融后的最佳使用时间。
方法：选择16个机采血小板标本，对冰冻前及在-18 ℃、-40 ℃、-80 ℃冰冻保存1，3，6，12个月、冻融后即刻、冻融后1，2，4 h进行相关指标检测，包括血小板计数、平均血小板体积、血小板分布宽度、CD42b和CD62p表达。
结果与结论：①-80 ℃冰冻保存6个月血小板的CD62p表达、冰冻保存12个月血小板的CD42b、CD62p表达分别与冰冻前比较差异有显著性意义(P < 0.05)；②-18 ℃、-40 ℃冰冻保存6个月血小板的CD42b、CD62p表达与-80 ℃相比差异均有显著性意义(P < 0.05)；③-80 ℃冰冻保存6个月复融后4 h CD42b、CD62p表达与复融后即刻相比差异有显著性意义(P < 0.05)；④结果表明5%二甲基亚砜冰冻保存血小板在越低的温度下保存越好；推荐保存条件为-80 ℃、6个月内；解冻后的最佳使用时间为2 h内。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-2820-8562(杨振宇)

关键词: 血小板, 低温冰冻保存, 保存温度, 保存时限, 二甲基亚砜, 复融, CD42b, CD62p, 干细胞

Abstract:

BACKGROUND: Clinical demand of fresh liquid platelets cannot be guaranteed because of the rapid increase of the need of platelets, especially for the specific blood types, emergency patients and remote areas.
OBJECTIVE: To explore the optimal temperature and storage time span for deep cryopreservation of platelets in 5% dimethyl sulfoxide as well as the optimal usage time after melting of the frozen platelets.
METHODS: Sixteen platelet samples filtered by the machine were randomly selected. Indexes as blood platelet count, mean platelet volume, platelet distribution width, CD42b, CD62p were separately tested before and 1, 3, 6, 12 months after cryopreservation at three different temperatures of -18, -40, and -80 ℃ as well as immediately, 1, 2, 4 hours after melting.
RESULTS AND CONCLUSION: Significant changes were found in the expression of CD62p in the platelets at 6 and 12 months after cryopreservation at -80 ℃ and the expression of CD42b in the platelets at 6 months after cryopreservation at -80 ℃ (P < 0.05). The expression of CD42b and CD62p showed a significant difference in the platelets stored at -80 ℃ and at -18 and -40 ℃ for 6 months (P < 0.05). For the platelets stored at -80 ℃ for 6 months, the expression of CD42b and CD62p in the platelets at 4 hours after melting was significantly different from that immediately after melting (P < 0.05). These findings reveal that the lower temperature indicates the better cryopreservation of platelets using 5% dimethyl sulfoxide. The recommended storage conditions are -80 ℃ for 6 months; and the optimal usage time after melting is within 2 hours.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Blood Platelets, Cryopreservation, Dimethyl Sulfoxide, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

杨振宇，李正发，付凌梅，朱祥明. 深低温冷冻保存血小板的最佳温度及时限[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(33): 5368-5372.

Yang Zhen-yu, Li Zheng-fa, Fu Ling-mei, Zhu Xiang-ming. Optimal temperature and storage time span for cryopreservation of platelets[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(33): 5368-5372.

图/表（结果） 3

该研究对不同保存条件、不同保存时间、复融后不同时间均进行了比较，但因在数据统计过程中发现数据量太大，涉及数据的分组、亚组、亚组中又有分组，表达过于复杂，固采用递推之后的结论，包括对最佳保存温度、保存时限、复融后的最佳使用时间的确定也是通过该方法。例如，统计分析时先依次对冰冻后12，6，3，1个月的指标与冰冻前比较，发现到6个月时已与冰冻前差异无显著性意义，故1，3个月就不再进行叙述；在找到最佳保存期限后，再进行最佳温度的比较。

