地塞米松诱导牙周膜干细胞的定向成骨分化及凋亡

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.40.011

摘要/Abstract

摘要：

背景：牙周膜干细胞是一类起源于牙组织的成体干细胞，具有良好的成骨分化能力，有望在骨组织工程中得到应用。
目的：观察成骨诱导液对牙周膜干细胞成骨分化能力及细胞早期凋亡的影响。
方法：从原代牙周膜组织中分离得到牙周膜干细胞，以1×10⁴/cm²浓度铺板后开始诱导。利用1，10，100 nmol/L地塞米松、β-磷酸甘油钠、维生素C为成骨诱导剂，以碱性磷酸酶活性检测、茜素红矿化结节染色、荧光定量PCR等方法对细胞成骨情况进行鉴定，采用AnnexinV/PI双染法检测细胞凋亡情况。
结果与结论：地塞米松可有效诱导牙周膜干细胞成骨分化，可显著提高碱性磷酸酶活性，促进茜素红矿化结节形成，提高成骨相关基因骨粘连蛋白及Ⅰ型胶原表达。根据碱性磷酸酶活性和矿化结节实验结果，地塞米松的成骨诱导具有浓度梯度效应，其中100 nmol/L 地塞米松具有最佳成骨诱导能力。细胞凋亡结果提示，地塞米松诱导的成骨分化具有一定促凋亡作用，可诱导牙周膜细胞的早期凋亡。

关键词: 干细胞, 干细胞培养与分化, 牙周膜干细胞, 成骨分化, 地塞米松, 碱性磷酸酶, 荧光定量PCR, 凋亡, 省级基金, 干细胞图片文章

Abstract:

BACKGROUND: Periodontal ligment stem cells are adult stem cells derived from dental tissues, which possess the capability of osteogenic differentiation. They are promising “seed cells” in bone tissue engineering.
OBJECTIVE: To investigate the effects of osteogenic induction medium on the osteogenic differentiation and early apoptosis of periodontal ligment stem cells.
METHODS: Periodontal ligment stem cells were isolated from primary periodontal ligament tissues and seeded on the plate at a density of 1×10⁴/cm². Osteogenic induction medium containing 1, 10 and 100 nmol/L dexamethasone, β-glycerophosphate and ascorbic acid were used. Alkaline phosphatase activity, mineral deposition staining and real time PCR were performed to assess the osteogenic capacity. AnnexinV/PI staining was used to detected apoptosis.
RESULTS AND CONCLUSION: Dexamethasone effectively promoted osteogenic differentiation of periodontal ligment stem cells, by up-regulating alkaline phosphatase activity, enhancing mineral deposition and increasing osteogenic related gene (osteonectin and type Ⅰ collagen) expression. Alkaline phosphatase activity and mineralized nodule detection showed that osteogenic effects of dexamethasone were gradient-dependent, and 100 nmol/L was the best concentration. Apoptosis detection results indicated that osteogenic differentiation of dexamethasone for periodontal ligment stem cells could also induce cell apoptosis to some extent.

Key words: stem cells, periodontal ligament, dexamethasone, alkaline phosphatase, apoptosis

中图分类号:

R394.2

谷子芽，翟强，吕秋峰，彭灿星，刘芳菲，彭晖. 地塞米松诱导牙周膜干细胞的定向成骨分化及凋亡[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(40): 7090-7095.

Gu Zi-ya, Zhai Qiang, Lü Qiu-feng, Peng Can-xing, Liu Fang-fei, Peng Hui. Dexamethasone induces osteogenic differentiation and apoptosis of periodontal ligament stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(40): 7090-7095.

图/表（结果） 6

2.1 牙周膜干细胞成骨诱导形态学变化 未诱导牙周膜干细胞呈典型成纤维细胞形态，漩涡状生长。而经成骨诱导液诱导2周后细胞汇合，密集生长，部分出现网状层叠现象，并有细胞矿化结节出现，见图1。

2.2 碱性磷酸酶活性检测结果 成骨诱导1周后，可以检测到碱性磷酸酶活性的提高。碱性磷酸酶是一个重要的早期成骨指标，说明牙周膜干细胞在成骨诱导液的作用下开始成骨定向分化。其中，100 nmol/L 地塞米松具有显著提高碱性磷酸酶活性的作用，可能具有最理想的促进成骨分化作用。实验数值统计作图结果见图2及表1。

