曲霉菌内切型壳聚糖酶基因克隆及在大肠杆菌中的表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.34.014

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (34): 5490-5496.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.34.014

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曲霉菌内切型壳聚糖酶基因克隆及在大肠杆菌中的表达

卢华定，连礼熠，陈明伟，戴驭虎

中山大学附属第三医院骨科，广东省广州市 510630

修回日期:2014-07-26 出版日期:2014-08-20 发布日期:2014-08-20
通讯作者: 卢华定，副教授，中山大学附属第三医院骨科，广东省广州市 510630
作者简介:卢华定，男，1971年生，浙江省温岭市人，汉族，2005年中山大学毕业，博士，副教授，主要从事骨关节炎、软骨组织工程研究。
基金资助:
国家自然科学基金资助项目(82172040)；广东省自然科学基金资助项目(S2011010004808，S2013010016385)；广东省科技计划基金资助项目(2012B031800451)

Cloning and expression of Asperguillus endo-chitosanase gene in Escherichia coli

Lu Hua-ding, Lian Li-yi, Chen Ming-wei, Dai Yu-hu

Department of Orthopedics, the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 510630, Guangdong Province, China

Revised:2014-07-26 Online:2014-08-20 Published:2014-08-20
Contact: Lu Hua-ding, Department of Orthopedics, the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 510630, Guangdong Province, China
About author:Lu Hua-ding, M.D., Associate professor, Department of Orthopedics, the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 510630, Guangdong Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 82172040; the Natural Science Foundation of Guangdong Province, No. S2011010004808 and S2013010016385; the Science and Technology Project of Guangdong Province, No. 2012B031800451

摘要/Abstract

摘要：

背景：壳聚糖酶是高效、特异降解壳聚糖的酶，因此高效稳定地表达具有较高活性的壳聚糖酶可有效提高壳聚糖介导的基因治疗效果。

目的：构建一种可高效降解壳聚糖的壳聚糖酶基因，探讨其在大肠杆菌中的表达及影响其活性的主要因素。

方法：根据GenBank公布的曲霉菌CJ22-326内切型壳聚糖酶基因序列信息(EU302818)，设计并合成23条重叠引物，PCR法扩增壳聚糖酶基因片段，构建原核表达质粒pET28a-His6-CSN，将其转化大肠杆菌，收集融合蛋白His6-CSN，检测融合蛋白的表达及酶活性，同时检测不同pH值及温度对壳聚糖酶活性的影响。

结果与结论：Western-blot证实融合蛋白His6-CSN成功表达，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测显示表达的融合蛋白相对分子质量约为29 000，二硝基水杨酸比色法测定壳聚糖酶对壳聚糖的降解活性显著高于溶菌酶(P < 0.05)，但低于灰色链霉菌壳聚糖酶(P < 0.05)。壳聚糖酶的最适pH值和最适温度分别为6.0和50 ℃，当pH值在4.0-7.0、温度在30-50 ℃范围内具有较高的酶活性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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关键词: 生物材料, 材料相容性, 壳聚糖, 壳聚糖酶基因, 克隆, 表达, 酶活性, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Chitosanase is an enzyme for efficient and special hydrolysis of chitoan, and hence its effective and stable expression with enzymatic activity will contribute to improving gene therapeutic effect.

OBJECTIVE: To construct a chitosanase gene for the efficient and specifical hydrolysis of chitosan, and to investigate its expression in Escherichia coli and the main influencing factors of enzymatic activity.

METHODS: According to the sequences of endo-chitosanase of Aspergillus sp. CJ22-326 provided in Genbank (EU302818), primers were designed and synthesized. The Asperguillus endo-chitosanase gene was amplified by successive extension PCR. And then the recombinant pET28a-His6-CSN was constructed and expressed in Escherichia coli BL21. Finally the recombinant His6-CSN fusion protein was analyzed by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gelelectrophoresis (SDS-PAGE), the western blot and dinitrosalicylic acid assay for detecting the enzyme activity of eluted His6-CSN fusion protein. The influence of different pH value and temperature on the enzyme activity of the recombinant chitosanase was investigated.

