缺氧再灌注斑马鱼胚胎脑部细胞凋亡及c-fos基因的表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.37.012

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (37): 6613-6619.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.37.012

• 组织构建细胞学实验 cytology experiments in tissue construction • 上一篇下一篇

缺氧再灌注斑马鱼胚胎脑部细胞凋亡及c-fos基因的表达

陈衍晨，赵丹，卿娣，程东良，毛姣玉，王斌

南方医科大学珠江医院儿科中心，广东省广州市 510282

收稿日期:2013-02-28 修回日期:2013-04-25 出版日期:2013-09-10 发布日期:2013-09-10
通讯作者: 王斌，副教授，主任医师，博士生导师，南方医科大学珠江医院儿科中心，广东省广州市 510282
作者简介:陈衍晨★，女，1986年生，广东省罗定市人，汉族，2013年南方医科大学毕业，硕士，医师，主要从事新生儿疾病研究。 hello-cyc@qq.com

Zebrafish embryonic brain cell apoptosis and c-fos gene expression after hypoxia reperfusion

Chen Yan-chen, Zhao Dan, Qing Di, Cheng Dong-liang, Mao Jiao-yu, Wang Bin

Center of Pediatrics, Zhujiang Hospital of Southern Medical University, Guangzhou 510282, Guangdong Province, China

Received:2013-02-28 Revised:2013-04-25 Online:2013-09-10 Published:2013-09-10
Contact: Wang Bin, Associate professor, Chief physician, Doctoral supervisor, Center of Pediatrics, Zhujiang Hospital of Southern Medical University, Guangzhou 510282, Guangdong Province, China
About author:Chen Yan-chen★, Master, Physician, Center of Pediatrics, Zhujiang Hospital of Southern Medical University, Guangzhou 510282, Guangdong Province, China hello-cyc@qq.com

摘要/Abstract

摘要：

背景：国外已经有学者使用斑马鱼胚胎开始进行缺氧再灌注的研究，但还没有关于c-fos基因在斑马鱼脑缺氧再灌注过程中的表达及其作用机制的报道。
目的：观察缺氧再灌注后斑马鱼胚胎脑部细胞凋亡及脑组织中c-fos基因的表达情况。
方法：取48 hpf的斑马鱼胚胎进行缺氧实验，模拟新生儿缺氧再灌注损伤环境，通过向水中通入99.999%高纯氮气制造缺氧环境，分别经过6，12，24 h的缺氧处理后，在正常氧体积分数下进行6 h恢复。对照组为正常通气组(溶解氧浓度在7.0 mg/L左右)。采用吖啶橙染色方法，观察不同缺氧时间对斑马鱼神经细胞凋亡的影响，同时采用实时荧光定量核酸扩增检测系统(qPCR)，对c-fos基因表达情况进行定量分析，比较缺氧再灌注前后c-fos基因表达水平的变化。
结果与结论：对照组脑部能检测到微量细胞凋亡，c-fos基因呈低水平表达；实验组经过6，12，24 h缺氧后，脑部凋亡细胞逐渐增多，缺氧24 h组凋亡细胞增幅最大(P < 0. 05)，c-fos基因表达有不同程度升高(P < 0.05)，尤其是缺氧6 h后，该基因的表达上调幅度最高。结果表明缺氧会导致斑马鱼脑细胞内c-fos基因表达上调，可能是导致缺氧后期脑细胞凋亡激增的机制之一。

关键词: 组织构建, 组织构建细胞学实验, c-fos基因, 神经细胞凋亡, 缺氧再灌注, 脑损伤, 斑马鱼, 胚胎, 新生儿, 分子生物学

Abstract:

BACKGROUND: Foreign scholars have researched hypoxia reperfusion in zebrafish embryos, but there is no research on c-fos gene expression and the mechanism during zebrafish cerebral hypoxia reperfusion.
OBJECTIVE: To observe the zebrafish embryonic brain cell apoptosis and expression of c-fos gene in brain tissues after hypoxia reperfusion.
METHODS: Zebrafish embryos were selected at 48 hours post fertilization. Neonatal hypoxia reperfusion injury was simulated by gradually leading nitrogen (99.999%) into the device. After hypoxia treatment for 6, 12 and 24 hours, the embryos received reperfusion for 6 hours under normal oxygen concentration. The embryos in the control group received normoventilation (the dissolved oxygen concentration was about 7.0 mg/L). Acridine orange staining was performed to observe the effect of different hypoxia durations on the apoptosis of neurons in zebrafish, and then the c-fos gene expression was quantitative analyzed with real-time quantitative nucleic acid amplification detection system. And the expression level of c-fos gene was compared before and after hypoxia reperfusion.
RESULTS AND CONCLUSION: A small amount of apoptotic brain cells could be detected in the control group, and the c-fos gene expression level was decreased; in the experimental group, the number of apoptotic cells was increased after hypoxia for 6, 12 and 24 hours, and the gene expression after hypoxia for 6 hours was increased distinctly. The results indicate that hypoxia can increase the c-fos gene expression in brain cells of zebrafish embryos, which may be one of the mechanisms of brain cell apoptosis increasing after hypoxia.