2.1 最佳保存时限 冰冻保存于最低温度-80 ℃时，依次用冰冻后1，3，6，12个月的4个指标(血小板回收率、平均血小板体积增加值、CD42b和CD62p表达)与血小板冰冻前的4个指标进行比较，见表1。

冰冻保存6个月血小板的CD62p表达、冰冻保存12个月血小板的CD42b、CD62p表达分别与冰冻前比较差异有显著性意义(P < 0.05)，得出最佳保存期限为6个月。

2.2 最佳保存温度 冰冻6个月时，血小板冰冻保存在 -18 ℃、-40 ℃时的4个指标(血小板回收率、平均血小板体积增加值、CD42b和CD62p表达)与冰冻保存在-80 ℃时比较，见表2。

冰冻保存在-18 ℃、-40 ℃的血小板CD42b、CD62p表达与-80 ℃相比差异均有显著性意义 (P < 0.05)，得出最佳保存温度为-80 ℃。

2.3 复融后最佳使用时间 冰冻保存在-80 ℃，保存6个月的血小板复融后即刻与复融后1，2，4 h的4个指标(血小板回收率、平均血小板体积增加值、CD42b和CD62p表达)比较，见表3。

复融后1，2 h与复融后即刻各指标相比差异无显著性意义；复融后4 h CD42b、CD62p表达与复融后即刻相比差异有显著性意义(P < 0.05)，得出复融后最佳使用时间为2 h内。

2.4 冰冻保存血小板解冻后发生絮状物的统计 结果见表4。

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引言

材料方法

1.1 设计 观察学实验。

1.2 时间及地点 于2014年10月至2016年7月在昆明血液中心输血研究室完成。

1.3 材料

1.3.1 标本 从符合国家《献血者健康检查标准》的献血者中随机选取16例，年龄为18-55周岁。纳入标准：①红细胞比积为0.35-0.55，血小板计数>2.5×10¹¹L^-1；②献血前1 d未吃高脂食品，未饮酒；③14 d内未服用阿司匹林及其他影响血小板功能的药物；④当日不空腹，上肢静脉充盈良好。

使用Trima全自动血细胞分离机及耗材进行采集，血液采集时间正常，穿刺顺利，采集过程中未有血流不畅等情况。血小板收集量为80-100 mL。

1.3.2 实验仪器 贝克曼FC500流式细胞仪；KX-21血细胞分析仪(Sysmex)； -18 ℃、-40 ℃、-80 ℃冰箱(SANYO)；空气孵育振荡器TITRAMAX 1000；血小板恒温振荡保存箱、冰冻血浆解冻箱(苏州市仪器厂)；净化工作台(上海跃进医用光学器械厂)。

1.3.3 实验试剂 贝克曼FC500流式细胞仪配套校准、测定试剂；二甲基亚砜原液(进口)；注射用0.9%生理盐水。

1.4 方法

1.4.1 二甲基亚砜的准备 二甲基亚砜原液与生理盐水按照3∶1的比例，配制75%的二甲基亚砜溶液。将配制好的75%二甲基亚砜溶液放入试剂瓶，瓶口消毒，用无菌纱布封口，胶圈固定，室温条件下放置冷却，置于-50 ℃冰箱备用。

1.4.2 制备含5%二甲基亚砜的血小板 将采集的血小板在血小板恒温震荡保存箱内震荡2-4 h，血小板完全解聚、外观无异常后，在净化工作台内，消毒血小板袋顶端的留样管，用无菌注射器抽取所需75%二甲基亚砜溶液，针尖从留样管刺入袋内1.0-2.0 cm。血小板袋置于震荡器上，以1 mL/min缓慢、匀速地推入。加二甲基亚砜溶液的过程中注意血袋有无被二甲基亚砜烧灼变白，有无血小板聚集或蛋白析出等情况。

