富血小板血浆复合软骨细胞构建可注射性组织工程化软骨

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.30.002

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (30): 4764-4770.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.30.002

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富血小板血浆复合软骨细胞构建可注射性组织工程化软骨

吴俊，张俊，刘锦波

常州市第一人民医院骨科，江苏省常州市 213003

修回日期:2014-04-18 出版日期:2014-07-16 发布日期:2014-08-08
通讯作者: 刘锦波，主任医师，常州市第一人民医院骨科，江苏省常州市 213003
作者简介:吴俊，男，1975年生，江苏省常州市人，汉族，苏州大学附属第一医院在读博士，副主任医师，主要从事关节外科研究。
基金资助:
常州市卫生局重大课题(2D2011008)

Platelet-rich plasma combined with chondrocytes for construction of injectable tissue-engineered cartilage

Wu Jun, Zhang Jun, Liu Jin-bo

Department of Orthopedics, First People’s Hospital of Changzhou, Changzhou 213003, Jiangsu Province, China

Revised:2014-04-18 Online:2014-07-16 Published:2014-08-08
Contact: Liu Jin-bo, Chief physician, Department of Orthopedics, First People’s Hospital of Changzhou, Changzhou 213003, Jiangsu Province, China
About author:Wu Jun, Studying for doctorate, Associate chief physician, Department of Orthopedics, First People’s Hospital of Changzhou, Changzhou 213003, Jiangsu Province, China
Supported by:
the Major Project of Changzhou Health Bureau, No. 2D2011008

摘要/Abstract

摘要：

背景：富血小板血浆中含有大量的生长因子，因此其在骨再生、创伤愈合等方面得到了较多的应用，然而其在组织工程软骨的研究报道较少。
目的：观察富血小板血浆对软骨细胞增殖和分化的影响，以及富血小板血浆复合软骨细胞构建组织工程化软骨的可行性。
方法：检测兔全血、富血小板血浆及激活富血小板血浆中转化生长因子β、胰岛素样生长因子1、血小板源性生长因子BB及表皮生长因子的浓度。将兔软骨细胞在分别含10%，15%，20%，30%富血小板血浆的DMEM培养液中培养7 d，CCK-8法检测细胞增殖，QT-PCR检测细胞内Ⅱ型胶原、蛋白聚糖、Sox-9的表达。在兔皮下注射自体富血小板血浆与软骨细胞复合物，6周后取材进行组织学检测。
结果与结论：富血小板血浆中各生长因子浓度高于全血(P < 0.05)，激活富血小板血浆中各生长因子浓度高于富血小板血浆(P < 0.05)。不同浓度富血小板血浆均能促进软骨细胞的增殖，且20%浓度内呈浓度依赖性。20%浓度组促Ⅱ型胶原表达的能力强于其他浓度组(P < 0.05)，15%浓度组促Sox-9和蛋白聚糖表达的能力强于其他浓度组(P < 0.05)。富血小板血浆-软骨细胞复合物移植后，新生组织呈软骨样并有明显的软骨陷窝，细胞外富含软骨样基质，表明其作为可注射性支架用于软骨组织工程。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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关键词: 生物材料, 软骨生物材料, 富血小板血浆, 软骨细胞, 软骨组织工程, 组织再生, 生长因子

Abstract:

BACKGROUND: Owing to containing large amounts of growth factors, platelet-rich plasma has been widely used in bone regeneration, wound healing, and so on, while few studies have been reported on cartilage tissue engineering.
OBJECTIVE: To explore the effects of platelet-rich plasma on the proliferation and differentiation of chondrocytes, and the feasibility of constructing tissue-engineered cartilage by the combination of chondrocytes and platelet-rich plasma.
METHODS: We detected the concentrations of transforming growth factor-β, insulin-like growth factor-1, platelet-derived growth factor and epidermal growth factor BB in the whole blood, platelet-rich plasma, and activated platelet-rich plasma. The rabbit articular chondrocytes were cultured in 10%, 15%, 20%, 30% platelet-rich plasma for 7 days, then the cell proliferation was tested by cell counting kit-8, and cartilage-related genes (collagen type II, Aggrecan, Sox-9) were determined using QT-PCR. The chondrocytes/platelet-rich plasma composite was implanted subcutaneously into the rabbits, and the samples were harvested after 6 weeks of transplantation for histological examination.
RESULTS AND CONCLUSION: The levels of different growth factors in the platelet-rich plasma were higher than those in the whole blood (P < 0.05), but lower than those in the activated platelet-rich plasma (P < 0.05). Platelet-rich plasma at different concentrations promoted the proliferation of chondrocytes. When the
concentration of platelet-rich plasma was no more than 20%, the proliferation of chondrocytes showed a concentration-dependent manner. The 20% platelet-rich plasma showed the best effects to promote the expression of collagen type II (P < 0.05), while the 15% platelet-rich plasma could maximize the expression of Sox-9 and Aggrecan (P < 0.05). After transplantation of chondrocytes/platelet-rich plasma composite, cartilage-like tissue formed with cartilage lacuna-like structures, and rich extracellular matrix was found, which indicates platelet-rich plasma can be used as an injective scaffold in cartilage tissue engineering.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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Key words: platelet-rich plasma, chondrocytes, tissue engineering, cartilage

中图分类号:

R318

吴俊，张俊，刘锦波. 富血小板血浆复合软骨细胞构建可注射性组织工程化软骨[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(30): 4764-4770.

Wu Jun, Zhang Jun, Liu Jin-bo. Platelet-rich plasma combined with chondrocytes for construction of injectable tissue-engineered cartilage[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(30): 4764-4770.

图/表（结果） 3

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引言

组织工程化软骨是修复软骨缺损具有前景的方法之一，软骨组织工程包括种子细胞、支架材料和微环境3大要素^[1-4]。虽然干细胞作为软骨种子细胞一度以来成为软骨再生领域研究的重点，但通过干细胞构建组织工程化软骨依然面临着许多问题，比如构建的软骨表型不稳定，移植到皮下环境中后容易发生血管化、骨化等现象，严重影响着干细胞作为理想的种子细胞用于软骨组织工程^[5-6]。目前研究表明软骨细胞仍然是软骨组织工程最为理想的种子细胞^[7-9]，然而由于软骨细胞是终末分化细胞，体外扩增能力有限，容易老化^[9-13]。因此，如何在体外促进软骨细胞的增殖，以及保持软骨细胞的分化能力成为研究的重点。为了解决这个问题，有研究在软骨细胞体外扩增过程中添加生长因子^[14]，Jonitz等^[15]报道转化生长因子β1和胰岛素样生长因子1可以影响软骨细胞再分化的能力；Chen等^[16]报道胰岛素样生长因子1可以促进软骨细胞在体外的增殖。在软骨组织构建过程中，如果有一种生物可降解支架本身就含有高浓度的生长因子，那么它是否可以达到更加良好的效果？

近来，富血小板血浆凝胶作为组织工程支架材料得到越来越多的研究。富血小板血浆是通过离心全血后得到的血小板浓缩物，通过钙离子和凝血酶的激活形成凝胶^[17-21]，具有多种生物学特性：①是从自体静脉血抽取离心获得的，具有良好的生物相容性，植入体内后无免疫排斥和炎症反应等问题。②加入激活剂后，富血小板血浆凝成胶状物并含有高浓度的纤维蛋白原，后者经透射电镜观察证实形成纤维网状支架结构。③富血小板血浆被激活后，血小板α颗粒释放出大量生长因子，包括转化生长因子β、血小板源性生长因子、胰岛素样生长因子、成纤维细胞生长因子及血管内皮生长因子等，这些生长因子能促进细胞增殖及细胞外基质合成，对创伤的愈合及组织的再生有着极其重要的作用^[17，22]。④可以任意塑形，也可以注射使用，对于修复临床上常见的不规则软骨缺损具有优势。富血小板血浆技术最早被应用于口腔外科手术，后来被广泛应用于治愈大面积烧伤、慢性溃疡和肢体溃烂等疾病^[22-23]，然而有关其在组织工程软骨中的研究报道较少^{[20-21，24-25]}。因此实验主要探讨富血小板血浆对软骨细胞增殖、分化的影响，以及在复合软骨细胞后体内构建组织工程化软骨的能力。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程
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材料方法

