闭塞性细支气管炎模型大鼠微小RNA差异表达谱分析

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.18.012

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (18): 2855-2860.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.18.012

• 器官移植动物模型 organ transplantation and animal model • 上一篇下一篇

闭塞性细支气管炎模型大鼠微小RNA差异表达谱分析

汪进益，曹浩，洪暄，陈国涵，范慧敏，李钦传，刘中民

同济大学附属东方医院胸心外科，上海市 200120

收稿日期:2014-02-14 出版日期:2014-04-30 发布日期:2014-04-30
通讯作者: 李钦传，博士，教授，同济大学附属东方医院胸心外科，上海市 200120 并列通讯作者：范慧敏，博士，教授，同济大学附属东方医院胸心外科，上海市 200120
作者简介:汪进益，男，1974年生，江西省婺源县人，汉族，2007年同济大学毕业，博士，主要从事胸心外科围手术期脏器保护及心肺联合移植应用的基础研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(81372299)；上海市自然科学基金项目(124119a7900)；上海市浦东新区卫生局卫生科技项目(PW2012A-2)

Differential expression profiles of microRNAs in a rat model of obliterative bronchiolitis

Wang Jin-yi, Cao Hao, Hong Xuan, Chen Guo-han, Fan Hui-min, Li Qin-chuan, Liu Zhong-min

Department of Cardiovascular and Thoracic Surgery, East Hospital of Tongji University, Shanghai 200120, China

Received:2014-02-14 Online:2014-04-30 Published:2014-04-30
Contact: Li Qin-chuan, M.D., Professor, Department of Cardiovascular and Thoracic Surgery, East Hospital of Tongji University, Shanghai 200120, China Corresponding author: Fan Hui-min, M.D., Professor, Department of Cardiovascular and Thoracic Surgery, East Hospital of Tongji University, Shanghai 200120, China
About author:Wang Jin-yi, M.D., Department of Cardiovascular and Thoracic Surgery, East Hospital of Tongji University, Shanghai 200120, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81372299; Natural Science Foundation of Shanghai in China, No. 124119a7900; Science and Technology Project of Health Bureau of Pudong New Area, Shanghai, No. PW2012A-2

摘要/Abstract

摘要：

背景：目前对于气管移植后并发闭塞性细支气管炎尚无有效的治疗方法。miRNA分子水平机制的治疗策略在防治器官移植后并发症方面具有重要意义。
目的：分析大鼠原位气管移植模拟肺移植后发生闭塞性细支气管炎的微小RNA 表达谱变化。
方法：通过近交系大鼠原位气管移植，模拟建立肺移植闭塞性细支气管炎的动物模型并经病理学证实；通过微小RNA芯片筛选出供体移植气管闭塞性细支气管炎组织中显著差异表达的微小RNA，并选取差异表达显著的miR-146a、miR-155和miR-451进行相对定量研究，应用实时定量RT-PCR(RT-qPCR)法验证芯片结果的可靠性。
结果与结论：原位气管移植后4周经病理检查证实大鼠闭塞性细支气管炎模型成功建立。microarray检测获得29个与闭塞性细支气管炎相关的微小RNA，包括15个微小RNA表达显著上调，14个微小RNA表达显著下调，其中显著上调miR-146a、miR-155和显著下调miR-451的功能涉及免疫炎症反应等。提示微小RNA在肺移植后闭塞性细支气管炎病理进程中发挥着重要的调控作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

全文链接：

关键词: 实验动物, 组织构建, 气管移植, 肺移植, 闭塞性细支气管炎, 微小RNA, 基因表达谱, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: There is no effective therapy for obliterative bronchiolitis after tracheal transplantation. A therapeutic strategy at microRNA (miRNA) molecular level plays a crucial role in the prevention and treatment of complications after organ transplantation.
OBJECTIVE: To analyze the miRNA differential expression profile in response to obliterative bronchiolitis after orthotopic tracheal transplantation in rats.
METHODS: The obliterative bronchiolitis model after lung transplantation was established through orthotopic tracheal transplantation in inbred strains of rats, and then was identified using histoIogical examination. Total miRNAs were detected by miRNA array and significantly differential expressed miRNAs were filtrated in the transplanted trachea tissues. The miRNA-146a, miRNA-155 and miRNA-451 with significantly differential expressions were used for relative quantitative study. Quantitative real-time reverse transcription-polymerase chain reaction was applied to verify the reliability of miRNA array results.
RESULTS AND CONCLUSION: The pathological examination showed that, obliterative bronchiolitis model in rats was successfully established at 4 weeks after orthotopic tracheal transplantation. A total of obliterative bronchiolitis-related 29 miRNAs were found in miRNA expression profiles, including 14 miRNAs with significantly down-regulated expression and 15 miRNAs with significantly up-regulated expression. Among them, the significantly up-regulated miRNAs (miRNA-146a and miRNA-155) and the significantly down-regulated miRNA-451 were involved in immuno-inflammatory reaction. The miRNAs play an important role in regulating pathophysiological changes of obliterative bronchiolitis after lung transplantation.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