1.4.3 分装和检测 血小板分别保存于-18 ℃、-40 ℃、-80 ℃的低温冰箱中；在保存到1，3，6，12个月时，从不同的低温冰箱中取出，于38 ℃冰冻血浆解冻箱中复融；在复融后立即、复融后2 h、复融后4 h进行相关项目检测，包括血小板计数、平均血小板体积、血小板分布宽度、CD42b、CD62p，并计算血小板回收率和平均血小板体积增加值。

血小板回收率(%)=融化后血小板计数/冷冻前血小板计数×100%。

平均血小板体积增加值(%)=(融化后平均血小板体积-冷冻前平均血小板体积)/冷冻前平均血小板体积值× 100%。

1.5 主要观察指标 血小板回收率、平均血小板体积增加值以及CD42b、CD62p表达。

1.6 统计学分析 所有数据经质控后采用SPSS 19.0软件进行统计分析，采用配对t 检验、成组t 检验进行数据比较，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

随着输血技术的发展，安全、有效、科学的输血理念在临床得到落实，血液成分的输注占了很大比例，尤其是机采血小板的输注在临床输血中的比重越来越大^[8]，保证足量的血小板供应尤为重要，而冰冻保存血小板可以很好的解决临床上急诊血小板供应不足这一难题。理论上，冰冻血小板贮存温度越低，保存的时间就越长，效果越好。维持细胞生物活性、功能的最理想方法是程序降温，即超低温(-179 ℃)液氮冻存，但由于该方法存在技术难度大，对设备要求高，需长期更换液氮，可能因偶然因素彻底损坏细胞等不利因素，不太适用于存量较大的血小板冻存。因此，深低温(-80 ℃)冰箱冻存是维持细胞生物活性、保留新鲜血小板生理功能较理想的方法之一。深低温冰冻保存血小板在供给形式、数量保证和及时有效性等方面均优于其他方法^[9-11]，且操作方法简单容易，能极大地方便于临床。

5%二甲基亚砜的机采血小板，在-80 ℃下冰冻保存半年以内，具有良好的止血功能^[12-13]，冰冻血小板因随需随取，输注前准备时间短，在临床抢救的“黄金时刻”能及时提供，因此能在抢救上为患者赢得时间，从而降低了死亡率。

实验通过制备含5%二甲基亚砜的冰冻血小板，选择在-18 ℃、-40 ℃、-80 ℃ 3个不同条件下进行保存，在保存到1，3，6，12个月时复融，并在复融后立即、复融后1，2，4 h对血小板各项质量指标进行检测，找到深低温保存血小板的最佳制备、储存方法和条件，并指导临床使用。

尽管冰冻血小板在制备、保存和融解等过程中，血小板部分被破坏，数量有所减少，但仍具有相对完整的超微结构和较高的回收率^[14]。目前，国家还未制定有关冰冻血小板的质量标准，因此应尽量确保血小板采集的数量> 3.0×10¹¹ L^-1[15]，从而保证血小板复融后含量>2.5×10¹¹L^-1。冰冻保存血小板的止血功能明显高于新鲜液体血小板，可能与血小板冰冻保存后膜表面新亚群的产生有关^[16-17]。血小板冰冻保存后膜上CD62p的表达水平明显升高，说明冰冻保存过程中有部分血小板被激活^[18]，激活的机制与内皮抑制功能消失和机采血小板悬浮液中促凝物质的增加等方面有关^[19-20]。CD62p是血小板激活的重要标志，它的再表达表明冰冻保存使血小板产生了新亚群，膜表面功能分子的变化与其体内存活率减低、即刻止血功能增强等变化密切相关^[16]。

冰冻血小板复融后越早输注止血效果越好，应嘱临床立即用经滤血器快速输注，如需保存也最好置于22 ℃温度下，保存时间不宜过长，建议尽可能在解冻后2 h内输完^[11^，^21]。二甲基亚砜对细胞的毒性作用在室温中比低温时大，因此应尽量缩短在室温中的停放时间，以减少二甲基亚砜的毒性反应^[22-23]。