RESULTS AND CONCLUSION: SDS-PAGE showed that 29 kDa proteins were expressed and the western blot assay showed that His6-CSN expressed successfully in the host. Dinitrosalicylic acid assay determined the enzymatic activity of His6-CSN was significantly higher than that of lysozyme, but lower than that of chitosanase from Streptomyces griseus (P < 0.05). The recombinant chitosanase displayed the maximal activity at temperature of 50 ℃ and pH value of 6.0. There were a higher enzymatic activity remaining at pH value of 4.0-7.0 and temperature of 30-50 ℃.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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Key words: biocompatible materials, chitosan, genes

中图分类号:

R318

卢华定，连礼熠，陈明伟，戴驭虎. 曲霉菌内切型壳聚糖酶基因克隆及在大肠杆菌中的表达[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(34): 5490-5496.

Lu Hua-ding, Lian Li-yi, Chen Ming-wei, Dai Yu-hu. Cloning and expression of Asperguillus endo-chitosanase gene in Escherichia coli[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(34): 5490-5496.

图/表（结果） 1

2.1 壳聚糖酶基因片段的PCR扩增 根据设计的壳聚糖酶基因序列所合成的23条引物，互为模板通过PCR拼接法扩增出目的片段，大小为717 bp，与曲霉菌CJ22-326内切型壳聚糖酶基因全长大小相符。

2.2 壳聚糖酶基因的克隆及双酶切鉴定 质粒pET-28a(+)多克隆位点的两端有限制性内切酶BamHI/Xho I的识别位点，重组表达质粒进行BamHI/Xho I双酶切，进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，获得约为5 300 bp和717 bp两个条带(图1)，证实构建重组原核表达质粒pET28a-His6-CSN成功。

2.3 重组原核表达质粒pET28a-His6-CSN表达壳聚糖酶的SDS-PAGE和Western-blot检测 在IPTG诱导下，原核表达质粒pET28a-His6-CSN在E.coli BL21表达His6-CSN融合蛋白，使用Ni²⁺-NTA亲和层析得到纯化的融合蛋白。

在SDS-PAGE中，经马考斯亮蓝染色后只有一个条带在相对分子质量29 000处出现，且在诱导表达1-4 h过程中，表达的融合蛋白的量逐渐增多，对照组不表达融合蛋白(图2A)。

Western-blot检测在相对分子质量25 000与35 000之间出现一蛋白条带(图2B)，该条带为纯化的融合蛋白His6-CSN。

2.4 原核表达融合蛋白His6-CSN的酶活性检测 根据所得的氨基葡萄糖NAG作标准曲线，确定壳聚糖酶水解壳聚糖所产生的还原糖的量。在37 ℃、pH=6.0条件下，壳聚糖酶的活性为(14.055±0.375) U/μg，显著高于溶菌酶的活性(4.046±0.177) U/μg，两者均低于灰色链霉菌壳聚糖酶的活性(21.442±0.463) U/μg，差异有显著性意义(F=1 773.18，P < 0.05)，见图3。

2.5 pH和温度对壳聚糖酶活性的影响 壳聚糖酶的最适pH值为6.0，且酶活性在pH为4.0-7.0范围内仍具有较高的活性；当pH=7.0时仍可达最高活性的73%；当pH=8时，酶活性下降为最高活性的46%(图4A)。

壳聚糖酶的最适温度为 50 ℃，且在37 ℃时酶活性仍可达最大活性的89%；当温度为60 ℃时，酶活性急剧降低，仅为最高活性的30%；当温度为70 ℃时，酶完全失活(图4B)。

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引言

几丁质，又称甲壳素，是乙酰氨基葡萄糖通过β-1，4糖苷键连接而成的线性聚合物，最早由Braconnot从甲壳类动物外壳中提取并命名，是自然界中第二大类的天然高分子化合物，其含量仅次于纤维素^[1-2]。在工业应用中，甲壳素主要以虾蟹的壳为原料，通过强酸、强碱处理去除蛋白和矿物质得到的半透明白色物质^[3]。在碱性条件下，几丁质水解脱去50%以上乙酰基的产物是壳聚糖^[4]，由β-(1-4)-2-氨基-D-葡萄糖和β-(1-4)-2-乙酰氨基-D-葡萄糖通过β-1，4糖苷键连接而成的线性多聚糖，其相对分子质量从几十万到几百万不等^[5]。

