胰腺干细胞负向筛选分子的鉴定

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.10.013

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (10): 1785-1792.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.10.013

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胰腺干细胞负向筛选分子的鉴定

冯锐成，郎延贺，梁洋，吴莹，滕春波

东北林业大学生命科学学院，黑龙江省哈尔滨市 150040

收稿日期:2012-11-12 修回日期:2012-12-11 出版日期:2013-03-05 发布日期:2013-03-05
通讯作者: 滕春波，博士，教授，东北林业大学生命科学学院，黑龙江省哈尔滨市 150040 chunboteng@yahoo.com.cn
作者简介:冯锐成★，男，1986年生，内蒙古锡林浩特市阿巴嘎旗人，汉族，东北林业大学在读硕士，主要从事胰腺干细胞鉴定及增殖分化研究。 fengruicheng123@126.com
基金资助:
黑龙江省自然科学基金面上项目(C201215)；哈尔滨市科技创新人才研究专项优秀学科带头人基金资助项目(2012RFXXS048)。

Identification of marker molecules for negative screening of pancreatic stem cells

Feng Rui-cheng, Lang Yan-he, Liang Yang, Wu Ying, Teng Chun-bo

College of Life Science, Northeast Forestry University, Harbin 150040, Heilongjiang Province, China

Received:2012-11-12 Revised:2012-12-11 Online:2013-03-05 Published:2013-03-05
Contact: Teng Chun-bo, M.D., Professor, College of Life Science, Northeast Forestry University, Harbin 150040, Heilongjiang Province, China chunboteng@yahoo.com.cn
About author:Feng Rui-cheng★, Studying for master’s degree, College of Life Science, Northeast Forestry University, Harbin 150040, Heilongjiang Province, China

摘要/Abstract

摘要：

背景：利用胰腺干/祖细胞体外增殖分化形成β细胞是细胞替代疗法治疗糖尿病的潜在细胞来源之一。由于缺少有效的筛选分子，胰腺干细胞的分离及特性研究进展缓慢。
目的：观察植物凝集素花生凝集素、菜豆凝集素和热稳定抗原对胰腺细胞的标记情况，以期找到胰腺干细胞的负向筛选分子。
方法：采用荧光组织化学方法对植物凝集素(花生凝集素、菜豆凝集素)和细胞表面分子热稳定抗原抗体在成体小鼠胰腺、胚胎胰腺及切除后再生胰腺组织中进行化学及荧光组织化学检测；流式细胞仪分析负向筛选分子对胰腺细胞分群情况的影响；应用细胞培养方法对不同群细胞进行体外培养和观察。
结果与结论：花生凝集素对胚胎胰腺中分化的腺泡细胞能较好标记，但不标记未分化的胰腺干/祖细胞及前体细胞；菜豆凝集素对未分化和分化的胚胎期胰腺细胞均有标记，热稳定抗原能标记正在分化的胚胎胰腺祖细胞、前体细胞和已分化胰腺细胞。在成体胰腺中，花生凝集素和菜豆凝集素均能标记胰腺腺泡和部分导管细胞，但不能标记胰岛细胞；热稳定抗原能特异标记腺泡细胞、导管细胞、血管内皮细胞、血细胞及再生胰腺新生区的导管样结构。PNA^-/lowHSA^-/low细胞占总细胞量的1.6%，对其培养观察发现，其中富含体积较小、三角形或多角形的上皮细胞，这些细胞可连续传代。提示协同使用花生凝集素与热稳定抗原可以筛除大部分分化的胰腺细胞及部分非胰腺细胞，从而富集胰腺干细胞。

关键词: 干细胞, 干细胞培养与分化, 植物凝集素, 花生凝集素, 菜豆凝集素, 热稳定抗原, 胰腺干细胞, 负向筛选, 标志分子, 荧光组织化学, 省级基金, 干细胞图片文章

Abstract:

BACKGROUND: Pancreatic stem/progenitor cells are a multipotent self-renewing population and are the potential surrogates in the cell replacement therapy of diabetes mellitus. However, lack of effective cell markers hampers the identification and characterization of pancreatic stem cells.
OBJECTIVE: To explore whether plant lectins peanut agglutinin (PNA) and phaseolus vulgaris agglutinin (PHA) as well as the heat stable antigen (HSA) act as negative screening markers of pancreatic stem cells.
METHODS: The binding of plant lectins (PNA, PHA) and HSA antibody on the cell surface of adult pancreas, developing pancreas and regenerating pancreas was studied through histochemistry and immunofluorescent staining method. The clustering of pancreatic cells according to negative screening molecules was analyzed through flow cytometry. The cell types got from different gates by fluorescence-activated cell sorting were studied through cell culture and observation.
RESULTS AND CONCLUSION: PNA marked pancreatic acinar cells in embryonic and neonatal pancreata, but they did not mark undifferentiated progenitors and precursors, PHA bound most of the undifferentiated and differentiated embryonic pancreatic cells, and HSA marked differentiating and differentiated cells in embryonic pancreata. In adults, both PNA and PHA marked pancreatic acinar cells and partial ductal cells, but not insular cells. HSA could recognize acinar, ductal, vascular endothelial cells, blood cells, and ductal-like cells in the regenerating pancreata. PNA^-/lowHSA^-/low cells accounted for 1.6% of the total pancreatic cells. Through culturing the population of double low cells, they are rich in smaller, triangular or polygonal epithelial cells, and they could be continuously sub-cultured. Our results indicate that PNA and HSA as negative markers can get rid of most differentiated pancreatic cells and part of non-pancreatic cell types, thus enrich pancreatic stem cells.

Key words: stem cells, stem cell culture and differentiation, plant lectins, peanut agglutinin, phaseolus vulgaris agglutinin, heat stable antigen, pancreatic stem cells, negative screening, marker molecule, fluorescence histochemistry, provincial grants-supported paper, stem cell photographs-containing paper

中图分类号:

R394.2

冯锐成，郎延贺，梁洋，吴莹，滕春波. 胰腺干细胞负向筛选分子的鉴定[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(10): 1785-1792.

Feng Rui-cheng, Lang Yan-he, Liang Yang, Wu Ying, Teng Chun-bo. Identification of marker molecules for negative screening of pancreatic stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(10): 1785-1792.

图/表（结果） 6

2.1 PNA、PHA和HSA对小鼠胚胎时期胰腺细胞的标记结果 胰腺干/祖细胞起源于胚胎期胰芽中。在小鼠E8.5到E9.5，前后肠交界处内胚层上皮向胰腺细胞命运特化，胰腺干细胞出现于从原始肠管外凸期的胰腺芽基中，这个时期称为第1次转换；在E13.5到E15.5，未分化的胰腺干/祖细胞开始向内外分泌方向快速分化，这个时期称为第2次转换，2次转换的胚胎胰腺中包含大量前体细胞；在E17.5到新生胰腺中，腺泡细胞大量增加，内分泌细胞聚集成胰岛，这段时期称为第3次转换[24-25]。

为了研究PNA、PHA和HSA对胚胎期胰腺干/祖细胞、前体细胞和分化细胞的标记情况，对小鼠E12.5、E14.5、E17.5及出生后5 d(D5)胰腺切片进行了染色。结果发现，在E12.5和E14.5，PNA不与任何胰腺细胞结合；在E17.5，PNA能结合到清晰可辨的腺泡细胞中；出生后5 d，PNA与腺泡细胞强烈结合，见图1。因而，PNA不能标记胰腺干/祖细胞及前体细胞，而强标记分化后的腺泡细胞。

利用PHA对胚胎胰腺染色发现，PHA与E12.5大部分胰腺细胞弱结合；在E14.5，PHA结合的胰腺细胞数量增加；在E17.5，PHA与大多数胰腺细胞强结合；出生后5 d，PHA能与结构清晰可辨的腺泡细胞强烈结合，见图1。早期胰芽的广泛染色结果暗示，PHA不仅能够标记分化的腺泡细胞，也能标记胰腺祖及前体细胞。