Key words: genes, fos, apoptosis, anoxia, reperfusion, zebrafish

中图分类号:

R318

陈衍晨，赵丹，卿娣，程东良，毛姣玉，王斌. 缺氧再灌注斑马鱼胚胎脑部细胞凋亡及c-fos基因的表达[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(37): 6613-6619.

Chen Yan-chen, Zhao Dan, Qing Di, Cheng Dong-liang, Mao Jiao-yu, Wang Bin. Zebrafish embryonic brain cell apoptosis and c-fos gene expression after hypoxia reperfusion[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(37): 6613-6619.

图/表（结果） 3

参考文献

[1] van Handel M, Swaab H, de Vries LS,et al. Long-term cognitive and behavioral consequences of neonatal encephalopathy following perinatal asphyxia: a review.Eur J Pediatr. 2007;166(7):645-654.
[2] 黄晓红. 154例新生儿的窒息高危产科因素分析[J].中国医药指南, 2012, 10(29): 190-191.
[3] 王彩华,姚丽萍,韩艳宾,等. 窒息新生儿缺氧缺血性脑病研究新进展[J].包头医学院学报, 2010,26(2): 112-113.
[4] 刘国瑞,李仰康,郭岳霖,等.新生猪缺氧缺血脑损伤模型制备的研究[J]. 实用儿科临床杂志, 2005,20(3): 258-259, 291.
[5] 周文浩,邵肖梅,李瑾,等. 新生猪缺氧缺血脑损伤模型制备的研究[J]. 中国当代儿科杂志, 2003, 5(2): 113-116.
[6] 杨明峰,张颜波,管宏旭,等. 大鼠鼠胚海马神经元缺氧复氧致细胞凋亡模型的建立[J].泰山医学院学报,2008,29 (12):949-951.
[7] 林霓阳,房晓祎,吴北燕,等. 新生儿缺氧缺血性脑病脑细胞凋亡研究[J]. 中国基层医药, 2004,11(3): 261-262.
[8] Akins PT, Liu PK, Hsu CY. Immediate early gene expression in response to cerebral ischemia. Friend or foe?Stroke. 1996; 27(9):1682-1687.
[9] Funahashi M, He YF, Sugimoto T,et al.Noxious tooth pulp stimulation suppresses c-fos expression in the rat hippocampal formation.Brain Res. 1999;827(1-2):215-220.
[10] Giza CC, Prins ML, Hovda DA,et al.Genes preferentially induced by depolarization after concussive brain injury: effects of age and injury severity.J Neurotrauma. 2002; 19(4):387-402.
[11] Gubits RM, Burke RE, Casey-McIntosh G,et al.Immediate early gene induction after neonatal hypoxia-ischemia.Brain Res Mol Brain Res. 1993;18(3):228-238.
[12] Johansson IM, Wester P, Háková M,et al. Early and delayed induction of immediate early gene expression in a novel focal cerebral ischemia model in the rat.Eur J Neurosci. 2000; 12(10): 3615-3625.
[13] Cui J, Liu PK. Neuronal NOS inhibitor that reduces oxidative DNA lesions and neuronal sensitivity increases the expression of intact c-fos transcripts after brain injury.J Biomed Sci. 2001;8(4):336-341.
[14] Cullinan WE, Herman JP, Battaglia DF,et al.Pattern and time course of immediate early gene expression in rat brain following acute stress.Neuroscience. 1995;64(2):477-505.
[15] Herrera DG, Robertson HA.Activation of c-fos in the brain. Prog Neurobiol. 1996;50(2-3):83-107.
[16] Beattie DT, Smith JA.Serotonin pharmacology in the gastrointestinal tract: a review.Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 2008;377(3):181-203.
[17] 李红芳,卫杏利. c-fos基因与脑缺血损伤[J]. 长治医学院学报, 2009, 23(3): 233-235.
[18] Westerfield M. The zebrafish book:A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). 4th ed. Eugene:University of Oregon Press,2000.
[19] Effects of hypoxia on development of the digestive system and metabolism in zebrafish (Danio rerio). Michelle Matozel. May, 2009. A thesis Presented to The Graduate Faculty of The University of Akron.
[20] Tucker B, Lardelli M. A rapid apoptosis assay measuring relative acridine orange fluorescence in zebrafish embryos. Zebrafish. 2007;4(2):113-116.
[21] Airhart MJ, Lee DH, Wilson TD,et al.Movement disorders and neurochemical changes in zebrafish larvae after bath exposure to fluoxetine (PROZAC).Neurotoxicol Teratol. 2007; 29(6):652-664.
[22] Schmittgen TD, Livak KJ. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method.Nat Protoc. 2008;3(6): 1101-1108.