设计：体外细胞学观察实验。

时间及地点：于2013年1月至2014年1月在苏州大学医学院动物实验中心完成。

材料：

实验动物：8周龄新西兰大白兔6只，雌雄不拘，体质量1 500-2 500 g，由苏州大学动物实验中心提供。实验过程中对动物处置符合动物伦理学要求。

实验方法：

软骨细胞的分离和培养：将6只新西兰大白兔以1.5%戊巴比妥钠(2.0 mL/kg)耳缘静脉麻醉，常规消毒铺巾，无菌条件下用角膜钻钻取少量非负重区关节软骨，剪成碎片，氯霉素浸泡30 min，PBS冲洗3次，然后加入3倍体积0.2% Ⅱ型胶原酶37 ℃振荡消化8 h，200目无菌滤器去除未消化完全组织块，离心，PBS重悬离心去除胶原酶，高塘DMEM培养液(含体积分数10%胎牛血清和1%抗生素)重悬后，以2.0×10⁵/cm²密度接种到100 mm培养皿中，在37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中培养，每2 d换液1次^[26-28]。待细胞长至80%-90%后用0.25%胰酶消化传代。取第3代关节软骨细胞用于组织工程化软骨的构建。

富血小板血浆的制备：抽取6只新西兰大白兔耳缘静脉血各20 mL(含10%枸橼酸钠)，采用二次离心法制备富血小板血浆^[17^，^29]。第1次离心(200×g，5 min)吸取上层血浆和下层2 mm红细胞，第2次离心(200×g，10 min)弃上层大部分血清，将留下的少量血清和底部红细胞与白细胞的浓缩混合物混匀，即为富血小板血浆。

富血小板血浆的激活与不同浓度富血小板血浆的制备：将1 mL激活剂(质量分数10%的氯化钙溶液和牛凝血酶按10∶1的体积比混合)加入10 mL富血小板血浆中，置于 4 ℃冰箱过夜，离心(1 800× g，15 min)后吸取上清^[30-32]。将获取的富血小板血浆分别按体积分数10%，15%，20%，30%加入DMEM培养液，获取不同浓度的富血小板血浆萃取液，用于培养软骨细胞。

富血小板血浆中生长因子的检测：采用酶联免疫吸附剂测定法分别测定新西兰大白兔全血中、富血小板血浆和激活富血小板血浆中转化生长因子β1、胰岛素样生长因子1、血小板源性生长因子BB及表皮生长因子的浓度，具体过程为：向预先包被了兔转化生长因子单克隆抗体的酶标孔中加入样本，温育；温育后，加入生物素标记的抗转化生长因子β抗体。再与链霉亲和素-HRP结合形成免疫复合物，再经过温育和洗涤，去除未结合的酶，然后加入底物 A、B，产生蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。使用酶标仪在吸光度450 nm条件下测量吸光度，每个标本测量6份，计算平均值和标准差，结果进行统计学分析。样品中兔转化生长因子的浓度和吸光度值呈正相关^[33-34]。可同理测定其他细胞因子。

不同浓度富血小板血浆萃取液对软骨细胞增殖的影响：取第3代软骨细胞，以1×10³/孔的密度接种于96孔培养板培养，24 h后换为条件培养液(含体积分数10%，15%，20%，30%富血小板血浆的DMEM培养液)继续培养。每个样本重复种6孔，培养0，1，3，5，7 d后进行CCK-8检测。吸出每孔原有培养液，然后每个孔里加入100 µL DMEM和10 µL CCK-8试剂孵育3 h，酶联免疫检测仪下以450 nm波长检测各孔细胞吸光度值并计算平均值，结果进行统计学分析^[35]。