2.3 茜素红矿化结节染色结果 成骨诱导3周后，茜素红矿化结节染色结果显示在地塞米松诱导下，牙周膜干细胞有大量矿化结节形成，而对照组没有阳性染色出现，见图3。地塞米松具有浓度梯度促进矿化钙结节形成的效果，100 nmol/L 地塞米松效果最强。根据碱性磷酸酶活性和矿化结节实验结果，地塞米松的成骨诱导具有浓度梯度效应。由于100 nmol/L 地塞米松具有最佳成骨诱导能力，后续荧光定量PCR实验和Annexin V/PI凋亡检测均采用100 nmol/L 地塞米松浓度条件。

2.4 成骨标志骨粘连蛋白和Ⅰ型胶原基因的表达变化

骨粘连蛋白和Ⅰ型胶原是2个重要的成骨分化标志基因。样本之间Ct值重复性较好，且融解曲线无明显杂峰出现。利用β-actin作为内参基因，2^-^ΔΔ^CT法计算目的基因的相对表达量。诱导3周后，骨粘连蛋白的相对表达量较未诱导组提高了3.25倍，Ⅰ型胶原的相对表达量提高了3.6倍。说明成骨分化相关基因在诱导之后表达明显上调，见表2及图4。

2.5 成骨诱导引起的细胞凋亡 成骨诱导48 h后，检测早期细胞凋亡发现，100 nmol/L 地塞米松组早期凋亡细胞AnnexinV⁺/PI^-比例(4.47%)较对照组(2.68%)明显提高，而两者的坏死或死亡细胞AnnexinV⁺/PI⁺比例差异并无显著性意义(100 nmol/L 地塞米松组为1.53%，对照组为1.58%)。说明在成骨诱导后，部分牙周膜干细胞发生了早期凋亡。

参考文献

[1]McCulloch C A,Bordin S. Role of fibroblast subpopulations in periodontal physiology and pathology. J Periodontal Res. 1991; 26(3 Pt 1): 144-154.
[2]Bartold PM, Shi S, Gronthos S. Stem cells and periodontal regeneration. Periodontol. 2000;40: 164-172.
[3]Rimondini L,Mele S. Stem cell technologies for tissue regeneration in dentistry. Minerva Stomatol. 2009; 58(10): 483-500.
[4]Chatterjea A, Meijer G, van Blitterswijk C, et al. Clinical application of human mesenchymal stromal cells for bone tissue engineering. Stem Cells Int. 2010; 2010: 215625.
[5]Dimitriou R, Jones E, McGonagle D, et al. Bone regeneration: current concepts and future directions. BMC Med. 2011; 9: 66.
[6]Seo BM, Miura M, Gronthos S, et al. Investigation of multipotent postnatal stem cells from human periodontal ligament. Lancet. 2004; 364(9429): 149-155.
[7]Seo BM, Miura M, Sonoyama W, et al. Recovery of stem cells from cryopreserved periodontal ligament. J Dent Res. 2005; 84(10): 907-912.
[8]Tucker A,Sharpe P. The cutting-edge of mammalian development; how the embryo makes teeth. Nat Rev Genet. 2004; 5(7): 499-508.
[9]Huang GT, Gronthos S,Shi S. Mesenchymal stem cells derived from dental tissues vs. those from other sources: their biology and role in regenerative medicine. J Dent Res. 2009; 88(9):792-806.
[10]Kadar K, Kiraly M, Porcsalmy B, et al. Differentiation potential of stem cells from human dental origin - promise for tissue engineering. J Physiol Pharmacol. 2009; 60 Suppl 7: 167-175.
[11]Ding G, Liu Y, Wang W, et al. Allogeneic periodontal ligament stem cell therapy for periodontitis in swine. Stem Cells. 2010; 28(10): 1829-1838.
[12]Yan M, Yu Y, Zhang G, et al. A journey from dental pulp stem cells to a bio-tooth. Stem Cell Rev. 2011; 7(1): 161-171.
[13]Huang GT, Yamaza T, Shea LD, et al. Stem/progenitor cell-mediated de novo regeneration of dental pulp with newly deposited continuous layer of dentin in an in vivo model. Tissue Eng Part A. 2010; 16(2): 605-615.
[14]Alhadlaq A,Mao JJ. Mesenchymal stem cells: isolation and therapeutics. Stem Cells Dev. 2004; 13(4): 436-448.
[15]de Girolamo L, Sartori MF, Albisetti W, et al. Osteogenic differentiation of human adipose-derived stem cells: comparison of two different inductive media. J Tissue Eng Regen Med. 2007; 1(2): 154-157.
[16]Karner E, Backesjo CM, Cedervall J, et al. Dynamics of gene expression during bone matrix formation in osteogenic cultures derived from human embryonic stem cells in vitro. Biochim Biophys Acta. 2009; 1790(2): 110-118.
[17]Wang H, Pang B, Li Y, et al. Dexamethasone has variable effects on mesenchymal stromal cells. Cytotherapy. 2012; 14(4): 423-430.
[18]Malladi P, Xu Y, Yang GP, et al. Functions of vitamin D, retinoic acid, and dexamethasone in mouse adipose-derived mesenchymal cells. Tissue Eng. 2006; 12(7): 2031-2040.