全文链接：

Key words: trachea, transplantation, lung transplantation, bronchiolitis obliterans

中图分类号:

R318

汪进益，曹浩，洪暄，陈国涵，范慧敏，李钦传，刘中民. 闭塞性细支气管炎模型大鼠微小RNA差异表达谱分析[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(18): 2855-2860.

Wang Jin-yi, Cao Hao, Hong Xuan, Chen Guo-han, Fan Hui-min, Li Qin-chuan, Liu Zhong-min. Differential expression profiles of microRNAs in a rat model of obliterative bronchiolitis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(18): 2855-2860.

图/表（结果） 1

2.1 实验动物数量分析实验选用供体BN大鼠6只，供体和受体Lewis大鼠18只，分为2组，两组受体大鼠均存活，全部进入结果分析。

2.2 大鼠气管移植一般状况标本采集前各组大鼠均存活。移植后大鼠精神状态稍差，但进食无异常；活动后有轻中度喘鸣，未见合并呼吸衰竭、窒息等征象，亦无感染迹象。

2.3 移植气管组织病理学检查结果实验使用具有典型中期(移植后4周)闭塞性细支气管炎形成的移植气管与同期相应的对照组移植物进行比较。两组气管吻合口愈合良好，其周围为颈部肌肉所覆被，软骨无软化，形态完整。移植气管病理苏木精-伊红染色观察(图1)：对照组移植气管的管壁可见柱状纤毛上皮细胞，内皮轻度增厚，但组织形态上无明显异常或仅为轻度的炎性细胞浸润；闭塞性细支气管炎组移植气管壁的上皮发生异常和/或黏膜腺体消失；气管内膜部分见纤毛柱状上皮细胞生长，黏膜下外周炎性细胞浸润和基质沉积、纤维组织增生，管腔内可有肉芽组织形成，管腔不同程度发生闭塞性细支气管炎，发生率为100%。

2.4 miRNA芯片检测结果通过使用miRNA芯片比较分析移植气管闭塞性细支气管炎组与移植气管对照组的miRNA表达谱，检测miRNA总数为699个。共检测出62个差异表达miRNA，其中33个miRNA移植气管闭塞性细支气管炎组/移植气管对照组表达比值在0.5-2.0之间，差异无显著性意义，占总差异表达miRNA的53.23%。有29个miRNA差异表达显著，占总差异表达miRNA的46.77%，其中14个表达显著下调，占差异表达显著miRNA的48.28%；15个表达显著上调，占差异表达显著miRNA的51.72%(表1)。

2.5 RT-qPCR验证miRNA芯片结果根据miRNA微阵列芯片结果挑选表达显著上调者(miR-146a、miR-155)和表达显著下调者(miR-451)进行相对定量研究，证实与芯片一致。结果表明移植气管闭塞性细支气管炎组miR-146a和miR-155基因表达量分别是移植气管对照组的(3.581± 0.886)倍和(3.163±0.529)倍，提示表达量明显上调，两组差异具有显著性意义(P < 0.05)；移植气管闭塞性细支气管炎组miR-451基因表达量是移植气管对照组的(0.032± 0.012)倍，表达量明显下调，差异有显著性意义(P < 0.05)。

利用预测miRNA靶基因常用的TargetScan(http:// targetscan.org/index.html/)数据库预测两组差异表达显著的miRNA靶基因。作为本研究闭塞性细支气管炎组miRNA靶基因的代表，其中miR-146a靶基因是IRAK1和TRAF6，前者与白细胞介素1引起的核因子κB上调有关，后者参与炎症细胞反应；miR-155靶基因为TSHZ3，其参与转录调控；而miR-451的靶基因则是Tollip，与炎症调节有关。

