Spry1在miR-21调控人骨髓间充质干细胞成骨分化中的作用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.32.001

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (32): 5085-5089.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.32.001

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Spry1在miR-21调控人骨髓间充质干细胞成骨分化中的作用

杨楠1，周威1，王光2，丁寅3，金岩4

1解放军第309医院口腔科，北京市 100091；2解放军91551部队门诊部，江西省九江市 332005；3解放军第四军医大学口腔医院正畸科，陕西省西安市 710032；4解放军第四军医大学组织工程中心，陕西省西安市 710032

收稿日期:2014-06-26 出版日期:2014-08-06 发布日期:2014-09-18
通讯作者: 丁寅，博士生导师，主任医师，解放军第四军医大学口腔医院正畸科，陕西省西安市 710032 并列通讯作者：金岩，博士生导师，教授，解放军第四军医大学组织工程中心，陕西省西安市 710032
作者简介:杨楠，女，1981年生，北京市人，满族，2012年解放军第四军医大学毕业，博士，主治医师，主要从事口腔正畸及干细胞研究。
基金资助:
国家重点基础研究发展计划(2011CB964700)

Role of Spry1 in osteogenic differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells under miR-21 regulation

Yang Nan¹, Zhou Wei¹, Wang Guang², Ding Yin³, Jin Yan⁴

1Department of Stomatology, the 309 Hospital of PLA, Beijing 100091, China; 2Outpatient Department of Troop 91551, Jiujiang 332005, Jiangxi Province, China; 3Department of Orthodontics, Stomatological Hospital of Fourth Military Medical University of PLA, Xi’an 710032, Shaanxi Province, China; 4Center of Tissue Engineering, Fourth Military Medical University of PLA, Xi’an 710032, Shaanxi Province, China

Received:2014-06-26 Online:2014-08-06 Published:2014-09-18
Contact: Ding Yin, Doctoral supervisor, Chief physician, Department of Orthodontics, Stomatological Hospital of Fourth Military Medical University of PLA, Xi’an 710032, Shaanxi Province, China Corresponding author: Jin Yan, Doctoral supervisor, Professor, Center of Tissue Engineering, Fourth Military Medical University of PLA, Xi’an 710032, Shaanxi Province, China
About author:Yang Nan, M.D., Attending physician, Department of Stomatology, the 309 Hospital of PLA, Beijing 100091, China
Supported by:
The National Basic Research Program of China (973 Program), No. 2011CB964700

摘要/Abstract

摘要：

背景：前期研究发现，miR-21在骨髓间充质干细胞成骨分化中表达上升，但是miR-21在骨髓间充质干细胞成骨分化中的作用及分子机制尚不明确。
目的：验证miR-21的靶基因Spry1，探明Spry1在人骨髓间充质干细胞成骨分化中的作用。
方法：荧光素酶报告验证miR-21靶基因Spry1，Western Blot检测Spry1在人骨髓间充质干细胞成骨过程的表达。构建Spry1慢病毒表达载体，感染人骨髓间充质干细胞。碱性磷酸酶、茜素红染色、RT-PCR和Western Blot分析Spry1高表达后人骨髓间充质干细胞成骨能力的改变。
结果与结论：荧光素酶报告提示Spry1为miR-21的靶基因，在人骨髓间充质干细胞成骨过程中表达量下降。上调Spry1能够抑制人骨髓间充质干细胞的成骨分化。结果表明Spry1作为miR-21的靶基因负向调控人骨髓间充质干细胞的成骨分化，在骨形成过程发挥着重要作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 骨髓间充质干细胞, miR-21, Spry1, 成骨分化, 973项目

Abstract:

BACKGROUND: Previous studies have found that miR-21 expression is increased during osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells, but the action and molecular mechanism of miR-21 are still unclear.
OBJECTIVE: To verify the target gene of miR-21, Spry1, and to explore the role of Spry1 in osteogenic differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells.
METHODS: Luciferase report was used to verify Spry1 gene targeted by miR-21, and western blot assay was used to detect the expression of Spry1 in the osteogenesis of human bone marrow mesenchymal stem cells. Spry1 expression vector was established and transfected into human bone marrow mesenchymal stem cells. Osteogenesis ability of human bone marrow mesenchymal stem cells was analyzed after Spry1 high expression by alkaline phosphatase, alizarin red staining, RT-PCR and western blot.
RESULTS AND CONCLUSION: Luciferase report suggested that Spry1 was a target gene of miR-21. The expression level of Spry1 was decreased in the osteogenesis of human bone marrow mesenchymal stem cells. Increasing expression of Spry1 could inhibit osteogenic differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells. These results indicate that Spry1 as a target gene of miR-21 negatively regulates osteogenic differentiation
of human bone marrow mesenchymal stem cells, and plays an important role in bone formation process.