冰冻血小板在复融后会出现絮状物的情况，造成冰冻血小板保存失败，且保存时间越长出现的情况越多。在血小板的采集、制备、保存与解冻等环节上操作不当均可造成血小板融化后出现絮状物，絮状物的出现与损伤血小板有关系^[24]。首先，应注意复融温度和时间。黄彦等^[25]认为，血小板复温温度为37-40 ℃，快速复温应在两三分钟内完成^[26-27]。余福桥^[28]认为解冻时以38 ℃自动解冻箱解冻为好。从低温冰箱取出冰冻血小板应迅速放入38 ℃恒温水浴箱内进行复苏，水要浸没血小板，并不断晃动以确保周围水域的温度保持在38 ℃左右，如果温度不均匀会使细胞在解冻复苏过程中发生重结晶现象而导致血小板胞膜破坏。此外，在血小板复苏过程中，应避免用手搓揉冰冻的血小板，造成血小板损伤。复融时间对复苏后血小板的质量也有一定影响，一般为2.0-3.0 min，在天气寒冷的冬天或者周围环境温度较低时，融化时间应延长1 min左右，因为肉眼观察冰冻血小板已完全融化，但是还有少量的微细凝丝因肉眼无法看清还存在于血小板内部，此时如果将血小板从水浴箱中拿出，会发现越来越多不融化的絮状物析出，最终因悬液外观质量不合格导致该血小板报废。融化时间也不能过长，时间过长亦可引起细胞变化，对血小板的活性也有一定影响。因此，融化时间不宜超过5 min^[29]。另外，机采血小板时，在血细胞分离器中运转时间越长，血小板被激活或损伤的机会就越大；采集过程中穿刺不顺利，献血者血管不好，血流不畅，采集时间长等都会造成血小板被激活^[30]。血小板在加入二甲基亚砜后，应立即贮存于-80 ℃低温冰箱，以减少血小板能量和脂质花生四烯酸代谢的消耗，从而导致絮状物的析出^[31]。冰冻血小板融化后出现絮状物的另一个主要原因是血小板冰冻保存期间储存温度波动，会导致冰晶机械作用使血小板损伤。冰冻血小板随着贮存时间的延长，絮状物析出的情况有显著改变，原因可能是保存期间低温冰箱门被多次开启，导致温度波动。贮存时间越长，开启次数就越多，温度波动就越大，血小板损伤的概率和程度就越大^[24]。因此，血小板采集时的规范操作和保持低温冰箱温度恒定是降低冰冻血小板复融出现絮状物的重要条件。Angelini A、刘景汉、于洋等^[3^，^32-33]认为，冰冻血小板在-80 ℃以下保存期可达6-12个月，解冻后血小板聚集功能恢复良好，临床使用疗效理想。但在实际工作中，低温冰箱门的反复开启是不可避免的，因此，建议保存期在6个月较适宜。

目前，血小板在临床输血中的地位越来越重要，新鲜液态血小板的临床供应越来越短缺，虽然冰冻血小板与新鲜血小板相比，在储存、运输、抗污染性、供应数量及供给临床的及时性上都有着无可比拟的优势，但因为血小板的损伤机制十分复杂, 涉及到血小板的代谢、活化机制等多个方面^[34-35]，冰冻血小板的研究工作已经开展了很多年，但至今仍未被广泛应用^[36]。值得高兴的是，随着冰冻血小板保存技术的不断完善和改进，5%二甲基亚砜冰冻保存血小板技术正逐步应用于临床。冰冻保存血小板的研究前景非常广阔，对保证临床上血液充足供应的意义也是不言而喻的。希望通过此研究，探明深低温冰冻保存血小板的理论基础，使冰冻血小板在技术、方法上取得突破，特别是在危急重症疾病、器官移植(尤其是干细胞移植)、特殊血型等相关治疗新技术的应用中，发挥其重要的作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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Optimal temperature and storage time span for cryopreservation of platelets

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