[23] Giza CC, Prins ML, Hovda DA,et al.Genes preferentially induced by depolarization after concussive brain injury: effects of age and injury severity.J Neurotrauma. 2002; 19(4):387-402.
[24] Morgan JI, Curran T.Stimulus-transcription coupling in the nervous system: involvement of the inducible proto-oncogenes fos and jun. Annu Rev Neurosci. 1991; 14:421-451.
[25] 尚菁,史正刚.新生儿缺氧缺血性脑病与脑细胞凋亡及基因表达的关系[J].中国优生与遗传杂志, 2004,12(5):132-133.
[26] Sheldon AL, Robinson MB.The role of glutamate transporters in neurodegenerative diseases and potential opportunities for intervention.Neurochem Int. 2007;51(6-7):333-355.
[27] Shigeri Y, Seal RP, Shimamoto K. Molecular pharmacology of glutamate transporters, EAATs and VGLUTs. Brain Res Brain Res Rev. 2004;45(3):250-265.
[28] Thöne-Reineke C, Neumann C, Namsolleck P,et al.The beta-lactam antibiotic, ceftriaxone, dramatically improves survival, increases glutamate uptake and induces neurotrophins in stroke.J Hypertens. 2008;26(12):2426-2435.
[29] Takei N, Tanaka O, Endo Y,et al.BDNF and NT-3 but not CNTF counteract the Ca2+ ionophore-induced apoptosis of cultured cortical neurons: involvement of dual pathways. Neuropharmacology. 1999;38(2):283-288.
[30] Malinski T, Bailey F, Zhang ZG,et al.Nitric oxide measured by a porphyrinic microsensor in rat brain after transient middle cerebral artery occlusion.J Cereb Blood Flow Metab. 1993; 13(3):355-358.
[31] 杨卫忠,陈春美,王春华,等.一氧化氮和一氧化氮合酶在大鼠局灶性脑缺血中的表达特点[J].中国神经精神疾病杂志, 2007,33(6): 335-339.
[32] Whitfield J, Neame SJ, Paquet L,et al.Dominant-negative c-Jun promotes neuronal survival by reducing BIM expression and inhibiting mitochondrial cytochrome c release.Neuron. 2001;29(3):629-643.
[33] Northington FJ. Brief update on animal models of hypoxic-ischemic encephalopathy and neonatal stroke.ILAR J. 2006;47(1):32-38.
[34] 殷梧, 邹苏琪,王光辉,等. 模式动物斑马鱼在神经系统疾病研究中的应用[J]. 生命科学, 2008,20(5): 773-778.
[35] 全珊珊,吴新荣. 斑马鱼,人类疾病研究的理想模式动物[J]. 生命的化学, 2008,28(3): 260-263.
[36] 王海涛. 科学奇葩——斑马鱼[J]. 生命世界, 2008,3: 22-25.
[37] Dooley K, Zon LI. Zebrafish: a model system for the study of human disease.Curr Opin Genet Dev. 2000;10(3):252-256.
[38] Paquet D, Bhat R, Sydow A,et al.A zebrafish model of tauopathy allows in vivo imaging of neuronal cell death and drug evaluation.J Clin Invest. 2009;119(5):1382-1395.
[39] Lieschke GJ, Currie PD. Animal models of human disease: zebrafish swim into view.Nat Rev Genet. 2007;8(5):353-367.
[40] Santoriello C, Zon LI.Hooked! Modeling human disease in zebrafish.J Clin Invest. 2012;122(7):2337-2343.
[41] McGrath P, Li CQ. Zebrafish: a predictive model for assessing drug-induced toxicity. Drug Discov Today. 2008;13(9-10): 394-401.
[42] Hill AJ, Teraoka H, Heideman W,et al.Zebrafish as a model vertebrate for investigating chemical toxicity.Toxicol Sci. 2005; 86(1):6-19.
[43] Tucker NR, Middleton RC, Le QP,et al. HSF1 is essential for the resistance of zebrafish eye and brain tissues to hypoxia/reperfusion injury.PLoS One. 2011;6(7):e22268.
[44] Stevenson TJ, Trinh T, Kogelschatz C,et al. Hypoxia disruption of vertebrate CNS pathfinding through ephrinB2 Is rescued by magnesium.PLoS Genet. 2012;8(4):e1002638.
[45] Parente V, Balasso S, Pompilio G,et al. Hypoxia/reoxygenation cardiac injury and regeneration in zebrafish adult heart. PLoS One. 2013;8(1):e53748.
[46] Santhakumar K, Judson EC, Elks PM,et al.A zebrafish model to study and therapeutically manipulate hypoxia signaling in tumorigenesis.Cancer Res. 2012;72(16):4017-4027.