HSA在E12.5小鼠胰腺仅能与胰芽部分上皮细胞结合；在E14.5，HSA与胰腺芽基初步分化产生的管状上皮细胞结合；在E17.5和出生后5 d，HSA能与大多数胰腺细胞结合，见图1。因而，HSA对正在分化的胰腺祖细胞、前体和终末分化的腺泡能很好地标记。

2.2 PNA、PHA和HSA对小鼠成体胰腺细胞的标记结果 见图2。

进一步利用荧光组织化学染色分析了PNA、PHA和HSA对成体小鼠胰腺细胞的标记情况。结果发现，PNA能与腺泡细胞强结合，与部分导管上皮内侧也有结合，但与胰腺组织中的某些区域不能结合，见图2A，B。

为了进一步分析PNA不能结合哪些细胞，作者利用细胞世系标志分子与PNA进行了共染色。因子8常被作为血管上皮的特异性标记分子，Sca-1是造血世系细胞的标志性分子，胰岛素能够特异性的标记胰岛细胞。共染结果发现，PNA不能与insulin共染，见图2D，不能与因子8共染，见图2E，也不能与Sca-1共定位，见图2F，表明PNA不能标记胰岛细胞、血管内皮细胞及造血世系干细胞。

已有研究发现，胰腺损伤后干/祖细胞被刺激增殖分化，参与胰腺再生^[26]。胰腺大部切除后再生过程中能产生新生区，其中包括未分化的胰腺祖细胞^[23，26]。为了进一步分析PNA对成体胰腺干/祖细胞的标记情况，作者制作了小鼠胰腺损伤再生模型。结果发现，在损伤再生胰腺中，PNA不但能与正常组织腺泡细胞结合，还能与再生组织中的腺泡细胞结合，见图2C，但不能与未分化细胞结合。上述结果表明，PNA可以作为负向筛选分子排除腺泡及部分导管细胞。

与PNA相类似，PHA能与正常及损伤后成体胰腺腺泡细胞结合，也能与部分导管上皮细胞所分泌的蛋白结合，但不能结合胰岛，见图3。HSA能弱标记成体腺泡细胞、导管细胞(尤其是小导管)和部分胰岛细胞，强标记血管及血细胞，见图3。在损伤再生胰腺中，HSA与再生的管状上皮细胞结合，见图3。结合胚胎期的染色结果，HSA在成体胰腺中可以标记大部分分化的胰腺细胞类型，正在分化的祖细胞和前体细胞，及血管和造血世系细胞。

2.3 PNA与HSA在成体及胚胎小鼠胰腺中共染分析结果 见图4。

进一步检测PNA和HSA共同使用对成体及胚胎小鼠胰腺细胞的标记情况。PNA和HSA共染能结合腺泡细胞、导管上皮细胞、血管内皮细胞、血细胞，及部分胰岛细胞，见图4A-C。在损伤再生的小鼠胰腺中，PNA和HSA共染不但能与上述正常胰腺细胞结合，而且还能与再生组织中正在分化的前体细胞及刚分化的腺泡细胞结合，见图4C。PNA和HSA共同使用对胚胎胰腺染色结果相类似，能够标记正在分化的腺泡、导管及已经完全分化的腺泡和导管细胞，见图4E，F。以上结果表明，PNA和HSA可作为负向筛选分子从胚胎及成体胰腺中富集胰腺干细胞。

2.4 PNA与HSA作为负向筛选标志分子对成体胰腺细胞的流式分析结果 利用流式细胞术分析了PNA和HSA阳性及阴性细胞所占的比例。结果显示，PNA和HSA可将细胞分为4群：PNA⁺HSA⁺、PNA⁺HSA^-/low、PNA-/lowHSA⁺和PNA^-/lowHSA^-/low，在成体中所占比例分别为69.73%，0.06%，28.61%和1.60%，见图5。PNA⁺HSA⁺和PNA^-/lowHSA⁺细胞占胰腺细胞总量的98.34%，与前述免疫染色结果相吻合，而PNA^-/ lowHSA^-/low细胞仅占细胞总量的1.6%，见图5B，符合干/祖细胞含量较低的特点。