参考文献

[1] Christie JD, Edwards LB, Kucheryavaya AY, et al. The registry of the international society for heart and lung transplantation: twenty-seventh official adult lung and heart-lung transplant report-2010. J Heart Lung Transplant. 2010;29(10): 1104- 1118.
[2] Trulock EP, Christie JD, Edwards LB, et al. Registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: twenty-fourth official adult lung and heart-lung transplantation report-2007. J Heart Lung Transplant.2007; 26(8): 782-795.
[3] 杨守国,王春生,陈昊,等.心肺联合移植1例术后5年随访与移植物功能评价[J]. 复旦学报:医学版,2010, 37(1): 88-91.
[4] Alex KJ, Monique AM, Willart HK, et al. Inducible costimulator blockade prolongs airway luminal patency in a Mouse model of obliterative bronchiolitis. Transplantation.2008;86: 1436- 1444.
[5] Todd JL,Palmer SM.Bronchiolitis obliterans syndrome: the final frontier for lung transplantation. Chest.2011;140(2): 502-508.
[6] Belperio JA,Weigt SS,Fishbein MC,et al.Chronic lung allograft rejection: mechanisms and therapy. Proc Am Thorac Soc. 2009; 6(1):108-121.
[7] Bartel DP. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell.2004;116(2): 281-297.
[8] Arora S, Rana R, Chhabra A, et al. miRNA-transcription factor interactions: a combinatorial regulation of gene expression. Mol Genet Genomics.2013;288(3-4): 77-87.
[9] Ren H, Yang BF, Rainov NG. Receptor tyrosine kinases as therapeutic targets in malignant glioma. Rev Recent Clin Trials.2007;2(2): 87-101.
[10] Everson RG, Graner MW, Gromeier M, et al. Immunotherapy against angiogenesis-associated targets: evidence and implications for the treatment of malignant glioma. Expert Rev Anticancer Ther.2008;8(5): 717-732.
[11] Sarkaria JN, Kitange GJ, James CD, et al. Mechanisms of chemoresistance to alkylating agents in malignant glioma. Clin Cancer Res.2008;14(10): 2900-2908.
[12] Lanford RE, Hildebrandt-Eriksen ES, Petri A, et al. Therapeutic silencing of microRNA-122 in primates with chronic hepatitis C virus infection. Science.2010;327(5962): 198-201.
[13] Zhang M, Zhang Q, Liu F, et al. MicroRNA-155 may affect allograft survival by regulating the expression of suppressor of cytokine signaling 1. Med Hypotheses. 2011;77(4): 682-684.
[14] Hashimi ST, Fulcher JA, Chang MH, et al. MicroRNA profiling identifies miR-34a and miR-21 and their target genes JAG1 and WNT1 in the coordinate regulation of dendritic cell differentiation. Blood.2009;114(2): 404-414.
[15] Shan J,Feng L,Luo L,et al.MicroRNAs: potential biomarker in organ transplantation. Transpl Immunol.2011;24(4): 210-215.
[16] 曹浩,史乾,牛永胜,等.大鼠气管原位移植建立闭塞性细支气管炎模型[J].第三军医大学学报, 2010, 32(15): 1673-1675.
[17] Mantovani A, Cassatella MA, Costantini C, et al. Neutrophils in the activation and regulation of innate and adaptive immunity. Nat Rev Immunol.2011;11: 519-531.
[18] Deuse T, Schrepfer S, Eichenspurner H,et al.Techniques for experimental heterotopic and orthotopic Iracheal transplantations-When to use which model?. Transpl Immunol. 2007;17(4): 255-261.
[19] Trulock EP, Edwards LB, Taylor DO, et al. The registry of the international society for heart and lung transplantation: twentieth official adult lung and heart-lung transplant report-2003. J Heart Lung Transplant.2003;22(6): 625-635.
[20] Christopher MB, Jom C, Jerm M, et al. Long-term survival after lung transplantation depends on development and seventy of bronchiolitis obliterans syndrome. Heart Lung Transplant.2007;26: 681-686.
[21] Weber DJ, Wilkes DS. The role of autoimmunity in obliterative bronchiolitis after lung transplantation. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol.2013;304(5): L307-311.