引言

新生儿缺氧缺血性脑病是指在围生期缺氧窒息而导致的缺氧缺血性损害，临床出现一系列脑病的表现。围生期缺氧性脑损伤对患儿最长远的危害是神经系统后遗症^[1]，主要发生在中度以上缺氧缺血性脑病^[2]。它是围生期窒息后引起的最常见和严重的并发症，90%发生在出生前和出生时，其中出生前因素约占20%，如母体大出血后继发血压过低、妊高症、胎盘异常以及胎儿宫内发育迟缓等。出生时的因素约占70%，如难产、宫内窘迫、脐带打结绕颈等。生后的因素约占10%，如有严重的肺部疾患，包括呼吸窘迫综合征、呼吸暂停以及先天性心脏病等。其中以出生前的宫内缺氧最难以发现^[3]。

引起脑缺氧缺血损伤的机制十分复杂，很多机制尚未能明了。脑缺氧缺血损伤一般经历原发损伤和继发损伤(又称为再灌注损伤)两个阶段，其间隔时间依赖于损伤的严重性及细胞损伤的数量，一般间隔为30 min-72 h。目前研究证实，继发损伤是引起新生儿神经系统并发症的最主要原因之一。

缺氧缺血再灌注后的神经功能障碍与伤后神经细胞的死亡有关，包括坏死和凋亡，尤其是细胞凋亡，由于其发生较晚且持续时间较长，故对神经功能的影响更为显著。新生儿窒息经心肺复苏后很快恢复正常，但几小时后可出现迟发性脑损伤，其发生机制尚不清楚。在对窒息的新生儿大脑细胞进行检测时发现，脑细胞有明显的凋亡迹象，说明这种短暂脑缺氧缺血后出现的迟发细胞死亡机制中，可能至少部分与凋亡程序不适当的激活有关。凋亡的特征在新生猪缺氧缺血脑损伤中可见到^[4-5]，说明缺氧缺血发生迟发脑损伤时，大量细胞发生凋亡。在未成熟和成熟的大鼠缺氧以及神经元缺氧体外实验中也可见到细胞凋亡的特征^[6-7]。

有研究认为c-fos基因的启动是诱发缺氧缺血后神经细胞凋亡的可能机制之一^[8]。c-fos属即刻早期反应基因家族，大量研究表明，许多即刻早期反应基因在缺氧缺血再灌注早期被激活，参与调节细胞、组织对损伤刺激的信号传导及应答。c-fos基因在正常情况下参与细胞的生长、分化、信息传递、学习和记忆等生理过程，被认为是研究中枢神经系统最有代表性的即刻早期反应基因^[9]。c-fos基因正常情况下存在于中枢神经系统，但其高度保守、表达水平很低、难以检测。当受到如缺氧、光线刺激、机械刺激、疼痛刺激等，可激活中枢神经系统中的c-fos基因^[10-13]，转录形成mRNA后进入胞浆，翻译合成相对分子质量为 55 000的核磷蛋白，即Fos蛋白。Fos蛋白随后与另一家族原癌基因c-jun基因编码的Jun蛋白通过亮氨酸拉链形成异源二聚体复合物，即转录激活蛋白1，转录激活蛋白1与目的基因结合，激活目的基因的转录活性，起到第三信使的作用^[14-15]。通过上述过程，细胞外刺激信号转化为调节细胞核内基因表达的信号，通过它们表达的蛋白传递和整合信息，作用于靶基因，改变其转录水平，参与神经细胞的生长、分化、死亡和损伤后修复的调节，从而对外界刺激做出应答。但也有研究表明，当机体受到不同类型的刺激时，c-fos基因可作为接受一定刺激的神经元激活的标志，作为部分脑区活动的生物标记物^[16]。c-fos过度表达与神经元凋亡有必然联系，且参与细胞凋亡过程, 但其具体机制尚未完全明了^[17]。