由于壳聚糖具备良好的生物相容性、安全性、可降解性及经济易获取等特点，在食品、化工、水产等诸多领域被广泛关注^[6-9]。在医学领域尤其是基因治疗方面，壳聚糖作为天然阳离子基因载体被广泛研究^[10-12]，壳聚糖可包裹目的基因，通过消化道、静脉或局部注射等途径安全稳定地到达治疗部位^[13-15]，被靶细胞或组织所吸收。由于壳聚糖与DNA之间的强静电作用导致两者结合力过强，使DNA从壳聚糖/DNA载体中解离释放困难，从而影响壳聚糖介导的基因转染效率。此时对壳聚糖的降解，既可增加目的基因的释放而提高治疗效果^[16]，又可发挥低聚壳聚糖的抗菌、抗肿瘤、调节免疫功能等作用^[17]。

此外，大分子壳聚糖降解得到聚合度不超过10的线性低聚糖，这种低分子壳聚糖称为壳寡糖，因其独特的理化性质和生物活性而被誉为“第六生命要素”^[18]。金春阳等^[19]以壳寡糖作为基因载体进行体外基因转染，结果发现壳寡糖具有良好的生物相容性，能够有效结合并保护核酸物质，提高细胞的基因转染效率，是一种理想的非病毒基因载体。由于壳聚糖难溶于水，而壳寡糖却能很好地溶于水中，这个特性使壳寡糖的应用范围得到进一步的扩大，因此，越来越多的研究者关注大分子壳聚糖的降解^[20-21]。

壳聚糖的降解主要有化学法和酶解法，通过化学法降解壳聚糖的过程难以控制，完全水解时易获得氨基葡萄糖单糖，不易获得低聚壳聚糖^[22]；酶解法反应条件温和，反应过程无需加入其他反应试剂，副产物生成少，可选择性地切断β-1，4糖苷键，获得不同聚合度的壳寡糖，该水解过程易于控制^[23]。降解壳聚糖的酶包括为非特异性酶，如溶菌酶、纤维素酶、脂肪酶等^[24]，以及特异性降解酶即壳聚糖酶^[25]。与壳聚糖酶相比，非特异性酶能降解壳聚糖生成壳寡糖，但降解反应速率低、生理生化活性低、反应酶量多、水解产物复杂^[26]。壳聚糖酶是一种可高效特异地水解壳聚糖的酶，包括内切壳聚糖酶和外切壳聚糖酶^[23]。曲霉菌CJ22-326是一株产壳聚糖酶活力较强的诱变菌株，所产的壳聚糖酶具有内切酶和外切酶两种类型，GenBank中公布的曲霉菌CJ22-326CSN基因的序列信息为内切型壳聚糖酶(EU302818)，可快速地降解壳聚糖生成低聚壳聚糖^[27]。因此，曲霉菌CJ22-326内切型壳聚糖酶在药品食品行业具有良好的应用前景。

本实验旨在通过基因工程技术提供一个可以在体内温和条件下进行高效降解壳聚糖的方法，为其在医药领域的进一步应用提供实验依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程
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材料方法

设计：对比观察实验。

时间及地点：实验于2013年3月至2014年5月在中山大学附属第三医院中心实验室完成。

材料：

实验菌株：大肠杆菌(Escherichia coli)BL21由中山大学附属第三医院中心实验室提供。

实验方法：

PCR法扩增壳聚糖酶基因片段：根据GenBank公布的曲霉菌CJ22-326CSN基因的序列信息(EU302818)，合成23条重叠引物(表1)。

PCR扩增预混液MasterMix(DNA聚合酶、PCR buffer Mg²⁺、dTNPs、PCR稳定剂和增强剂) 25 μL，引物P1 2 μL，引物P23 2 μL，混合引物(P1-P23)，5 μL，ddH₂O 16 μL，总反应体系为50 μL。其中P1-P22为正向引物，P23为反向引物。反应条件：94 ℃预热变性2 min，94 ℃变性20 s，55 ℃复性20 s，72 ℃延伸40 s，其中变性-复性-延伸3个步骤进行20个循环，最后72 ℃保温2 min。PCR反应结束后，1.2%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，回收并进行下一步反应，直至合成全长目的基因。