[22] Mantovani A, Cassatella MA, Costantini C, et al. Neutrophils in the activation and regulation of innate and adaptive immunity. Nat Rev Immunol.2011;11: 519-531.
[23] Snyder LD, Palmer SM. Immune mechanisms of lung allograft rejection. Semin Respir Crit Care Med.2006;27(5): 534-543.
[24] Tsitsiou E, Lindsay MA. microRNAs and the immune response. Curr Opin Pharmacol. 2009;9(4): 514-520.
[25] 骆明勇,田志刚,徐智,等.一种检测microRNA表达的微阵列芯片的研制及应用[J].生物化学与生物物理进展, 2007, 34(1): 31-41.
[26] Contreras J, Rao DS.MicroRNAs in inflammation and immune responses. Leukemia. 2012;26(3): 404-413.
[27] Famoni I, Antonetti FR, Cardone J, et al. miR-155 gene: a typical mulifunctional microRNA. Bioehim Biophys Acts.2009; 1792(6): 497-505.
[28] Taganov KD, Boldin MP, Baltimore D. MicroRNAs and immunity: Tiny players in a big field. Immunity.2007;26(1): 133-137.
[29] Sonkoly E, Wei T, Janson PC, et al. MicroRNAs: Novel regulators involved in the pathogenesis of psoriasis. PLoS ONE.2007;2(7): e610.
[30] Lu LF, Boldin MP, Chaudhry A, et al. Function of miR-146a in controlling Treg cell-mediated regulation ofThl responses. Cell.2010;142: 914-929.
[31] Lindsay MA. microRNAs and the immune response. Trends immunol.2008;29(7): 343-351.
[32] Urbich C, Kuehbacher A, Dimmeler S. Role of microRNAs in vascular diseases, inflammation, and angiogenesis. Cardiovasc Res.2008;79(4): 581-588.
[33] 曹荣华,陈栋,郭晖,等.免疫活性细胞在异种移植急性血管性排斥反应中的意义[J].华中科技大学学报:医学版,2005, 34(3): 316-318.
[34] Ashton-Chess J, Roussel JC, Manez R, et al. Cellular participation in delayed xenograft rejection of hCD55 transgenic pig hearts by baboons. Xenotransplantation. 2003;10(5): 446-453.
[35] Amendola D, De SalVO M, Marchese R, et al. Myc down-regulation affects cyclin D1/cdk4 activity and induces apoptosis via Smac/Diablo pathway in all astrocytoma cell line. Cell Pmlif.2009;42: 94-109.
[36] Guo M, Mao X, Ji Q, et al. miR-146a in PBMCs modulates Th1 function in patients with acute coremll'y syndreme. Immunol Cell Biol.2010;88(5): 555-564.
[37] Pedersen I, Dam M. MicroRNAs in the immune response. Cytokine.2008;43(3): 391-394.
[38] Taganov KD, Boldin MP, Chang KJ, et al. NF-kappaB-dependent induction of miemRNA miR-146, an inhibitor targeted to signaling proteins of innate immune responses. Proe Natl Acad sci USA.2006;103(33): 12481-12486.
[39] Tnganov KD, Boldin MP, Chang KJ, et al. NF-kappaB-dependent induction of microRNA miR-146, all inhibitor targeted to signaling proteins of innate immune responses. Proc Natl Acad Sci USA.2006;103(33): 12481-12486.
[40] Chan EK, Ceribelli A, Satoh M. MicroRNA-146a in autoimmunity and innate immune responses. Ann Rheum Dis, 2013, 72(Suppl 2): ii90-95.
[41] Pauley KM, Cha S, Chan EK. MicroRNA in autoimmunity and autoimmune diseases. J Autoimmun.2009;32(3-4): 189-194.
[42] Spoerl D, Duroux-Richard I, Louis-Plence P, et al. The role of miR-155 in regulatory T cells and rheumatoid arthritis. Clin Immunol.2013;148(1): 56-65.
[43] Vigorito E, Kohlhaas S, Lu D, et al. miR-155: an ancient regulator of the immune system. Immunol Rev.2013;253(1): 146-157.
[44] LoYL, BeckhouseAG, BoulusSL, et al. Diversification of TOLLIP isoforms in mouse and man. MammGenome. 2009;20(5): 305-314.
[45] Hosiawa KA, Wang H, DeVries ME, et al. CD80/CD86 costimulation regulates acute vascular rejection. J Immunol.2005;175(9): 6197-6204.
[46] Bianchi N, Zuccato C, Finotti A, et al. Involvement of miRNA in erythroid differentiation. Epigenomics.2012 ;4(1): 51-65.