实验在新型模式生物体内斑马鱼中开展，观察缺氧后再灌注对受试动物脑细胞凋亡情况及c-fos表达水平的影响，探究缺氧缺血后抑制神经凋亡发生的方法，期望为临床上治疗和预防新生儿缺氧缺血性脑病提供新的思路。

材料方法

设计：随机对照实验，分子生物学观察。

时间及地点：于2012年7月至2013年1月在南方医科大学基础医学院细胞教研室，广东省人类疾病斑马鱼模型和药物筛选重点实验室完成。

材料：

实验动物：野生型斑马鱼胚胎取自南方医科大学斑马鱼实验室。24 hpf(受精后小时数)胚胎用0.2%苯硫脲(PTU)处理以防黑色素形成^[18]。

缺氧再灌注后斑马鱼胚胎脑部细胞凋亡及c-fos基因表达实验所用主要试剂：

缺氧再灌注后斑马鱼胚胎脑部细胞凋亡及c-fos基因表达实验所用主要仪器设备：

实验方法：

缺氧处理：缺氧装置参考文献[19]制作，见图1。实验组设有3个小组，分别为缺氧时间6，12，24 h。各组通过向水中充入高纯氮气(99.999%)使溶解氧浓度达到0.9 mg/L。对照组为正常通气组(溶解氧浓度在 7.0 mg/L左右)，所有实验组及对照组均设置了1个重复。每组约50个胚胎。实验到达缺氧时间点后，进行 6 h的恢复实验(正常通气)。

吖啶橙染色：吖啶橙染色用于检测细胞凋亡情况。恢复实验后，选取脱膜后的胚胎转移到2 mg/L的吖啶橙溶液(用PBS稀释)中避光处理15-20 min。用新的PBS冲洗胚胎2次。随后在0.16 g/L Tricaine(用PBS稀释)中处理5-10 min麻醉胚胎。在荧光体视镜下拍照，绿色荧光标记的细胞则为吖啶橙染色的阳性凋亡细胞。

细胞凋亡数目统计：参照文献[20]对吖啶橙染色后细胞凋亡数目分析，使用Photoshop图像处理软件将预定量的脑部区域裁切及利用磁性套锁工具去除背景，将裁切好的照片用Image J图像分析软件开启，将荧光色阶范围定出来(色阶选取范围视照片而定，以看清分析区域内所有荧光细胞为原则)，设好色阶范围后，在工具栏目中选取分析功能键，得出分析结果。实验重复3次，n=20。

取脑：取脑步骤参考文献[21]进行，见图2。将待取脑的胚胎置于0.16 g/L Tricaine(用PBS稀释)中5- 10 min麻醉后，在光学显微镜下，利用眼睛和卵黄囊作为形态学标志，先用微型镊子固定眼睛一端，再用 1 mL一次性注射器针头沿着图2中红线将斑马鱼胚胎的脑部轻轻取出。每组取脑组织约50 mg，n=50。

脑组织中总RNA的提取：采用RNA试剂盒(TRIzol，TaKaRa)提取脑组织中总RNA。按照试剂盒的说明，将50 mg的脑组织以质量体积比(1∶20)加1 mL TRIzol试剂，吹打匀浆至清亮为止，匀浆物在室温下静置孵育5 min，加入200 μL的氯仿上下轻摇15 s，室温下静置孵育5 min，离心15 min(4 ℃，12 000 r/min)，取上清液500 μL与等量的异丙醇混匀，室温下静置孵育 10 min，离心15 min(4 ℃，12 000 r/min)取沉淀；沉淀部分用体积分数为70%的乙醇-焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液溶解洗涤和离心(5 min，4 ℃，8 000 r/min)后取沉淀，将沉淀部分重复上述操作两三次，最后将沉淀部分在自然条件下通风干燥后，用DEPC水溶解得到纯净的脑组织RNA溶液，该RNA溶液用于进行下一步分析或贮藏于-80 ℃下备用。

RNA浓度的检测与反转录合成cDNA：将提取的脑组织总RNA溶液，分别在微量分光光度计上260 nm和 280 nm波长下测定其吸光度值，按照1A值等于 40 mg/L RNA计算出RNA的含量。按照反转录试剂盒说明书进行反转录反应，所得cDNA产物用于进行下一步分析或置于-20 ℃冰箱保存。

