EPCs是一类能增殖并分化为血管内皮细胞,但尚未表达成熟血管内皮细胞表型,也未形成血管的前体细胞
[3]。自Asahara等
[4]首次成功从人外周血中分离出EPCs,人们对EPCs进行了大量的研究。EPCs可来源于骨髓、脐带血、外周血。骨髓获取EPCs所需骨髓量大,创伤和风险也较大;虽然从外周血获取EPCs很方便,但其含量极其有限,约仅占单个核细胞的0.002%;脐带血中EPCs含量较外周血丰富,约为外周血中EPCs的10倍
[3],且脐带血来源广泛,获取方式为无损伤性,采集简便,对供者(新生儿和产妇)无不良影响,不涉及伦理学问题,对人类白细胞抗原错配有很好的耐受性及很强的增殖能力
[5],提取的脐血干细胞可以冷冻保存,建立干细胞库,为日后自体或血缘亲属使用提供可能,基于上述优点和组织工程心脏瓣膜对理想种子细胞的基本要求,使脐带血有望成为较理想的内皮祖细胞来源。
迄今人们还没有找到分离、培养EPCs 的标准程序,国内外常用的EPCs分离方法是免疫磁珠分选法和密度梯度离心法。前者优点是可获得较高纯度的EPCs,其缺点是得到的EPCs数量非常少,单独培养往往不能增殖,须与成熟内皮细胞等共同培养才有增殖活性,且该方法价格昂贵,操作复杂,对细胞活性影响大,容易污染;本实验采用密度梯度离心法分离EPCs,虽然分离的细胞纯度不高,但通过贴壁筛选法仍可获得相对较高纯度的EPCs,并且操作简单、经济,容易被广泛应用。
由于EPCs没有特异性的表面标记,所以它的鉴定也存在很大差异。在国内外大多数研究中,EPCs的鉴定主要是通过Dil-ac-LDL+和FITC-UEA-I+和(或) CD133+、CD34+、VEGFR-2+来完成的。文献认为能够同时吸收Dil-ac-LDL和结合FITC-UEA-I[6],即认为是正分化的EPCs;Peichev等[3]认为能表达CD34、VEGFR-2和CD133(又名AC133)的一类细胞是功能性内皮细胞的前体细胞,并在植入体内的左心辅助装置新生内膜上得到验证。CD133是造血干/祖细胞早期标志,也被认为存在于较为原始的EPCs中,随着细胞分化,CD133表达迅速下降,在成熟内皮细胞上不表达。本实验采用密度梯度离心法和贴壁筛选法分离培养和纯化EPCs,并对其进行性质和功能鉴定,分别选取了内皮细胞的表面标志CD34、VEGFR-2进行检测,并运用吸收Dil-ac-LDL和结合FITC-UEA-I的能力等综合判断细胞类型及细胞功能。从实验结果来看,此分离和纯化EPCs的方法能够得到较高纯度和较高同源性的EPCs;应用流式细胞仪分析不同时段EPCs表面标记的变化,EPCs经诱导分化后,细胞表面CD133的表达迅速下降和消失,而始终有CD34和VEGFR-2等成熟内皮细胞表面标志的表达,并且最终可分化为典型成熟内皮细胞鹅卵石样形态,这些均表明实验培养的EPCs经诱导可定向分化为成熟内皮细胞,该结果与国内外的文献报道相一致[7-18]。
EPCs区别于成熟内皮细胞的一个重要特性就是具有迟发高增殖潜能。成熟内皮细胞在体外很快进入增殖期,但4~6周后增殖能力明显下降,而EPCs在15~20 d后形成迅速生长的“鹅卵石”样ECs,并能稳定传30代以上,其增殖能力是ECs的10倍[19];本实验通过比较EPCs和HUVECs的增殖和迁移能力,结果显示EPCs增殖能力明显强于HUVECs,在适宜的条件下可以快速增殖、分化,并可通过短时间培养达到构建组织工程心脏瓣膜所需的细胞数量;而且EPCs迁移能力也明显优于HUVECs,这为EPCs在支架材料上种植后增殖、黏附、迁移提供了基础,因此,EPCs有望成为构建组织工程心脏瓣膜的理想种子细胞来源。
此外,研究发现体外培养的EPCs经转化生长因子β1诱导后,可以由内皮表型(CD31+/vWF+/α-SMA-) 转变为间充质细胞表型(CD31+/α-SMA+),并且分泌产生层黏连蛋白及Ⅰ、Ⅲ型胶原等细胞外基质[20],这为种植EPCs后构建具有生长潜能和自我修复能力的组织工程心脏瓣膜提供可能。
综上所述,采用密度梯度离心法和贴壁筛选法成功从脐带血中分离、纯化EPCs,经体外诱导分化,可向成熟内皮细胞转化,该方法操作简单、经济,取材容易,易于推广应用;而且EPCs增殖和迁移能力明显高于成熟内皮细胞,可以体外大量扩增,能够满足组织工程心脏瓣膜内皮化的需求,有望成为理想的种子细胞之一。