引言

肺移植或心肺联合移植是各种病因引起终末期心肺功能衰竭/肺疾病最有效的方法^[1]，已成为当今器官移植领域和普胸外科界最有潜力的课题之一。随着对患者的选择、器官保护、免疫抑制疗法及围手术期监护等方面的不断改进，特别是随着外科技术的日趋成熟，接受治疗的患者早期生存率不断得到改善；而晚期移植肺发生慢性排斥反应(阻塞性细支气管炎)仍是基础和临床医学亟待解决的主要问题^[2]。

迄今为止，影响肺移植或心肺联合移植患者术后长期生存因素尚不完全清楚。临床上闭塞性细支气管炎是移植肺慢性失功能和影响患者移植后长期生存的最主要原因，为小气道纤维增生和瘢痕形成，进而阻塞细支气管，可同时伴有血管内皮增厚及硬化。

目前对于移植后并发闭塞性细支气管炎尚无有效的治疗方法^[3-6]。非编码微小RNA (microRNA, miRNA)是一类长度在19-24个核苷酸(nt)左右、进化保守的内源性非编码单链小分子RNA^[7-8]，由一段具有发夹样环状结构、长70-80 nt的单链RNA前体(pre-miRNA)经过Dicer酶加工后生成后生成^[9-10]。miRNA与其靶mRNA的3’-UTRs(3’非编码区)特异性结合，在翻译水平上通过降解mRNA或抑制蛋白质翻译的方式调节特异性基因表达，参与调控生物生长和发育等许多复杂的生命过程^{[8, 11]}。

自发现mRNA表达谱并用于寻找重要的功能基因研究后，miRNA表达谱成为发育生物学和病因学研究的新热点。研究表明miRNA具有辅助诊断和治疗的潜力^[12]，尤为重要的是，miRNA在对免疫细胞信号转导的调节中发挥着巨大的作用^[13-14]。

基于miRNA分子水平机制的治疗策略在防治器官移植后并发症、改善移植后长期生存率方面具有十分重要的意义^[15]。

肺移植后闭塞性细支气管炎的病理生理学改变极其复杂，包括免疫学和非免疫学因素及其他致病因素。为了改善预后，需要对移植后闭塞性细支气管炎综合征有更为深入的理解。

因此，实验模拟建立肺移植闭塞性细支气管炎的大鼠动物模型，并对移植物miRNA的表达谱变化进行研究，运用miRNA芯片技术，通过检测分析移植物及正常对照组织中miRNA的表达特点，寻找肺移植术后闭塞性细支气管炎病理病生中差异表达的miRNA，并预测其靶基因，从分子水平探讨肺移植后闭塞性细支气管炎病理病生的发病机制，以期为肺移植或心肺联合移植后闭塞性细支气管炎的发病机制及可能的诊断和防治策略提供实验基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程
全文链接：

材料方法

设计：分组对照观察。

时间及地点：实验于2011年12月至2013年6月在同济大学附属东方医院完成。

材料：

主要仪器和试剂：
仪器及试剂	来源
OPTON眼科手术显微镜	德国
Aesculap显微外科手术器械	德国
Matrx小型动物麻醉机	美国
MPA生物信号采集分析系统	上海奥尔科特生物有限公司
实时定量PCR仪(MJ-RESEARCH)	美国
mirVana miRNA Isolation Kit、反转录试剂盒、TaqMan^® Mi-croRNA Assays购置ABI公司	美国
SM-2000L眼科手术显微镜	上海轶德医疗设备有限公司

实验动物：SPF级近交系Brown Norway(BN)大鼠6只和Lewis大鼠18只，雄性，体质量为(250±50) g，合格证号：SCXK(沪)2003-0002，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司。动物饲养环境为SPF级屏障系统[饲养设施：SYXK(沪)2004-0005]，同济大学附属东方医院转化医学平台动物实验中心。所有实验操作按照动物指南进行；且本研遵循国家实验动物管理条例及国家实验动物管理实施细则。

实验方法：

大鼠闭塞性细支气管炎模型的制备：参考相关文献介绍的方法并予以改良，建立大鼠原位气管移植模型^[16-18], 模拟建立肺移植闭塞性细支气管炎的动物模型。闭塞性细支气管炎组BN大鼠为供体，Lewis大鼠为受体；对照组供体和受体均为Lewis大鼠。

供体BN和Lewis大鼠腹腔注射水合氯醛(350 mg/kg)麻醉成功后取仰卧位，固定于手术台上。颈前正中切口暴露气管颈部，获取最大长度的气管(13-15个气管环)，切端消毒后放入4 ℃生理盐水中冲洗，并将其分为有5个气管环的两段气管作为供移植气管。

受体Lewis大鼠麻醉和固定同供体，也同样行颈前正中切口，分离、暴露气管颈部，分别于第3和第8气管环各缝一针7-0丝线作牵拉，切除第5，6气管环。

将供体气管与受体气管以7-0 Proline端端连续吻合气管膜部后，间断吻合近心端气管软骨部，最后吻合远端气管软骨部，完成气道重建；放正移植气管位置后缝合皮肤。整个移植过程保持自然呼吸，勿需机械通气。