引言

牙周病是一种慢性骨破坏性疾病，尤其是牙槽骨的破坏和丧失可导致牙齿脱落，严重影响患者生活质量。造成牙槽骨缺损的原因有很多，包括牙周炎、拔牙手术、外伤等^[1] 。国内牙周炎发病率高达80%，对人们的生活质量造成了极大的影响。常见的拔牙手术也会造成牙槽骨损伤，并进一步造成义齿种植难度增大、成功率降低。
重建牙槽骨，修复因牙周炎等疾病丧失的牙周组织，是治疗的关键，目前治疗方法有诱导再生术和骨移植术等。牙周组织诱导再生术对牙槽骨再生的效果是有限的，自体骨移植虽效果要优于前者，但因来源有限、损伤较大会造成取骨部位的并发症等原因，仍需寻找新的治疗方法。基于干细胞的牙周再生治疗已经获得了更多的关注^[2-5] 。牙周膜干细胞是一类起源于牙周膜组织的成体干细胞，具有自我更新和多向分化能力。当牙周膜组织受到损伤时，它们会不断增殖和分化促使组织修复和再生，是牙周炎等牙周疾病细胞治疗的种子细胞。牙周膜干细胞最早由Seo等^[6-7]通过酶消化法消化正常第3磨牙上剥离的牙周膜组织制成单细胞悬液，利用克隆筛选和磁珠分离获得，具有克隆形成和高度增殖能力。牙周膜干细胞在未来牙周组织工程的应用中具有美好的前景。牙周膜干细胞本身来源于牙周膜，智齿拔除等小手术即可获得牙周膜组织，因此，牙周膜干细胞来源广泛，造成机体损伤小。同时，牙周膜干细胞也具有成体干细胞普遍存在的优势：增殖能力强，可多向分化潜能，免疫原性低，不存在伦理学争议等。综上所述，它是一种具有良好应用前景的成体干细胞。
牙周膜干细胞在体外具有多向分化能力，可分化为成骨、神经、脂肪等细胞。牙周膜干细胞在体内成骨分化可形成牙槽骨、牙骨质，对牙周组织的修复十分关键。基于牙周膜干细胞的优势及其在骨组织工程中的潜在应用前景，文章拟利用地塞米松对原代牙周膜干细胞体外成骨定向诱导，并进行多种成骨指标的鉴定，观察成骨分化对细胞凋亡的影响，为牙周膜干细胞今后的临床组织工程应用打下基础。

材料方法

设计：细胞学水平，体外对比观察实验。

时间及地点：于2011年7月至2012年5月在浙江省杭州口腔医院完成。

材料：选取于杭州口腔医院门诊就诊的5例18-30岁正畸患者拔除的健康双尖牙或第3磨牙，患者本人及家长对治疗及实验方案均知情同意，且得到医院伦理委员会批准。

实验方法：

牙周膜干细胞的分离培养：取口腔门诊因正畸需要拔除的健康双尖牙或第3磨牙，浸入含3倍双抗的PBS中，迅速送往实验室。用PBS以从牙根到牙冠的方向冲洗牙体，彻底清除血污。刮取根中下1/3段的牙周膜组织，移入离心管。加入1 L胶原酶-Dispase酶1∶1混合消化液(原酶3 g/L，Dispase酶4 g/L)37 ℃下消化30 min，每间隔5 min，摇晃离心管使组织块分散。加入培养液(含体积分数20%胎牛血清的DMEM)中和， 1 000 r/min离心5 min后，加入培养液吹散组织块后，转入35 mm细胞培养皿，CO₂培养箱37 ℃培养。