富血小板血浆对软骨细胞分化的影响：取第3代软骨细胞，以5×10⁴/孔的密度接种于6孔板中，24 h后分别加入体积分数10%，15%，20%，30%的富血小板血浆萃取液培养，每2 d换液，7 d后进行Ⅱ型胶原、蛋白聚糖、Sox-9的QT-PCR检测。利用TRIzol提取各组培养细胞的RNA，取各组RNA样本1 μL，通过反转录合成cDNA。引物序列分别为：Ⅱ型胶原，F：5’-CAC CAA ATT CCT GTT CAG CC，R：3’-TGC ACG AAA CAC ACT GGT AAG，预期产物大小124 bp；蛋白聚糖，F：5’-GGA GAT GGA GGG TGA GGT CT，R：3’-GTG TAG CAG ATG GCG TCG TA，预期产物大小为185 bp；Sox-9，F：5’-AAG AAC AAG CCC CAC GTC AA，R：3’-TCC GGG TGG TCT TTC TTG TG，预期产物大小215 bp；GAPDH，F：5’-TCA CCA TCT TCC AGG AGC GA，R：3’-CAC AAT GCC GAA GTG GTC GT，预期扩增产物为293 bp。使用GAPDH为检测目的基因表达的对照。用PCR方法扩增目的片段，分析各组样本中Ⅱ型胶原、蛋白聚糖、Sox-9的相对表达情况。每组样品重复测定3次。QT-PCR的操作按照Takara qPCR试剂盒说明书进行。

PCR反应体系的组成为：5 μL Master mix液、0.2 μL ROX染料、0.5 μL上游特异性引物、0.5 μL下游特异性引物及1.0 μL反转录产物(反转录所得cDNA稀释10倍)。所有基因产物的PCR循环参数：95 ℃预变性6 min，95 ℃变性15 s，59 ℃退火、延伸1 min，变性、退火和延伸3个步骤进行40个循环后，60 ℃延伸1 min，最后终止反应^[36-37]。

软骨细胞-富血小板血浆凝胶复合物的制备及移植：将兔自体第3代软骨细胞(2×10⁹ L^-¹)和1 mL富血小板血浆混合均匀，加入激活剂吹打均匀，将软骨细胞-富血小板血浆凝胶复合物1 mL注射到兔自体背部皮下培养6周后取材，行大体观察及苏木精-伊红染色、Safranin-O染色及Ⅱ型胶原免疫组织学染色^[38-40]。

主要观察指标：富血小板血浆对软骨细胞增殖和分化的影响，以及富血小板血浆复合软骨细胞构建组织工程化软骨的可行性。

统计学分析：采用SPSS 16.0软件对所得数据进行统计学分析，同一时间点的各组数据之间使用方差分析，同一组的不同时间点之间使用配对t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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讨论

实验证实富血小板血浆含有丰富的生长因子，并且在其被激活后能释放更高浓度的生长因子，这说明富血小板血浆的激活对生长因子的释放具有促进作用，并且这些生长因子正是软骨增殖和分化中的重要因子^[27-29]。其中转化生长因子β1在软骨分化中起着至关重要的作用，它可以促进关节软骨细胞的增殖和软骨特异性基质代谢，刺激细胞外基质中蛋白聚糖含量的表达，上调节Ⅱ型胶原的表达；胰岛素样生长因子1可明显促进软骨细胞的分裂增殖和软骨细胞外基质的合成，刺激软骨细胞合成Ⅱ型胶原，增加糖胺聚酶的活性等。从实验结果可以看出，不同浓度富血小板血浆对软骨细胞增殖能力的影响不同，然而实验也发现并非浓度越高促增殖能力越强，在本实验中发现20%富血小板血浆促进细胞增殖能力最强，与30%富血小板血浆的促增殖能力没有明显区别，具体机制仍不明确。在对细胞分化能力的作用上同样也存在这样的趋势：即15%富血小板血浆培养的软骨细胞其相关软骨基因的表达能力最强，这可能与细胞在增殖和分化过程中的相互作用有关。实验结果显示，软骨细胞-富血小板血浆复合物移植到自体环境后未发生明显的炎症反应，在体内形成了良好的软骨组织，软骨陷窝明显，并且表达丰富的细胞外基质，进一步说明了富血小板血浆可以作为软骨组织工程的一种良好生物支架材料。