2.5 流式分选细胞的体外培养观察结果 对PNA和HSA作为标记进行流式分选的细胞原代培养，相差显微镜下观察发现：PNA和HSA荧光最强(PNA⁺HSA⁺)的细胞体积大，分选后在显微镜下观察可见细胞内有很多酶原颗粒，培养时呈现腺泡细胞培养特征，见图6A，B，传代后细胞均死亡。HSA⁺细胞表现为小而亮，在培养时不贴壁也不生长。而PNA^-/lowHSA^-/low细胞培养后形态上包括两群：一群具有早期胰腺发育期细胞的形态学特征，即体积较小、为不规则三角形或多角形的上皮细胞特征，可进行连续传代培养，见图6C；另一群细胞在培养5-7 d后呈现成纤维细胞形态，传代培养时抑制胰腺来源的上皮细胞生长，见图6D。

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引言

胰腺干细胞是一类能够自我更新和具有多向分化潜能的细胞，在自然条件下它们能分化成为胰腺外分泌部的导管、内分泌部的胰岛以及腺泡等胰腺细胞类型，并且在特定因子调节下还能被诱导分化成肝细胞，因而在糖尿病等疾病的治疗上具有很好的应用前景^[1-6]。

近年来，从人和小鼠胰腺中已分离获得胰腺干细胞，并在体外诱导分化成胰岛^[7-10]，但胰腺干细胞在活体中的定位及其标志分子还有争议。基于胰腺发育、胰腺损伤再生等研究提出的胰腺干细胞备选标志分子主要有：细胞骨架蛋白巢蛋白、肝细胞生长因子受体c-Met、细胞表面分子造血干细胞抗原CD133、乙醛脱氢酶1、八聚体结合蛋白4、胰腺十二指肠同源异型框基因1和胰腺发育关键转录因子P48等^[11-18]。其中，CD133和c-Met为细胞表面抗原，前者在间质细胞有表达，后者在血管内皮细胞有表达，不具有胰腺特异性；其他分子均为细胞内分子，不适合用作胰腺干细胞筛选的表面标志物。

寻找胰腺干细胞表面标志分子的一个重要途径是借鉴其他干细胞研究提供的线索。利用正负表面标志分子组合KTSL(c-kit⁺thy⁺sca-1⁺lin^-)可以高效富集多能造血干细胞^[19]，其中负向标志分子在富集干细胞过程中非常有效。有研究报道，植物凝集素可以作为负向标志分子筛选组织干细胞[^20-21]，尤其利用花生凝集素(peanut agglutinin，PNA)和热稳定抗原(heat stable antigen, HSA，又名CD24)作为负筛选标志可以高效分离纯化成年小鼠脑内的神经干细胞^[22]。基于胰腺与神经发育分子机制的相似性，实验采用荧光组织化学技术、流式细胞术和细胞分离培养方法分析PNA、菜豆凝集素(phaseolus vulgaris agglutinin，PHA)及HSA对胰腺细胞的标记情况，以期找到胰腺干细胞的负向筛选分子。

材料方法

设计：组织及细胞水平体外观察实验。
时间及地点：于2010年3月至2012年12月在东北林业大学生命科学学院完成。
材料：
动物：4-8周龄ICR品系小白鼠购于吉林大学医学院实验动物中心，许可证号：SCXK(吉)2007-0003，饲养温度22 ℃，湿度60%-70%，10 h/14 h间隔照明，自由取食饮水。选择处于发情期的性成熟雄鼠和雌鼠合笼交配，见栓母鼠记为妊娠1 d或胚胎0.5 d(E0.5)。将妊娠13，15及18 d孕鼠处死取出胚胎，解剖镜下取E12.5，E14.5和E17.5胚胎胰腺。鼠新生5 d(D5)和正常成体胰腺取出液氮冷冻后保存于-80 ℃用于冰冻切片。
胰腺干细胞负向筛选分子鉴定实验用试剂和仪器：
Main experimental reagents and equipment:

方法：
胰腺大部分切除：参照实验室已发表方法进行^[23]。4-8周龄ICR品系小白鼠术前饥饿处理12 h。手术时打开腹腔，将连脾的胰腺尾部轻轻移除，仅留连肠系膜部分，缝合腹腔。胰腺切除后3 d处死小鼠，取出剩余胰腺冰冻后切片。
组织荧光染色和免疫组织荧光染色：胰腺组织冰冻切片在冷丙酮中固定15 min，用PNA-Rhodamine、PNA-FITC、PNA-biotin、PHA-Rhodamine和HSA-PE- CY5直接染色；共染色所用一抗包括：兔抗胰岛素 (1∶200)，兔抗因子8(1∶100)和鼠抗Sca-1(1∶50)，Ⅱ抗为羊抗兔-FITC(1∶100)、羊抗鼠- FITC(1∶200)，免疫染色后DAPI复染显示细胞核。
胰腺单细胞分离：4-8周龄小鼠胰腺剪成约8 mm³组织块；0.8 g/L胶原酶Ⅳ(含有0.1 g/L DNaseⅠ)37 ℃消化20 min；轻轻吹打收集单细胞；未消化组织加入0.25% 胰蛋白酶(含0.02% EDTA)37 ℃消化5 min。含血清培养基终止消化，反复吹打释放出所有单细胞，将两次所得单细胞合并，调整细胞浓度为(1.0-2.0)×10⁹ L^-1，用于流式分析或分选。
流式细胞分析和分选：向单细胞悬液分别加入PNA- FITC和HSA-PE-CY5抗体，室温孵育30 min，0.5% BSA的PBS洗涤细胞2次，1 000 r/min离心5 min，用PBS-BSA重悬细胞，流式细胞仪分析或分选不同群细胞。
细胞培养：将不同门流式分选的细胞收回到培养板中培养，培养条件为DMEM/F12(1∶1)基础培养基，补加体积分数2%胎牛血清、B27添加剂和10 μg/L表皮生长因子，培养期间观察细胞的形态，生长速度，并照相记录。
主要观察指标：采用荧光组织化学方法对植物凝集素(花生凝集素、菜豆凝集素)和细胞表面分子热稳定抗原抗体在成体小鼠胰腺、胚胎胰腺及切除后再生胰腺组织中进行化学及荧光组织化学检测；流式细胞仪分析负向筛选分子对胰腺细胞分群情况的影响；应用细胞培养方法对不同群细胞进行体外培养和观察。

讨论

胰腺干细胞的体外筛选可以使用正筛选或负筛选分子。采用正筛选表面标志分子可以从组织中直接获得干细胞，使分离纯化过程变得简单和快速^[10，27-28]。目前还没有找到非常有效的胰腺干细胞正筛选标志性分子，而且在分离纯化干细胞时采用正筛选标志物抗体标记，会使细胞表面分子失活，可能影响细胞特性。而负筛选实验通过荧光组织化学的方法来研究植物凝集素(PNA、PHA)在小鼠胰腺中与胰腺特定细胞类型结合的情况。其中PNA是从花生中提取的能与动物细胞膜上D-半乳糖结合的植物凝集素，被发现可以用作某些分化细胞的标志。如Newman等^[29]发现荧光素标记的PNA在大鼠乳腺上皮不同分化时期显示不同的荧光强度。在不成熟的大鼠乳腺上皮细胞，荧光弱或无，随着性成熟期到妊娠期乳腺上皮荧光强度逐渐增强，而泌乳期荧光强度达到最高峰。已有研究发现，PNA能结合到胚胎和成体胰腺腺泡的细胞表面及酶原颗粒上^[30-31]。实验染色分析结果进一步表明，无论在胚胎晚期还是在成体胰腺，PNA都能强烈结合在分化腺泡细胞表面和部分大导管腔内侧，而对未分化的干/祖细胞不染色，表明PNA可以作为一个负向筛选标志性分子去除已经分化的腺泡细胞和部分导管细胞。PHA也可以与分化腺泡细胞表面和部分大导管腔内侧结合，但它也与未分化的胎胰细胞结合。还有研究发现，PHA能与人胚胎干细胞弱结合^[32]。此外，PHA是一种有丝分裂原，能刺激淋巴细胞增殖，对胰腺的特性也可能产生影响^[33]。因而，PHA不是一个理想的胰腺干细胞负向筛选分子。