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Key words: bone marrow, mesenchymal stem cells, cell transdifferentiation, osteoblasts, microRNAs, gene expression

中图分类号:

R394.2

杨楠，周威，王光，丁寅，金岩. Spry1在miR-21调控人骨髓间充质干细胞成骨分化中的作用[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(32): 5085-5089.

Yang Nan, Zhou Wei, Wang Guang, Ding Yin, Jin Yan. Role of Spry1 in osteogenic differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells under miR-21 regulation[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(32): 5085-5089.

图/表（结果） 1

2.1 荧光素酶报告系统验证Spry1为miR-21的靶基因为了验证miR-21是否通过与Spry1基因3’-UTR区结合抑制靶基因的表达，通过将扩增的Spry1基因3’-UTR片段插入pMiR-report多克隆位点构建了荧光素酶报告质粒。共转染荧光素酶报告质粒和pre-miR-21后，利用荧光素酶报告检测仪检测荧光素酶活性，发现荧光素酶活性明显下降。相反，共转染荧光素酶报告质粒和anti-miR-21后荧光素酶活性显著升高(图1A)。

2.2 miR-21能够降低Spry1蛋白表达为了进一步验证miR-21能在转录后水平抑制Spry1的表达，检测了不同miR-21表达水平下Spry1蛋白表达的变化。Western Blot结果提示，在人骨髓间充质干细胞中过表达miR-21能够显著降低Spry1的蛋白表达。相反，抑制miR-21表达后，能够促进Spry1蛋白的表达(图1B)。

2.3 Spry1在骨髓间充质干细胞成骨过程中的表达为了验证Spry1在人骨髓间充质干细胞成骨分化中的作用，首先检测了Spry1在人骨髓间充质干细胞成骨分化中的表达。结果发现，在成骨诱导第7天和第10天Spry1的表达显著下降，相反，miR-21在成骨7 d和10 d表达显著升高。这一结果说明在人骨髓间充质干细胞成骨分化过程中，miR-21可能负向调控Spry1表达(图2)。

2.4 Spry1在人骨髓间充质干细胞成骨分化中的作用为了进一步验证Spry1在人骨髓间充质干细胞成骨分化过程中的调控作用，实验构建了人Spry1的慢病毒表达载体。通过感染原代人骨髓间充质干细胞来高表达Spry1。同时构建慢病毒GFP表达载体作为对照，检测转染效率。并且，病毒感染2 d后提取RNA，real time RT-PCR 检测感染病毒后Spry1的表达。结果发现，感染Spry1慢病毒载体后，Spry1表达上升了5倍。确定Spry1高表达成功后，将稳定表达Spry1的细胞成骨诱导7 d和21 d，碱性磷酸酶和茜素红染色观察人骨髓间充质干细胞成骨分化能力。结果发现，Spry1高表达组人骨髓间充质干细胞活性降低，茜素红染色显示钙结节明显减少(图3A)。为了进一步确定Spry1对成骨分化的抑制作用，人骨髓间充质干细胞成骨诱导7 d后提取RNA和蛋白，检测成骨特异性基因Runx2和Osterix的表达。结果显示Spry1高表达后能够显著降低Runx2，Osterix的基因和蛋白的表达(图3B，C)。以上结果证明，Spry1负向调控人骨髓间充质干细胞体外成骨分化。

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引言

骨缺损是一个全球性的健康问题，它的治疗面临巨大的挑战^[1]。骨缺损主要是由于创伤或者生理性病理性骨吸收所导致。在颅颌面和整形外科中，由于创伤所致的骨缺损是常见的临床问题，需要骨再生来修复缺损提高患者的生活质量。除了创伤，由于性别、年龄和感染所致的一些骨疾病，如骨质疏松，骨量减少及牙周炎导致的牙齿脱落等，也需要骨再生来治疗和恢复丢失的骨量。