重组原核表达载体pET28a-His6-CSN的构建： 150 mg/L载体pET-28a(+)20 μL，1 μL Xho I、1 μL Mlu I酶，5 μL Buffer，加水至50 μL，置于恒温培养箱2.0-3.0 h后，回收所需载体骨架；150 mg/L PCR产物20 μL，1 μL Xho I，1 μL Bsa I，5 μL Buffer，加水至50 μL，置于恒温培养箱2.0-3.0 h后，回收基因片段A，同样的方法回收基因片段B。将回收的A/B片段和回收的载体进行连接，进而转化大肠杆菌，挑取单克隆进行测序鉴定及全基因双酶切鉴定。

pET28a-His6-CSN在大肠杆菌中的表达与纯化：将pET28a-His6-CSN转化进大肠杆菌，将菌液均匀涂布于含100 mg/L氨苄青霉素的LB固体培养基中，37 ℃倒置培养12 h，挑取单克隆菌落，加入到100 mL的含100 mg/L氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37 ℃摇菌8-12 h，测菌液分光光度值，A₆₀₀达到0.5-0.6时，加入终浓度0.5 mmol/L的表达诱导剂异丙基硫代-β-D-半乳糖苷，37 ℃诱导过夜。当A₆₀₀为4-20时，收集菌液。10 000×g离心10 min，弃上清。10 mL裂解缓冲液重悬菌体，超声碎菌，裂解液10 000×g离心15 min，提取上清液。按照His-tag蛋白纯化试剂盒说明书，融合蛋白与Ni⁺柱结合，30 mmol/L的咪唑溶液洗脱Ni⁺柱上结合的融合蛋白，10 ku的超滤离心管除去洗脱液中的咪唑，收集纯化的融合蛋白His6-CSN。以未加表达诱导剂异丙基硫代-β-D-半乳糖苷进行摇菌作为对照组，其余操作同实验组。

十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gelelectrophoresis, SDS-PAGA)和Western-blot检测融合蛋白His-CSN：将收集的融合蛋白加入十二烷基硫酸钠样品缓冲液，置于沸水浴5 min，取出后12 000×g离心5 min。取20 μL的上清液加入15%聚丙烯酰胺凝胶样品孔中，90 V电压电泳30 min。当溴酚蓝进入分离胶时，调电压至120 V，电泳90 min，此时溴酚蓝到达分离胶底部，将马考斯亮蓝染色液(0.1%考马斯亮蓝R-250，10%冰醋酸)加热至90 ℃，染色20 min，10%冰醋酸脱色至透明，通过UVP GDS-8000凝胶成像分析系统凝胶。未经过热考马斯亮蓝染色的电泳后凝胶，转至聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)上，5%脱脂牛奶封闭，与多组氨酸抗体，室温下孵育1.0-2.0 h。TBST缓冲液(Tris-Buffered Saline with 1% Tween 20)洗3次，每次 5 min，与稀释的抗多组氨酸抗体(辣根过氧化物酶标记的二抗，1∶5 000)室温下孵育1.0-2.0 h后。以TBST缓冲液洗3次，每次10 min，浸没于鲁米诺化学发光底物液中 5 min，FluorChem M化学发光凝胶成像系统进行化学发光显影。

重组原核表达融合蛋白His6-CSN酶活性测定：壳聚糖酶的活性通过壳聚糖水解产生的还原糖数量的测定而确定^[28]，利用DNS比色法测定还原糖浓度。Bradford法(以BSA为标准物)检测纯化的融合蛋白His6-CSN。