Sca-1、因子8常被用来作为血管上皮的特异性标记分子；insulin能够特异性的标记胰岛细胞，本实验用PNA与这些细胞世系标志性分子共染发现PNA不能够与因子8共染，表明PNA不能够标记血管细胞，这样在筛选小鼠胰腺干/祖细胞时可用PNA与血管内皮细胞标志分子共染来排除腺泡细胞和血管细胞的干扰，同时 PNA与成体小鼠胰腺中表达insulin的胰岛细胞不能共染而只能染腺泡细胞(图3)，这同样也证明了PNA只能特异的标记腺泡细胞。

Rietze等^[22]在神经干细胞筛选过程中将HSA与PNA协同使用取得了很好的筛选效果。还有报道发现，HSA与巢蛋白结合使用能从胚胎胰腺中富集胰腺祖细胞^[34]。实验结果表明，HSA在增殖分化的胚胎期胰腺上皮和损伤再生的胰腺导管样上皮上有染色，对分化的腺泡、导管和部分胰岛及血管和血细胞均有较强染色，表明HSA作为标志分子能筛除成体胰腺腺泡、导管、血管、血细胞、部分胰岛细胞及正在分化的祖细胞和前体细胞。但HSA对成体胰腺腺泡细胞染色较弱，与PNA共同使用可以更好地筛除分化的细胞类型。流式分析、分选后培养结果也进一步证明，PNA^-/lowHSA^-/low细胞在低血清扩增条件下能逐渐进入增殖状态并进而形成单层，随着分裂增殖，部分细胞仍保持其不规则三角形或多边形形态，此形态与文献报道的胰腺干细胞相一致^[7-8]。但双阴性细胞中还包括成纤维细胞，阻碍了胰腺干细胞的进一步纯化，如果结合其他的标志性分子或成纤维细胞筛除办法可以进一步富集具有增殖能力的胰腺干/祖细胞。其中成纤维可以采用合适浓度的G418处理，从而抑制成纤维细胞的生长，而对胰腺干细胞的生长无影响^[35]。

β细胞是细胞替代疗法治疗糖尿病的主要细胞来源，β细胞来源途径有多种[36-40]，其中利用胰腺干细胞体外形成β细胞是直接有效的方法。实验以植物凝集素作为胰腺干细胞负向筛选标志分子，可以富集获得胰腺干细胞, 从而为治疗糖尿病的治疗提供了潜在的细胞来源。

致谢：此课题思路得益于与胡建军博士的讨论，特此致谢。
基金资助：黑龙江省自然科学基金面上项目(C201215)；哈尔滨市科技创新人才研究专项优秀学科带头人基金资助项目(2012RFXXS048)。
作者贡献：冯锐成和梁洋负责细胞培养和流式分析，郎延贺和吴莹负责免疫染色，滕春波负责实验设计及写作。
利益冲突：课题未涉及任何厂家及相关雇主或其他经济组织直接或间接的经济或利益的赞助。
伦理要求：实验过程中对动物的处置符合2009年《Ethical issues in animal experimentation》相关动物伦理学标准的条例。
作者声明：文章为原创作品，数据准确，内容不涉及泄密，无一稿两投，无抄袭，无内容剽窃，无作者署名争议，无与他人课题以及专利技术的争执，内容真实，文责自负。

胰腺干细胞负向筛选分子的鉴定

Identification of marker molecules for negative screening of pancreatic stem cells

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