骨髓间充质干细胞是成骨细胞和骨细胞的前体细胞。以骨髓间充质干细胞为种子细胞的骨再生能够在体内形成新骨，并且一系列的临床试验已经证实了其可行性。在羊和大鼠的体内研究中发现，植入骨髓间充质干细胞复合物后新生成的骨能够完全修补缺损^[2-3]，但是在人体内的结果却不尽如人意。虽然植入人骨髓间充质干细胞移植物后能够形成新骨，但是新骨形成不足，不能完全覆盖移植物^[2-4]。因此，如何提高人骨髓间充质干细胞成骨分化能力是促进骨再生的关键问题。研究表明通过调控一些信号分子，蛋白和基因的干涉能够提高骨髓间充质干细胞的增殖和分化能力^[5-6]，但如何增强骨髓间充质干细胞的成骨分化能力仍是骨再生中的关键问题。

骨髓间充质干细胞的成骨分化是个十分复杂的过程。除了经典的遗传学和表观遗传学的调控之外，越来越多的研究表明miRNA也在这一过程中发挥着重要的作用。miRNA是一类内生的、长度为18-25个核苷酸的非编码短小RNA，它通过与靶基因3’非翻译区(3＇UTR)的非完全配对来抑制它们的翻译和稳定，在细胞的多种生理病理过程中发挥重要的调控作用，例如细胞的增殖、分化、凋亡和癌症的发生进展^[7-9]。体内研究发现，在骨前体细胞中条件性敲除miRNA成熟所必须的酶Dicer，导致小鼠出生后死亡，并且基因缺陷鼠存在明显的骨骼发育畸形和骨、软骨形成障碍。在成骨细胞中条件性剔除Dicer，导致小鼠出生后骨形成迟缓，但是在出生后4-8个月时，骨重建加快。在体外，利用shRNA沉默人骨髓间充质干细胞中Dicer的表达导致其成骨分化能力的下降。这些结果说明miRNA在骨形成中是不可或缺的。

许多研究表明，miRNA能通过调控成骨信号通路上的关键的转录因子和成骨标志性基因来促进或者抑制骨前体细胞和成骨细胞的分化。例如，miR-133和miR-135通过抑制成骨分化中关键的转录因子Runx2和Smad-5，抑制干细胞向成骨细胞分化^[10]；在骨形态发生蛋白2诱导的前体成骨细胞MC3T3-E1分化时，miR-141和miR-200通过抑制Dlx5，来抑制前体成骨细胞的成熟^[11]；miR-125b通过抑制小鼠间充质干细胞ST2的增殖参与成骨细胞的定向分化^[12]；此外，被认为是肌肉组织特异性表达的miR-206，通过抑制碱性磷酸酶活性和CX43表达抑制原代小鼠成骨细胞的分化^[13]。

课题组前期研究发现miR-21在人骨髓间充质干细胞成骨分化过程中表达升高，那么miR-21是否在人骨髓间充质干细胞成骨分化过程发挥着重要作用？目前尚未见报道。通过生物信息学方法，作者预测Spry1存在miR-21结合位点。Spry1是受体酪氨酸激酶(RTK)途径的保守抑制剂。Spry1负向调控多条RTK信号途径，如FGF，MAPK信号通路等^[14-18]。而这些信号通路在干细胞成骨分化中起着关键的调控作用，那么Spry1在调控人骨髓间充质干细胞成骨分化过程中的作用如何，miR-21是否通过作用于Spry1调控成骨分化?本研究旨在于探讨miR-21/spry1在人骨髓间充质干细胞成骨分化中的分子机制。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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材料方法

设计：细胞分子生物学体外观察实验。

时间及地点：实验于2011年6月至2012年3月在解放军第四军医大学组织工程中心完成。

材料：

Spry1/miR-21调控人骨髓间充质干细胞成骨分化实验试剂：
试剂	来源
p-MiR report质粒、脂质体2000	Invitrogen，美国
分子生物级质粒抽提试剂盒	QIAGEN，德国
胶回收试剂盒	Takala，日本
DH5α感受态细胞	天根，中国
胰化蛋白胨、琼脂粉、酵母提取物	Sigma，美国
限制性内切酶	Fermentas，美国
荧光素酶报告基因检测试剂、荧光素酶报告检测系统	Promega，美国