实验分组和标本采集：实验分为移植气管闭塞性细支气管炎组与移植气管对照组2组(n=6)。于造模成功4周后处死受体大鼠，取出移植气管中间横断分为对等两部分。一半用于组织病理学检测：将移植气管段取出后固定于体积分数10%中性甲醛溶液，常规石蜡包埋，制成厚4 μm的切片，行苏木精-伊红染色观察；另一半用于miRNA表达谱分析的研究：供体标本置于液氮中保存，用于miRNA芯片筛选和实时定量RT-PCR(RT-qPCR)验证。

miRNA芯片检测：采用液氮研磨方法将100 mg移植物(气管组织)磨成粉末，加入1 mL Trizol混合，按Trizol说明抽提总RNA。应用北京博奥公司microarray mammalian V3.0芯片检测，每个闭塞性细支气管炎组用3张芯片进行试验，每张芯片重复1次。用Significance Analysis of Microarrays(SAM，version3.0)软件挑选差异表达的miRNA。用Cluster 3.0对差异表达的miRNA进行聚类分析，筛选出上调和下调的miRNA：若样本标准值与对照组标准值的比值(Ratio, R)> 2为差异表达显著上调；< 0.5为差异表达显著下调；0.5-2.0为差异表达不显著。

RT-qPCR验证miRNA：使用mirVana miRNA Isolation Kit提取miRNA；应用带有目标特异性茎环结构stem-loop RT引物进行反转录RT反应。PCR扩增条件: 95 ℃，15 s，60 ℃，30 s，40个循环，内参为U6。75-95 ℃绘制熔解曲线，使用TaqMan® MicroRNA Assays进行PCR扩增，非变性琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增情况。将测量数据转化后进行统计处理，计算miRNA的相对表达量，验证芯片结果。

主要观察指标：①移植气管组织病理学检查。②miRNA芯片检测结果。③RT-qPCR验证miRNA芯片结果。

统计学分析：采用SPSS 17.0统计软件包进行分析处理。计量资料用x(_)±s表示，比较采用t 检验，以P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

全文链接：

讨论

肺移植或心肺联合移植是临床上治疗某些终末期心肺疾病的重要手段。随着外科手术技术日趋成熟以及新免疫抑制剂的不断推出，心肺联合移植或肺移植术后早期的生存率不断得到改善；然而长期存活仍受到闭塞性细支气管炎等慢性并发症的影响，成为限制肺移植或心肺联合移植术后长期生存和生活质量的最重要因素。尽管近年来在肺移植闭塞性细支气管炎的致病因素及发病机制等方面的研究取得了突破性进展，为闭塞性细支气管炎的防治提供了更多探索性的药物治疗和外科手术方案，但整体疗效仍不甚理想。国际心肺移植协会(ISHLT)的最新统计资料显示，接受肺移植或心肺联合移植患者的5年存活率仅有30%- 40%^[19-21]。

目前临床对肺移植闭塞性细支气管炎的治疗效果不佳，研究闭塞性细支气管炎的发病机制及防治策略是当前基础和临床医学亟待解决的主要问题^[2]。肺移植闭塞性细支气管炎涉及多种免疫途径、多因素参与的复杂过程。近年发现，除排斥反应外，炎症反应和自身免疫反应在闭塞性细支气管炎的形成过程中也起着重要作用^[22]。因此，进行肺移植闭塞性细支气管炎的研究需要选择合适的理想动物模型。建立大鼠肺移植动物模型是研究肺移植后病理生理过程及其治疗的基础和关键。原位肺移植模型能模拟肺移植全过程，但操作比较复杂，需要精细外科技术，难度较大，限制了这一模型的应用。目前用于闭塞性细支气管炎研究的大鼠动物模型主要是采用同种异体气管腹腔大网膜包埋或皮下移植的方法。考虑到异位气管移植的缺陷，特别是无法解释邻近的气道上皮、淋巴细胞、气道连续性和外界环境对同种移植物闭塞性细支气管炎发生的影响，科研人员建立了原位气管移植动物模型。斯坦福大学的研究^[18]，Brown Norway→Lewis大鼠原位气管移植能够形成与人肺移植后闭塞性细支气管炎相似的病理特征，且该模型操作简便，手术成功率高，也有实用价值，认为是研究肺移植闭塞性细支气管炎发生机制较为理想的实验模型。