PCR引物设计与合成：检索EnsemblGenome Browser 和NCBI GenBank数据库，获得c-fos基因的cDNA序列，应用Primer Premier5.0软件分别设计其PCR引物，以elfa1基因作为内参对照基因。

引物均由北京华大基因研究中心合成。c-fos引物序列：Forward-TGC AAG CTG AAA CTG ACC；Reverse-TGA GGT AGT GAC GAT CTC TG。

根据SYBR Premix Ex Taq^TMⅡ试剂盒操作说明书制备反应体系，用MX3000P型PCR仪进行qPCR，扩增条件为：预变性：95 ℃ 30 s，循环 1 次；PCR 反应： 95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，循环 40 次；融解曲线分析：95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s，循环1次。反应体系为25 μL。重复检测3次，每次做3个复孔，分别计算同一样品3个复孔的Ct均值，以同一样本中的Ct值作为内参照，以各对照组胚胎标本为基准。

按照公式：ΔCt(域循环数)=目的基因Ct-内参基因Ct；ΔΔCt =ΔCt(实验组)-ΔCt(对照组)；差别倍数=2^-ΔΔCt，分别计算各组2^-ΔΔCt用以表示各组c-fos基因相对表达量，其中正常对照组的数值均为1^[22]。

主要观察指标：吖啶橙染色检测斑马鱼细胞凋亡情况；实时荧光定量核酸扩增(qPCR)检测斑马鱼脑组织c-fos基因表达。

统计学分析：应用SPSS 13.0软件进行统计分析，细胞凋亡数目和c-fos基因表达用x(_)±s表示，两组均数比较采用两个独立样本t 检验分析，以P < 0.05表示两组间差异有显著性意义。

讨论

即刻早期基因，是原癌基因家族中一类能被第二信使所诱导的原癌基因，亦称快速反应基因。即刻早期基因具有以下特点：①即刻早期基因的激活不依赖于新蛋白的合成，而是受一些转录因子的调控。②因其37端非翻译区存在丰富的不稳定系列，所以即刻早期基因自身也不稳定，半衰期较短。③编码的蛋白通常半衰期较长。④其蛋白表达产物能与DNA的特异序列结合。即刻早期基因家族主要包括fos、jun、c-myc和erg家族。目前研究最多的主要是c-fos和c-jun家族。

细胞凋亡，亦称程序性细胞死亡，是细胞生命的基本特征之一，是细胞接受某种信号后或受到某种刺激后一种主动的、由相关基因相互作用，以细胞DNA早期降解为特征的自杀行为，具有独特的形态学、生物化学特征，在清除体内老化和损伤细胞的过程中发挥重要作用。细胞凋亡作为一种新的细胞死亡概念己引起广泛的兴趣，并日益受到重视。近年来由于生物技术的广泛应用，越来越多的研究表明，在脑缺氧缺血性损伤中引起的凋亡起着重要作用，在对脑组织缺血再灌注机制的研究中发现，c-fos的激活在程序性细胞死亡的病理过程中起关键作用。

正常情况下大脑组织中c-fos基因呈低水平表达，当受到缺血、缺氧、外伤、癫痫和外周神经刺激时，该基因能迅速表达^[23]，这种表达是短暂的、一过性的，解除相应刺激后，其表达也很快恢复至正常水平。有研究表明，脑缺氧缺血后神经元网络受到破坏，特殊基因表达的改变，特别是能引导上调后期反应基因c-fos等即早基因表达的改变，可促使神经细胞对刺激、损伤产生不同的适应性变化，增强神经元的修复能力，加速神经元网络的重建，以恢复其正常功能^[24]。本实验用斑马鱼胚胎进行缺氧再灌注处理发现，缺氧6 h再灌注后，c-fos基因表达增加，达到峰值。但这时细胞凋亡的程度较轻，凋亡细胞数目上升幅度不高。随着缺氧时间延长至 12 h，细胞凋亡程度加重，脑细胞损伤亦进一步加重，此时c-fos基因表达仍增加，但其增幅较缺氧6 h再灌注组低，c-fos基因表达上升时间与脑细胞凋亡表达时间基本一致。缺氧24 h再灌注后，c-fos基因表达量逐渐下降，但脑组织凋亡程度却逐步加重，推测可能原因是神经元在受到长时间缺氧应激后，凋亡已经显著发生，同时伴随有脑细胞坏死，仅有少量幸免于缺氧损害的细胞仍存在c-fos基因的诱导表达。此外，c-fos基因可能仅仅在缺氧急性期被诱导表达，机体在接受24 h缺氧等长时间应激后，自身保护性机制逐渐加强，在一定程度上抑制了c-fos基因的活化，从而抑制其表达，亦抑制了c-fos基因介导的凋亡。但由于引起bcl-2、bax等促进细胞凋亡的相关基因的过度表达，从而进一步加重脑细胞的凋亡程度^[25]。