实验方法：

骨髓间充质干细胞的培养：经伦理委员会批准，患者知情同意后，选取5例髂骨移植术和开放性骨折手术患者(排除其他系统性疾病和骨质疏松)，在术中抽取骨髓5 mL，置于枸橼酸锂抗凝管中。在超净台内将骨髓与等体积的不含血清的低糖α-MEM培养液(青霉素钠100 U/mL和链霉素100 U/mL)混合，用吸管反复吹打使骨髓组织基本均匀分散。室温400×g离心10 min，去掉脂肪层，用低糖α-MEM培养液重悬细胞，缓慢注入预先加入等体积的1.073 g/mL Percoll分离液的离心管内，注意保持液体分界面完整(Percoll分离液位于下方，而稀释血液位于上方)，400×g离心30 min，吸取中间的单个核细胞层，PBS洗2次重悬于含体积分数为10%胎牛血清的低糖α-MEM养液(含青霉素钠100 U/mL和链霉素100 U/mL)，调整细胞浓度为1×10⁹ L^-¹，接种于25 cm²的培养瓶中，置于CO₂孵箱中孵育。24 h后换液去除未贴壁细胞，以后每3 d换液，倒置显微镜下观察细胞形态和生长情况。待细胞生长至80%-90%融合时，用 0.25%胰酶消化按1∶2比例传代培养。

荧光素酶报告基因载体的构建：根据酶切要求选择SpeⅠ和Hind Ⅲ限制性内切酶进行双酶切。β-gal质粒载体作为转染体系的内对照，设计合成扩增引物5’-GGA CTA GTC ATG AAC ATA CAC CCA CAT CC-3’ and 5’-CCC AAG CTT GGA GAG GGC AGT GGT TAA AGG-3’，使用已有cDNA模板，扩增得到Spry1基因3’-UTR目的片段。通过双酶切、DNA电泳、胶回收、连接，转化、挑克隆、质粒提取等过程，构建荧光素酶报告基因载体。

Spry1 慢病毒载体的构建：设计合成扩增引物hSpry1V1.5， 5’CCA CGG TGA TCC TTA ATA TTG GT-3’；hSpry1V1.3， 5’-CAA TTT CCC TGC TCC CAC GGT A-3’；hSpry1V1.5 KpnⅠ， 5’-GGG GTA CCA CGA GAT CAC TAC ACA TGG A-3’；hSpry11.3 XhoⅠ， 5’-CCG CTC GAG CAT GAG TTA GAC CTT GGC AAC-3’。使用已有cDNA模板，扩增得到Spry 1目的片段。将目的基因片段连入pENTR™ Dual Selection Vectors。将连好的基因片段转入慢病毒载体 pLenti6.3/V5-DEST。

miR-21的转染：取生长对数期第3代骨髓间充质干细胞，于转染前1 d更换新鲜的培养液，保证细胞的生长活力。转染时，使用siPORT NeoFX转染试剂，转染pre-miR-21， pre-miR negative control，anti-miR-21，anti-miR negative control，2 d后成骨诱导。成骨诱导培养基内含体积分数为10%胎牛血清的α-MEM培养液，10^-⁸ mol/L地塞米松， 50 μmol/L抗坏血酸维生素C和10 mmol/L β-甘油磷酸钠，进行成骨诱导培养3周。

成骨基因的检测：分别提取诱导1，3，7，10，14 d的细胞，用PBS清洗3次，沥干水分。按照TRIZOL RNA提取试剂盒操作指南进行细胞总RNA的提取。将提取的细胞总RNA加入25 µL DEPC水，用枪头反复吹打充分溶解。用分光光度仪测量每一样品中RNA的含量。根据样本中抽提的RNA含量，按照反转录试剂盒的操作说明，计算反转录体系中需要加入的总RNA的量，将RNA反转录为cDNA。将得到的cDNA模板按照real time RT-PCR试剂操作说明书加入检测体系，使用ABI7500实时定量仪(ABI，德国)检测成骨相关基因Spry1，Runx2和Osterix的表达。Spry1引物为5’-GGG GCT GGA TAA GCA TCC C-3’，Runx2引物为5’-TCA ACG ATC TGA GAT TTG TGG G-3’，Osterix引物为5’-CAC AAA GAA GCC GTA CTC TGT-3’。