取适量的融合蛋白加入总体积为0.3 mL PBS，然后与0.3 mL的壳聚糖溶液(质量分数为1%，pH=6.0)混合，37 ℃水浴30 min，沸水浴15 min终止反应，冷却至室温，5 000×g离心5 min，DNS法测定上清液中的还原糖浓度，即加入 0.6 mL的二硝基水杨酸试剂(以氨基葡萄糖NAG作标准曲线)，分光光度计测定540 nm处的值。一个酶活力单位(U)定义为37 ℃、pH 6.0时，每min释放1 μmol还原糖所需的酶量，壳聚糖酶的活性以比活性(U/μg)进行表示。同时测定溶菌酶和灰色链霉菌壳聚糖酶的壳聚糖降解活性作为对照。

pH对His6-CSN酶活性的影响：将壳聚糖溶于不同pH值(4.0-8.0)的醋酸/醋酸钠缓冲溶液，配制成不同pH值的1%壳聚糖溶液。取各pH值的壳聚糖溶液0.3 mL，于37 ℃水浴中保温10 min，然后加入0.3 mL适度稀释的壳聚糖酶溶液，按上述DNS法测定其酶的活性。定义pH为6.0时的酶活性为100%，将不同pH值条件下的酶活性表示为与之比较的相对活性。

温度对His6-CSN酶活性的影响：将壳聚糖溶于pH值为6.0的醋酸/醋酸钠缓冲液，配制成1%壳聚糖溶液。取壳聚糖溶液0.3 mL于不同温度(20-70 ℃)的水浴中保温 10 min，然后加入0.3 mL适度稀释的壳聚糖酶溶液，按上述的DNS法测定其酶的活性。定义37 ℃时的酶活性为100%，将不同温度条件下的酶活性表示为与之比较的相对活性。

主要观察指标：融合蛋白的表达及酶活性，不同pH值及温度对壳聚糖酶活性的影响。

统计学分析：应用SPSS 13.0统计软件分析，计量资料以x(_)±s表示，样本均数比较采用方差分析，进一步两两比较采用LSD-t 检验，P < 0.05认为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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讨论

目前，壳聚糖酶在基因工程方面的研究越来越多，许多生物来源的壳聚糖酶基因已被克隆并进一步研究，这些壳聚糖酶主要是来源于细菌、真菌^[29-30]。壳聚糖酶按水解壳聚糖方式的不同可以分为内切酶和外切酶，内切型壳聚糖酶以随机方式作用于壳聚糖分子链内部，使壳聚糖的聚合度迅速降低，通过乌氏黏度计检测发现壳聚糖溶液的黏度快速下降；而外切型壳聚糖酶从壳聚糖分子的一端依次逐一切下氨基葡萄糖残基，生成氨基葡萄糖单体^[23]，壳聚糖溶液的黏度下降缓慢。通过薄层层析分析对比内切型壳聚糖酶和外切型壳聚糖酶的酶解产物，结果发现内切壳聚糖酶的酶解产物是壳寡糖，而外切型壳聚糖酶的酶解产物是氨基葡萄糖和壳寡糖的混合物^[31]。不同来源的壳聚糖酶的理化性质及生物活性相差较大。细菌源壳聚糖酶和真菌源壳聚糖酶的氨基酸序列和分子质量差别较大，真菌源壳聚糖酶的相对分子质量一般大于40 000，同时产内切型壳聚糖酶和外切型壳聚糖酶；而细菌源壳聚糖酶的相对分子质量较小，在10 000-40 000范围内，有的相对分子质量甚至低于10 000，且绝大多数是内切型壳聚糖酶^[32]。分泌壳聚糖酶的原核微生物主要有Bacillus属、Streptomyces属和Myxobacter属等^[20-23]，而分泌壳聚糖酶的真核微生物主要有Aspergillus属、Penicillium属和Fusarium solani等^[21-33]。根据氨基酸序列的相似性，几乎所有的真菌源壳聚糖酶都是属于糖苷水解酶75号家族^[34]，而细菌源壳聚糖酶大多是属于糖苷水解酶46号家族^[35]。