脑缺血再灌注后c-fos表达上调导致细胞凋亡数目增加的可能机制是：①兴奋性氨基酸(excitative amino acid，EAA)所激发的^[26-28]：脑缺氧缺血再灌注时必需氨基酸(特别是谷氨酸)释放增多，N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体激活，从而诱导c-fos表达。②脑缺氧缺血再灌注时细胞内Ca²⁺超载(Ca²⁺-overload)，可诱导c-fos表达，通过激活磷脂酶A2、环氧化酶、蛋白激酶与钙调蛋白结合，激活Ca²⁺/Cam激酶，通过对转录因子进行磷酸化修饰等途径诱导神经细胞c-fos表达^[29]。③脑缺氧缺血再灌注时产生的大量氧自由基，对细胞膜的不饱和脂肪酸诱导过氧化反应，产生过氧化脂质，从而损伤细胞膜、细胞器和酶功能。自由基可使DNA与RNA产生一系列变化，从而影响信息传递、转录和复制。④一氧化氮能诱导c-fos基因表达，引起细胞的凋亡。脑缺氧缺血及再灌注时脑组织的一氧化氮含量明显升高，可达基线水平的100倍^[30-31]。总之，脑缺血再灌注时兴奋性氨基酸、钙超载、自由基及一氧化氮的增多共同参与中枢神经系统中c-fos的表达过程，诱导细胞凋亡的发生。c-fos基因因脑缺氧缺血再灌注在中枢神经系统诱导转录后，其编码产物Fos随即与同时被诱导转录、编码的c-jun核磷蛋白Jun结合形成AP-1复合物，后者有可能再通过作用并影响靶基因的转录而参与脑缺氧缺血再灌注后的继发性损害，从而促进神经细胞凋亡^[32]。也就是说，c-fos是把短时外界伤害性刺激信号转变为长时程病理变化的关键性调控因素。脑缺氧缺血再灌注损伤的病理机制非常复杂，涉及兴奋性氨基酸毒性、细胞内钙负荷超载、自由基损伤、炎症反应及局部免疫反应等许多方面，其中脑缺血后脑组织局部神经细胞过度凋亡是造成再灌注损伤的主要原因之一。c-fos基因的过表达引起细胞凋亡增多的机制还需要进一步研究。

在目前为止对缺氧缺血再灌注脑损伤的机制研究中，所使用的动物模型最常见的是大鼠、猪、羊。制作大鼠脑缺氧模型，一般是将一侧颈动脉结扎，然后置于低氧环境中进行缺氧诱导过程，该模型一直存在争议，如早产大鼠很难存活，对其预后研究难以继续，而足月大鼠缺氧模型存在两种可能性，一种可能性是不能存活，而存活的大鼠往往没有任何精神、运动障碍的表现。利用羊、猪胎儿模型则成本很高，种群不一，难于进行较大样本量的研究^[33]。因此，建立一个新型、经济、简便且能大量繁殖的动物模型，对缺氧缺血再灌注脑损伤的研究，尤其在干预效果评价方面有十分重要的意义。

斑马鱼作为一种新型模式动物，具有易于饲养、发育快速、胚胎透明、繁殖力强等特点，在生物学医学研究中越来越受到重视^[34-36]。实验选用斑马鱼作缺氧缺血再灌注研究，是因为斑马鱼与人类的各种器官系统近似，例如：心血管系统、消化系统、神经系统10年中，越来越多的科学家都使用斑马鱼来制造疾病模型深入研究发病机制^[37-40]。研究人员在利用斑马鱼对疾病过程深入研究中发现，它与啮齿类动物显示出良好的相关性，斑马鱼实验是一个潜在的啮齿类动物实验的替代品^[41-42]。它是体外受精的动物，早期胚胎是透明的，透过电子显微镜可清楚观察胚胎发育过程中的变化，而且生长和发育迅速87%，意味着利用这种新型的模式生物，有望从基因水平针对c-fos相关靶基因进行干预调控，进一步实现对缺氧再灌注后c-fos基因及其表达的深入研究。国外有学者已经使用斑马鱼胚胎开始进行缺氧再灌注的研究^[43-46]。目前国内外还没有关于c-fos在斑马鱼脑缺血再灌注中的表达关系及其作用机制的报道。另外从临床应用前景方面，利用斑马鱼可作大规模的药物筛选，为缺氧再灌注脑损伤寻找新型药物提供了平台。，它的基因与人类基因的相似度达到等。在过去的