目前常用的富血小板血浆激活剂是牛凝血酶和氯化钙，当富血小板血浆与氯化钙和凝血酶混合后，生长因子即从血小板中的α颗粒释放出来，形成一种含有高浓度血小板的胶体，同时还含有高浓度的纤维蛋白原，后者是诱导血小板脱颗粒进而释放生长因子的启动物质。血小板通过脱颗粒作用释放生长因子，这些生长因子包括血小板衍生生长因子、转化生长因子β、表皮样生长因子、血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子等^[41]，另外含有血液中的3种蛋白质，即纤维素、纤粘连蛋白及亲玻粘连蛋白^[42]。这些生长因子对细胞生长分化和组织形成有极其重要的作用^[8]。对于富血小板血浆促进软骨损伤修复的机制尚未完全阐明，一般认为聚合过程中血小板脱颗粒释放多种高浓度生长因子，生长因子通过跨膜受体结合到细胞膜外表面，这些跨膜受体反过来诱导内源性细胞内信号蛋白的活性，促进软骨细胞增殖和基质形成^[41]。经酶联免疫吸附实验证实，富血小板血浆中除了胰岛素样生长因子以外，其他生长因子的浓度为体内正常浓度的3-8倍^[43]。

Akeda等^[44]以含10%富血小板血浆、10%贫血小板血浆和10%胎牛血清的培养基分别培养软骨细胞，检测细胞增殖及细胞外蛋白聚糖与胶原含量。结果表明富血小板血浆能够促进软骨细胞增殖及基质中蛋白聚糖和胶原合成，并且促胶原合成的能力较促进蛋白聚糖合成的能力更强。另外，新生蛋白聚糖和胶原的类型没有改变，即在富血小板血浆促进细胞增殖的同时可以保持其表型稳定。Drengk等^[45]将软骨细胞分别以细胞团块、细胞团块添加富血小板血浆、细胞悬浮于纤维蛋白凝胶、细胞悬浮于富血小板血浆、贴壁培养、贴壁培养添加富血小板血浆6种方式进行培养，观察富血小板血浆对细胞增殖和特征性基质成分Ⅱ型胶原mRNA表达的影响。研究表明在上述培养方式中，富血小板血浆能够促进软骨细胞增殖，但在三维立体培养和平面培养中添加富血小板血浆可以显著降低Ⅱ型胶原mRNA的表达，即影响软骨细胞表型的稳定性。这一方面与软骨细胞增殖加快的同时易于去分化有关，也与富血小板血浆释放的转化生长因子β能够抑制Ⅱ型胶原mRNA的表达有关^[46-47]。Park等^[48]研究了不同浓度(1%，5%，10%和20%)富血小板血浆和培养时间对软骨细胞增殖及相关特征性基因(转化生长因子β、血小板源性生长因子受体β、Sox-9、蛋白聚糖、骨形态发生蛋白2、骨形态发生蛋白7、血管内皮生长因子、ChM-I)表达的影响。培养24 h时，5%富血小板血浆对软骨细胞增殖的促进作用最明显，培养至96 h时，富血小板血浆浓度与促进细胞增殖的能力呈正相关。而在相同的培养时间，富血小板血浆浓度与软骨细胞相关基因的表达量，或者富血小板血浆在浓度不变的情况下，培养时间与软骨细胞相关基因的表达量之间没有明确的正相关性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程
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富血小板血浆复合软骨细胞构建可注射性组织工程化软骨

Platelet-rich plasma combined with chondrocytes for construction of injectable tissue-engineered cartilage

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