主要观察指标：成骨指标碱性磷酸酶、茜素红染色定量分析，成骨相关基因Spry1、Runx2和Osterix的表达。

统计学分析：SPSS 18.0统计软件进行相关数据分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

骨髓间充质干细胞的成骨分化对于骨的发育重建至关重要。除了经典的遗传学和表观遗传学的调控之外，越来越多的研究表明miRNA也在这一过程中发挥着重要的作用。miR-21在哺乳动物中高度保守，并且由单基因编码。miR-21基因定位于17号染色体，跨膜蛋白-49(TMEM-49)基因的第10个内含子上。其全长22 nt，是由72 nt的茎环结构前体剪切加工成熟。目前关于miR-21的研究主要集中肿瘤领域。许多研究通过大规模筛查肿瘤中miRNA表达谱，发现miR-21几乎在所有实体瘤中高表达。在对脑胶质瘤miRNA表达谱的分析中首次发现miR-21异常表达。随后研究发现，miR-21在肺癌、胃癌、乳腺癌、肝癌、胆管癌、结肠癌、前列腺癌和B细胞淋巴瘤中均呈高表达^[19-23]。

但是，对于miR-21在干细胞及正常组织中的功能却研究很少。最新的一项研究发现，miR-21在正常组织中能够促进肝脏组织的再生，暗示miR-21在正常组织生长和发育中起到了重要作用。Eloy-Trinquet等^[23]研究发现，在RANKL诱导骨髓来源的单核巨噬细胞破骨分化的过程中，c-Fos能够上调miR-21的表达，而miR-21上调后能够通过抑制PDCD4促进破骨分化。通过研究miR-21在胚胎干细胞中的作用发现，miR-21在胚胎干细胞分化过程中表达升高。它通过负向调控其靶基因SOX2和OCT4抑制胚胎干细胞的自我更新^[24]。但是目前miR-21在间充质干细胞中的作用研究甚少。利用基因芯片的方法通过对人骨髓间充质干细胞成骨诱导后miRNA表达谱的分析发现，miR-21在人骨髓间充质干细胞成骨成脂分化过程中表达均升高。

为了研究miR-21调控人骨髓间充质干细胞成骨分化的机制，利用生物信息学预测的方法，查找了miR-21所有的靶基因，找出了和成骨信号通路密切相关的靶基因。同时查找了在人骨髓间充质干细胞成骨分化中起重要作用的信号通路，发现2008年Felicia Ng等利用基因芯片筛选了人骨髓间充质干细胞成骨成软骨成脂分化过程中，所有发生显著变化的基因，并按信号通路对这些基因进行了归类，结果显示成纤维细胞生长因子、血小板衍生生长因子和转化生长因子β信号通路在人骨髓间充质干细胞成骨分化中起到了重要的作用^[25-29]。而在miR-21的靶基因中Spry1是成纤维细胞生长因子信号通路的抑制剂^[30-33]。因此作者推测，Spry1在miR-21调控人骨髓间充质干细胞成骨分化中起到了重要作用，但是目前Spry1在人骨髓间充质干细胞分化中的作用报道甚少。

Spry1是FGF、ERK-MAPK信号通路的保守抑制剂^[34-37]。研究表明，哺乳动物的Spry1蛋白通过负向调控生长因子信号通路抑制细胞的生长和分化^[8]。Spry1在损伤中对于维持骨骼肌干细胞池的未分化状态和稳态是必需的。而且Spry1能够调控FGF-ERK介导的器官发生和四肢的形成^[38]。此外，Spry1通过负向调控ERK信号通路对于维持胚胎干细胞自我更新能力是必不可少的，并且在内皮祖细胞向特定谱系分化中发挥了重要的作用^[39-40]。

在本研究中，发现Spry1在人骨髓间充质干细胞成骨分化过程中表达下降，而与miR-21表达相反。结果证实，上调Spry1可以抑制人骨髓间充质干细胞成骨分化。这一结果与Urs等^[21]研究结果有所不同。他们通过在脂肪细胞中条件性表达Spry1，发现骨髓间充质干细胞成骨能力增强而成脂能力减弱。作者推测这一差别的产生可能是由于在脂肪细胞中表达Spry1后，Spry1抑制了间充质干细胞的成脂能力而代偿性增强了它的成骨分化能力。而利用条件性转基因技术，在体内软骨细胞中高表达Spry1会导致出生后死亡同时伴随骨骼发育异常，Spry1能够抑制软骨细胞的增殖，终止分化。

细胞内调控分化的通路繁多，有文献报道miRNA能调控多个靶基因而行使其功能，Target Scan显示miR-21共有300多个靶基因，因此作者推测miR-21的其他靶基因也很可能参与了miR-21调控的人骨髓间充质干细胞成骨分化。但这一观点还需要进一步的实验进行阐明。

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Spry1在miR-21调控人骨髓间充质干细胞成骨分化中的作用

Role of Spry1 in osteogenic differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells under miR-21 regulation

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