综上所述，c-fos基因的表达参与了缺氧再灌注后的细胞凋亡过程，加剧了神经元的损伤。但目前对缺氧再灌注后c-fos基因及其表达的机制研究尚未成熟，凭借斑马鱼模型与人类基因相似性高的优势，利用该模型对c-fos基因在脑缺氧再灌注中表达及其与神经细胞凋亡之间关系进行研究，将为探寻新的脑缺氧缺血治疗切入点及发现用药的有效时间窗提供有力的实验依据；同时强调尽早、及时地给予有效的干预措施，从而最大程度地保护和挽救凋亡前期神经细胞，并促使其恢复正常功能，减轻脑损伤。

缺氧再灌注斑马鱼胚胎脑部细胞凋亡及c-fos基因的表达

Zebrafish embryonic brain cell apoptosis and c-fos gene expression after hypoxia reperfusion

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 3

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	杨新华, 闫银弟, 罗旭光, 杨艳萍, 李海荣, 崔慧林, 曹锡梅. 钟基因Bmal1、Clock参与调节骨骼肌的发育分化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(20): 3130-3137.
[2]	李震, 黄永辉, 孙继芾, 孙海涛. 黏着斑激酶诱导小鼠胚胎成纤维细胞成骨分化的作用及机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(2): 165-171.
[3]	王冬慧, 武鑫, 孙宁宁, 张晗, 高剑峰. 电针干预放射性脑损伤小鼠海马区突触可塑性相关蛋白的表达[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(14): 2205-2210.
[4]	李行, 景雅, 李云华, 李海荣, 杨艳萍. Cx43敲除小鼠胚胎心脏流出道内第二生心区和心脏神经嵴来源间充质细胞减少[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(13): 2018-2024.
[5]	张晓波, 张杰, 孙钰. 未来软骨修复的热点方向：层粘连蛋白促进干细胞增殖[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(1): 141-145.
[6]	许国峰, 李学斌, 唐一钒, 赵寅, 周盛源, 陈雄生, 贾连顺. 人黄韧带细胞骨化发生过程中的自噬[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(8): 1174-1181.
[7]	周玉, 龙小安, 李宁, 王纯. 有限元法分析髌腱炎状态时的生物力学变化[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(8): 1280-1286.
[8]	中国研究型医院学会神经再生与修复专业委员会心脏重症脑保护学组, 中国研究型医院学会神经再生与修复专业委员会神经重症护理与康复学组. 成人心脏外科术后脑损伤诊治的中国专家共识[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(32): 5203-5212.
[9]	伟人悦, 厉雪纯, 李妍, 于扬, 张宇, 刘忠华. 无血清单层细胞诱导法培养猪诱导多能性干细胞定向分化为血管内皮细胞[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(31): 4971-4978.
[10]	蔡博治, 陈先才, 倪娜, 林伟深, 袁燕平, 林常敏, 黄铿. 鼠胚胎期和出生后毛囊下段启动再生表达的Wnt5a[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(31): 5018-5022.
[11]	陈江龙, 史新宇, 程军, 叶益超, 张震文, 李晓红, 孙洪涛. 人脐带间充质干细胞对大鼠创伤性脑损伤后血脑屏障的保护[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(25): 3947-3952.
[12]	马静怡, 杨文江, 李远迪, 黄佑娇, 高杰, 李红, 胡蓉, 苏敏. 自身免疫调节因子在小鼠胚胎干细胞向胸腺上皮祖细胞分化中的表达[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(25): 3994-3999.
[13]	林杰彬, 石毓灵, 高丰禾, 梁祖建. 补肾调肝方逆转泼尼松龙诱导的斑马鱼骨质疏松[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(20): 3146-3151.
[14]	汪萌, 张博. 基于微流控芯片模拟体内受精及早期胚胎发育环境的输卵管模型构建[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(2): 265-270.
[15]	刘卒, 韩燊, 李亚雄, 李昆林, 张雅永, 蒋立虹. 不同干细胞来源外泌体在心血管疾病治疗中的应用、作用及问题[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(19): 3063-3070.