实验利用成熟可靠且遗传背景明确的近交系BN和Lewis大鼠进行气管移植，在术后较短时间内(4周)即成功建立肺移植闭塞性细支气管炎的动物模型^{[4, 12-13]}，方法比全肺移植简便易行，手术死亡率低^[4]；且这种模型与肺移植术后闭塞性细支气管炎的病理生理改变基本上是一致的^{[4, 18]}，基本上复制了临床闭塞性细支气管炎病理组织学损害，有助于对肺移植闭塞性细支气管炎发病机制和治疗策略的研究。

肺移植闭塞性细支气管炎是免疫和/或非免疫因素所造成的细小支气管慢性炎症反应性损伤及异常修复过程，多数学者认为免疫排斥反应是首要原因^{[5, 23]}。适应性免疫一直是肺移植排斥反应的研究重点，但是越来越多的研究表明，体液免疫、自体免疫、固有免疫等亦是闭塞性细支气管炎发生的重要因素，气道上皮(airwaye Pithehalcen，AEC)是免疫排斥反应的重要靶标。miRNA在很多重要的生命过程中起着关键作用。近研究发现，miRNA是一类免疫调控因子，参与固有性免疫应答和炎性反应的调控^[24]；尤为重要的是，miRNA在对免疫细胞信号转导的调节中发挥着巨大的作用^[13-14]。检测miRNA的差异性表达及其功能分析是从新的角度阐明移植后闭塞性细支气管炎发病的分子机制。miRNA全基因谱芯片法是目前广泛用于筛选异常表达miRNA的方法，但仍存在一定的假阳性率，其结果仍需要通过RT-qPCR等方法来进一步验证^[25]。

实验检测模拟肺移植闭塞性细支气管炎动物模型miRNA表达谱的变化，结果发现有29个miRNA出现显著差异性表达，其中15个上调，14个下调，表明miRNA在肺移植或心肺联合移植后闭塞性细支气管炎进程中发挥着重要的调控作用，为后续确定其靶基因及功能分析提供理论依据。

miRNA无论在数量上还是功能上，可能都远远超过目前的发现，对其进行深入的研究，将有助于对生物体的各种生理病理机制的理解，并最终为疾病的诊断和治疗提供新的思路和理论基础。现已证实，miRNA能够精细调控其靶mRNA的表达，且这种转录后调控作用具有可逆性，从而形成一种节能而又有效的调节通路。随着对miRNA功能研究的逐渐深入，发现转录因子(transcription factor, TF)和剪接因子(splicingfactor，SF)这两种基因表达的重要调节因子与miRNA之间存在着直接或间接的相互调控作用。寻找、筛选并确定miRNA直接作用的靶基因并阐明其调控机制，是研究miRNA作用机制的重要内容。miRNA是一种在转录后水平调节基因表达的小分子RNA，与转录因子(TF)组成配偶体，在免疫反应和炎症反应中对共同作用的靶基因进行调节/微调炎症反应，在免疫系统中扮演着关键角色^[26]。

研究表明，miR-155在细胞分化、免疫、感染、心血管疾病、病毒感染和肿瘤的发生等过程中扮演着非常重要的角色^[27]；作为一个典型的多功能的microRNA, miR-155参与了包括免疫细胞活化、分化以及免疫稳态在内的很多免疫过程，参与调控T淋巴细胞、B淋巴细胞和树突状细胞的分化，从而影响机体的免疫功能。miR-146a对免疫信号转导起到反馈调节作用，与多种炎症因子及转录因子的活性有密切关系，在免疫反应中发挥精细的调控作用和参与慢性炎症的病理过程^[28-29]，此外，miR-146a在调节性T淋巴细胞中高表达，调节免疫耐受介导器官组织的损伤^[30]。另有研究显示，miR-155和miR-146a可以在巨噬细胞中同时大量表达，在血管免疫反应中发挥重要作用^[31-32]。

目前对miRNA-451在血液系统方面的研究较多，通过对其靶基因GATA-1和GATA-2的调控对红细胞的成熟起着关键的作用，并且总是和miRNA-144共同发挥着一致的功能^[33-34]。近研究显示，miR-451可能通过改变癌基因C-myc及细胞周期正向调节因子的表达水平，减缓了细胞周期的进展，降低了细胞增殖速度^[35]。