牙周膜干细胞的成骨诱导：将细胞以1×10⁴/cm²铺板，待细胞汇合度为80%-90%开始诱导。成骨诱导液为含不同浓度梯度(1，10，100 nmol/L)的地塞米松、10 mmol/L β-磷酸甘油钠、80 mg/L维生素C，含体积分数10%胎牛血清DMEM培养液，每隔3 d全量换诱导液。对照组为未诱导细胞。

牙周膜干细胞成骨分化的鉴定：

碱性磷酸酶活性测定：将细胞按要求浓度接种入12孔板后开始成骨诱导，1周后进行碱性磷酸酶活性的检测。由于各孔之间细胞量可能存在差异，因此需要对总蛋白进行检测，对碱性磷酸酶活性进行标准化。弃原孔内培养液，PBS洗3次，吸干，每孔加入400 μL 0.1% Triton X-100，覆盖细胞，置 4 ℃冰箱过夜。观察已无完整细胞结构，经震荡后，离心取裂解液上清。其余步骤按试剂盒说明书进行。

碱性磷酸酶活性检测组取30 μL细胞裂解液上清，设置3个重复，520 nm波长下测定吸光度。以BCA试剂测定裂解液的总蛋白量，取20 μL细胞裂解液上清，562 nm波长下测定吸光度。最后取标准化的碱性磷酸酶活性值，将测得的碱性磷酸酶活性值吸光度/总蛋白含量吸光度：碱性磷酸酶/BCA=A_{520 nm}/A_{562 nm}。

茜素红染色：细胞接入12孔板，成骨诱3周后进行茜素红染色检测。细胞弃培养基，PBS清洗2遍，40 g/L多聚甲醛固定30 min。PBS清洗2遍，2%茜素红染色 5 min，去离子水清洗。干燥后显微镜下观察、拍照。

实时荧光定量PCR：细胞接入六孔板，成骨诱导3周后，Trizol法提取RNA。M-MLV反转录试剂盒获得cDNA。按试剂盒说明书进行成骨标志骨粘连蛋白和Ⅰ型胶原的荧光定量PCR检测。β-actin作为内参基因。引物序列如下：骨粘连蛋白上游序列5’-GTG CAG AGG AAA CCG AAG AG-3’，下游序列5’-TCA TTG CTG CAC ACC TTC TC-3’，产物大小172 bp；Ⅰ型胶原上游序列5’-CTG ACC TTC CTG CGC CTG ATG TCC-3’，下游序列5’-GTC TGG GGC ACC AAC GTC CAA GGG-3’，产物大小300 bp；β-actin上游序列5’- CAT GTA CGT TGC TAT CCA GGC-3’，下游序列5’-CTC CTT AAT GTC ACG CAC GAT-3’，产物大小250 bp。利用2^-^ΔΔCT法进行分析相对基因表达。每样本设置3个重复。

细胞凋亡检测：细胞接入6孔板，加入成骨诱导液作用48 h后，胰酶消化为单个细胞。PBS清洗2边后，将细胞以1×10⁸ L^-¹悬浮后，按试剂盒说明书操作，进行AnnexinV-FITC/PI双染，流式细胞仪检测细胞凋亡。对照组为未诱导的细胞。