本实验根据GenBank中公布的曲霉菌CJ22-326内切型壳聚糖酶基因的序列信息(EU302818)，设计并合成23条重叠引物，连续延伸PCR法扩增壳聚糖酶基因片段克隆构建了重组原核表达质粒pET28a-His6-CSN，通过IPTG诱导表达融合蛋白His6-CSN。由于该融合蛋白具有His标签，利用Ni²⁺-NTA柱结合His标签，从而吸附融合蛋白，利用不同浓度梯度的尿素和咪唑溶液，分别洗脱吸附的融合蛋白，用超滤管除去咪唑，得到纯化的融合蛋白。SDS-PAGE检测及Western-blot检测证实相对分子质量约为29 000的融合蛋白His6-CSN成功表达。DNS法通过检测还原糖的生成，说明壳聚糖酶能够有效降解壳聚糖，在 37 ℃、pH=6.0时，壳聚糖酶活性达到(14.055±0.375) U/μg，显著高于非特异性酶，如溶菌酶。虽低于商品化的灰色链霉菌壳聚糖酶的活性，但壳聚糖酶基因可通过基因治疗的方式促使其在靶细胞或靶组织局部持续表达，并克服商品化壳聚糖酶的半衰期短、反复使用不仅价格昂贵且会很快被稀释和代谢等缺陷。

本实验中通过检测不同pH值和温度条件下的壳聚糖酶相对活性，明确壳聚糖酶的最适pH值和温度，且酶在pH为4.0-7.0和温度30-50 ℃范围内具有较高的活性，说明曲霉菌内切型壳聚糖酶可以在体内利用。当超过50 ℃时，酶活性随着温度的升高而降低，达到70 ℃时，由于高温导致壳聚糖酶的活性结构遭到破坏，完全丧失活性。当pH大于7.0时，壳聚糖酶分子上的氨基酸残基解离状态改变，影响壳聚糖酶与壳聚糖的结合能力及催化反应，同时，壳聚糖在偏碱性的溶液环境中溶解度低，其分子伸展不充分，不易被壳聚糖酶迅速降解^[36]。因此，曲霉菌内切型壳聚糖酶的最适pH溶液环境为偏酸性。对于不同来源的壳聚糖酶的最适pH和最适温度有所差异，细菌源壳聚糖酶的最适PH值比较接近中性(pH 6.0-7.0)，反应最适温度在50-65 ℃；而真菌源壳聚糖酶的最适pH值更加偏酸性条件(pH 4-6.5)，反应最适温度在50-55 ℃^[32]。

壳聚糖酶的降解产物壳寡糖具有比大分子壳聚糖更独特的作用，在医药各领域有广泛的应用^[37-48]。申杰等^[37]通过建立高脂血症小鼠模型研究壳寡糖对血脂和肝脏的保护作用，结果发现壳寡糖可以显著下降高脂血症小鼠血清中的总胆固醇含量及丙氨酸转氨酶和天冬氨酸转氨酶的活性，提高高密度脂蛋白含量，起到降低血脂和保护肝脏的作用。张沛等^[38]研究壳聚糖酶降解产物壳寡糖对小鼠腹腔巨噬细胞增殖和吞噬能力的影响，结果发现壳寡糖可以被巨噬细胞吞噬，增强巨噬细胞的吞噬能力，刺激巨噬细胞分泌肿瘤坏死因子α，增加其杀伤活性，具有较好的免疫调节功能。金黎明等^[39]通过研究壳寡糖及其衍生物对体外培养成骨细胞增殖的作用，结果发现在一定浓度范围内壳寡糖及其衍生物对体外培养成骨细胞具有不同程度的促增殖作用，且壳寡糖的效果优于氨基葡萄糖和羧甲基壳寡糖，由此可见，壳寡糖可以促进骨折的修复与愈合。

实验成功地克隆曲霉菌CJ22-326内切型壳聚糖酶基因并在大肠杆菌中表达，测定了酶活性并初步探讨了影响其活性的因素，为进一步在医药领域的应用提供了实验依据。但该壳聚糖酶基因对壳聚糖介导的基因转染在不同细胞中的影响如何，以及在活体内环境多种因素影响下如何发挥其效用，尚需进一步研究以验证其有效性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程
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曲霉菌内切型壳聚糖酶基因克隆及在大肠杆菌中的表达

Cloning and expression of Asperguillus endo-chitosanase gene in Escherichia coli

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