通过基因芯片技术对标本组织中异常表达的miRNA进行检测，可以筛查出疾病发生发展相关的差异表达miRNA。在此基础上，通过miRNA数据库软件等生物信息学分析手段可以初步得到miRNA调控的候选靶基因，为下一步鉴定miRNA的靶基因提供线索。本实验采用miRNA芯片技术筛选发现，肺移植闭塞性细支气管炎动物模型中，miR-451表达显著下调，而miR-155和miR-146a表达显著上调；通过TargetScan预测靶基因：miR-146a靶基因是IRAK1和TRAF6，前者与白细胞介素1引起的核因子κB上调有关，后者参与炎症细胞反应，提示miR-146a的功能是固有免疫应答中负调控TLR信号通路，发挥着控制炎症反应的作用^[36-40]。miR-155靶基因为TSHZ3，其参与转录调控，其功能是调控T、B细胞发育、分化及功能，影响生发中心形成、抗体类别转换^[41-43]。而miR-451的靶基因则是Tollip(一种泛素结合蛋白^[44])，是TLR信号的负调控因子^[45]，与白细胞介素1受体和IRAK-1的激活密切相关^[46]，作为重要的炎症信号调节因子，在移植免疫反应中发挥一定的调控作用。上述这些变化提示，这3种miRNA可能与肺移植后发生免疫炎症反应有关，联合研究这三者功能，可能为心肺联合移植或肺移植后闭塞性细支气管炎发生的预防和治疗提供新途径。

134

HTML			PDF

最新录用	在线预览	正式出版	最新录用	在线预览	正式出版
0	0	0	0	0	134

来源	本网站	其他网站

次数	67	67
比例	50%	50%

摘要

243

最新录用	在线预览	正式出版

0	0	243

	来源	本网站

	次数	243
	比例	100%

闭塞性细支气管炎模型大鼠微小RNA差异表达谱分析

Differential expression profiles of microRNAs in a rat model of obliterative bronchiolitis

PDF

可视化

被引次数

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 1

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐 0

Metrics

本文评价

[1]	张为, 崔帅帅, 周志超, 胡小华, 杨晓红. 微小RNA调控组蛋白去乙酰化酶治疗骨相关疾病的发展现状[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(17): 2767-2774.
[2]	吴铭, 张岩. 调控骨髓间充质干细胞成骨分化的Wnt/β-catenin信号通路及相关因素[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(1): 116-122.
[3]	赵春涛, 卿明松, 余浪波, 彭笳宸. 运动学对线和机械力学对线指导全膝关节置换效果的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(9): 1435-1442.
[4]	涂鹏程, 郭杨, 马勇, 潘娅岚, 郑苏阳, 王礼宁, 吴承杰, 过俊杰. 威灵仙提取物可促进体外牵张应力环境下软骨细胞表型的维持[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(8): 1182-1187.
[5]	张聪, 赵岩, 杜小宇, 杜欣瑞, 庞廷娟, 付怡凝, 张浩, 张步洲, 李筱贺, 王利东. 青少年特发性脊柱侧凸腰主弯患者腰椎-骨盆的生物力学分析[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(8): 1155-1161.
[6]	许国峰, 李学斌, 唐一钒, 赵寅, 周盛源, 陈雄生, 贾连顺. 人黄韧带细胞骨化发生过程中的自噬[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(8): 1174-1181.
[7]	周玉, 龙小安, 李宁, 王纯. 有限元法分析髌腱炎状态时的生物力学变化[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(8): 1280-1286.
[8]	林明, 潘金勇, 张惠荣. 敲除NIPBL基因可下调小鼠骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化能力[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(7): 1002-1008.
[9]	岑妍慧, 夏猛, 贾微, 罗伟生, 林江, 陈松林, 陈炜, 刘鹏, 黎明星, 李景云, 李曼莉, 艾丁丁, 蒋云霞. 黄芩素能下调诱捕受体3表达抑制肝癌干细胞的生物学行为[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(7): 1023-1029.
[10]	刘群, 孙东东, 高丽兰, 何志江, 孙明林. 经皮椎体后凸成形后再发骨折相关因素的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(6): 976-984.
[11]	和雨洁, 王海燕, 李志军, 李筱贺, 蔡永强, 戴丽娜, 许阳阳, 王一丹, 徐雪彬. 学龄期儿童胸椎经“椎弓根-肋骨”单元内固定的数字化测量[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(6): 869-876.
[12]	严舒, 卢岩, 欧阳昭连. 中国组织工程领域2013至2018年国家自然科学基金资助项目分析[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(5): 731-735.
[13]	梁娅男, 张建华. 3D打印与组织工程技术在气管替代治疗中的应用与热点[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(5): 780-786.
[14]	宋世雷, 陈跃平, 章晓云. PI3K/AKT信号通路调控股骨头坏死的相关机制[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(3): 408-415.
[15]	孙健, 方超, 高飞, 魏来福, 钱军. 长节段与短节段内固定治疗退变性脊柱侧弯疗效与并发症的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(3): 438-445.