主要观察指标：通过碱性磷酸酶活性、茜素红染色和成骨基因的表达变化进行牙周膜干细胞成骨分化鉴定。

统计学分析：第一作者采用SPSS 17.0软件完成统计处理，利用ANOVA法进行方差分析，以Origin 7.0作图。

讨论

牙周膜干细胞作为干细胞中较年轻的一员，最早在2004年由Seo等发现并提出。正常情况下，牙周膜干细胞在牙周膜组织中处于静息状态，而各种原因导致牙周膜组织受到损伤时，它们会不断增殖和分化促使组织修复和再生^[8] 。它具有理想组织工程种子细胞的特性：①多向分化能力，可分化为成骨、软骨、神经、脂肪等细胞^[9-10] 。②高度的自我更新能力，在体外传代20多代仍可保持多向分化能力。③组织来源广泛：通过成人智齿拔除或因正畸需要的拔牙术都可获得，并且造成创伤较小。④免疫原性低，不易引起免疫排斥反应^[11] 。因此，在组织修复中有良好的应用前景。
其中，成骨分化对牙周膜干细胞的牙组织工程十分关键，可用于牙槽骨修复再生。重建牙槽骨，修复因牙周炎等疾病丧失的牙周组织。目前牙周疾病治疗方法存在很多缺陷，而基于干细胞的牙周再生治疗已经获得了更多的关注^[3，12] 。利用牙组织来源的干细胞，如牙髓干细胞和牙周膜干细胞，修复牙周组织在小鼠、犬、猪等动物模型中已有报道^[11，13] 。牙周炎等牙周疾病造成牙齿脱落，引发牙槽骨吸收和损伤，危害极大。目前已被医学界定论为继癌症、心脑血管疾病之后，威胁人类身体健康的第三大杀手，也是口腔健康的“头号杀手”，其发病率已经超过了龋齿，达到了80%。因此，开展牙周膜干细胞及其成骨分化的研究，对于修复牙槽骨、治疗牙周炎具有促进作用。
文章通过酶解法从人牙周膜组织中提取干细胞，并经过多次传代贴壁培养纯化细胞。原代细胞培养过程中，内皮样细胞等异质形态细胞也有出现，然而此类细胞无扩增能力，在多次传代后死亡。文献报道经过多次细胞传代，增殖能力强的干细胞可维持扩增，均一地表达CD90，CD105，CD44等间充质样干细胞的表面标志，可认为是一群具有高增殖能力的干细胞，并且可进行成骨、成软骨等多向分化^[6-7] 。文章通过酶解法获得的细胞在传两三代后，可达到均一的成纤维样细胞形态细胞群，在地塞米松诱导下可进行成骨分化。
传统成骨诱导方法(地塞米松、β-磷酸甘油钠、维生素C)在多种不同来源干细胞中的成骨分化作用都有报道，如骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、胚胎干细胞等^[14-16] 。地塞米松在成骨诱导中发挥了关键作用，它对牙周膜干细胞同样具有理想的成骨诱导效果。成骨诱导早期诱导时间为1周时，对早期成骨标志碱性磷酸酶活性检测结果发现地塞米松处理可显著提高碱性磷酸酶活性；成骨诱导晚期，即诱导3周后，细胞大量密集，矿化结节进一步增多，利用茜素红染液可观察到矿化结节大量出现。说明诱导3周后，牙周膜干细胞已经进入成熟成骨分化阶段。骨粘连蛋白和Ⅰ型胶原是2个重要的成骨分化成熟的相关基因，荧光定量PCR结果显示经地塞米松诱导3周后，两者表达明显提高，进一步从分子水平证明了牙周膜干细胞在地塞米松作用下可有效进行成骨分化。
地塞米松诱导的成骨分化也会对细胞产生一定抑制作用。目前地塞米松诱导的成骨分化对牙周膜干细胞的凋亡作用尚未见报道。作者这次实验使用AnnexinV/PI双染法检测成骨诱导液对牙周膜细胞早期凋亡的影响，结果显示成骨诱导可造成牙周膜细胞中早期凋亡细胞比例增加，说明成骨分化会对细胞活力产生一定抑制。有研究显示地塞米松对间充质干细胞的作用具有两面性：在低浓度下有抑制细胞凋亡的作用，而在高浓度下可促进细胞凋亡^[17] 。且地塞米松对成骨分化的作用也依赖于剂量，高浓度地塞米松促进成脂分化，反而导致抑制成骨^[18] 。本实验中地塞米松在1-100 nmol/L浓度范围内，对牙周膜干细胞有浓度梯度的促进成骨分化效应，但100 nmol/L 地塞米松作用浓度下，可在一定程度上诱导细胞凋亡，早期凋亡细胞和死亡细胞均高于非诱导组，因此地塞米松在高浓度下仍可能存在一定细胞毒性，这与目前长期使用地塞米松类药物引发骨质疏松等副反应的现象相符。因此，优化地塞米松成骨诱导的作用浓度和时间，达到良好的成骨诱导效果，减少细胞毒性，有利于牙周膜干细胞在组织工程中的应用。本实验中100 nmol/L地塞米松诱导组细胞凋亡率为4.47%，比例并不高，该诱导条件适用于牙周膜干细胞。
牙周膜来源的干细胞在未来牙周组织工程的应用中具有美好的前景。它们来源广泛，对机体损伤小，其生物学特征符合组织工程的“种子细胞”需求，因此具有具有可观的临床治疗前景。高效体外成骨分化诱导方法的建立，能帮助研究者探索牙源干细胞成骨分化的细胞信号通路及其分子生物学基础，提高其在组织工程中的成骨效果，为今后用于牙周修复、骨缺损修复打下基础。