自体外周血单个核细胞治疗高位桡神经离断伤

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0457

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (9): 1438-1442.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0457

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自体外周血单个核细胞治疗高位桡神经离断伤

岳凤文¹，刘力萍²，孙广峰¹，吴祥奎¹，魏在荣¹，王达利¹

¹遵义医学院附属医院烧伤整形外科，贵州省遵义市 563000；²川北医学院，四川省南充市 637000

修回日期:2018-03-02 出版日期:2018-03-28 发布日期:2018-04-03
通讯作者: 孙广峰，副主任医师，遵义医学院附属医院烧伤整形外科，贵州省遵义市 563000
作者简介:岳凤文，男，1992年生，四川省南江县人，汉族，遵义医学院在读硕士，主要从事创伤与修复方面的研究。
基金资助:
贵州省卫计委科学技术基金项目[黔卫计办函gzwjkj2016-1-033]；遵义市红花岗区科学技术项目[遵红科合社字(2012)11号]

Efficacy of autologous peripheral blood mononuclear cells in treatment of high radial nerve injury

Yue Feng-wen¹, Liu Li-ping², Sun Guang-feng¹, Wu Xiang-kui¹, Wei Zai-rong¹, Wang Da-li¹

¹Department of Burn and Plastic Surgery, Affiliated Hospital of Zunyi Medical University, Zunyi 563000, Guizhou Province, China; ²North Sichuan Medical College, Nanchong 637000, Sichuan Province, China

Revised:2018-03-02 Online:2018-03-28 Published:2018-04-03
Contact: Sun Guang-feng, Associate chief physician, Department of Burn and Plastic Surgery, Affiliated Hospital of Zunyi Medical University, Zunyi 563000, Guizhou Province, China
About author:Yue Feng-wen, Master candidate, Department of Burn and Plastic Surgery, Affiliated Hospital of Zunyi Medical University, Zunyi 563000, Guizhou Province, China
Supported by:
the Science and Technology Fund Project of Guizhou Provincial Health and Family Planning Commission, No. gzwjkj2016-1-033; the Science and Technology Project of Zunyi Municipal Honghuagang District, No. [(2012)11]

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
自体外周血干细胞：骨髓产生大量干细胞，一部分进入到外周血中，称为外周血干细胞，正常情况下，外周血中的干/祖细胞的含量占单个核细胞的很少一部分，但是经动员由骨髓释放到外周血中的造血干细胞数量明显增加，甚至细胞数量可以达到骨髓中的水平，且具备成体干细胞的特点。
自体外周血单个核细胞：是存在于外周血中具有单个核细胞的总称，其中含有诸多干细胞(造血干细胞、血管内皮祖细胞、间充质干细胞、淋巴细胞和单核细胞等)，有强大的自我增殖能力，在微环境以及特定条件下可以向心肌细胞、神经细胞、血管内皮细胞等分化的一种细胞。

摘要
背景：近年来神经干细胞、脂肪间充质干细胞、肌源性干细胞、诱导多能干细胞已应用于治疗周围神经损伤，但自体外周血单个核细胞应用于外周神经损伤的治疗鲜有报道。
目的：观察自体外周血单个核细胞治疗高位桡神经离断伤的疗效。
方法：自2011年4月至2015年9月，共收治上臂中段桡神经离断伤12例，术前动员外周血单个核细胞，手术当日提取外周血单个核细胞悬液15 mL，手术探查吻合桡神经，显微镜下行端端外膜缝合法吻合神经，用浸泡5 mL自体外周血单个核细胞悬液的凝胶海绵包裹神经吻合口，剩余10 mL外周血单个核细胞悬液行局部肌肉多点注射，每点注射0.5 mL，缝合深筋膜，常规缝合伤口。术后给予抗生素预防感染48 h，上肢制动4周，指导患者康复锻炼。随访观察腕关节背伸度数、伸腕伸指肌肌力，进行疗效评价。
结果与结论：①术后患者均获随访，随访时间15-36个月，平均17个月；②综合评价：优9例，良2例，可1例，差0例，优良率为92%；③腕关节背伸均能够达到功能需要，拇指背伸、伸指基本满足功能要求；④结果提示，自体外周血单个核细胞移植治疗高位桡神经损伤效果满意。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-8252-3512(岳凤文)

关键词: 桡神经损伤, 自体外周血单个核细胞, 神经再生, 神经吻合, 自体神经, 运动终板, ；修复与再生, 干细胞

Abstract:

BACKGROUND: In recent years, neural stem cells, adipose tissue derived mesenchymal stem cells, muscle derived stem cells and induced pluripotent stem cells have been applied in the treatment of peripheral nerve injuries. However, the treatment of peripheral nerve injury by autologous peripheral blood mononuclear cells has rarely been reported.
OBJECTIVE: To investigate the efficacy of autologous peripheral blood mononuclear cells in the treatment of high radial nerve injury.
METHODS: From April 2011 to September 2015, 12 cases of radial nerve injury in the middle arm were treated. Preoperatively peripheral blood mononuclear cells were mobilized, and then 15 mL of mononuclear cell suspension was prepared on the operation day. Radial nerves scheduled for anastomosis were surgically explored and subjected to end-end anastomosis using outer membrane suturing under microscope. The anastomotic site of the nerve was enveloped with gelatin sponge soaked with 5 mL of autologous peripheral blood mononuclear cell suspension. The remaining 10mL of cell suspension was used for a multi-point injection into the local muscles, 0.5 mL at each point. Thereafter, the deep fascia and the incision were sutured in sequence. Postoperative antibiotics were used to prevent infection for 48 hours, and upper limb immobilization lasted for 4 weeks. Performance of rehabilitation exercise was guided. During the follow-up, wrist dorsal extension and muscle strength of extensor carpi ulnaris and extensor digitorum communis were detected to evaluate the therapeutic efficacy.
RESULTS AND CONCLUSION: All the patients were followed up for 15 to 36 months, with an average of 17 months. Efficacy was excellent in 9 cases, good in 2 cases, fair in 1 case and poor in 0 case. The excellent and good rate was 92%. The wrist dorsal extension could achieve the functional needs, and the thumb dorsal extension and finger extension basically met the functional requirements. It is suggested that autologous peripheral blood mononuclear cell transplantation can achieve good outcomes in the treatment of high radial nerve injury.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Radial Nerve, Peripheral Blood Stem Cell Transplantation, Nerve Regeneration, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

岳凤文，刘力萍，孙广峰，吴祥奎，魏在荣，王达利. 自体外周血单个核细胞治疗高位桡神经离断伤[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(9): 1438-1442.

Yue Feng-wen, Liu Li-ping, Sun Guang-feng, Wu Xiang-kui, Wei Zai-rong, Wang Da-li. Efficacy of autologous peripheral blood mononuclear cells in treatment of high radial nerve injury[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(9): 1438-1442.

图/表（结果） 1

2.1 受试者数量分析 入组患者12例，男7例，女5例，术后均获随访，随访期无脱落。

2.2 研究对象入组流程 见图1。

2.3 腕关节背伸及伸拇伸指情况 共计12例患者，术后均获随访，随访时间15-36个月，平均17个月。腕关节背伸 > 45° 10例、 ≥ 30° 2例、< 30° 0例；掌指关节背伸优9例、良2例、可1例、差0例；拇指背伸优8例、良3例、可1例、差0例；桡侧外展恢复满意。综合评价：优9例，良2例，可1例，差0例，优良率为92%。

2.4 不良反应 术后伤口均Ⅰ期愈合，无感染、血肿并发症发生，外周血单个核细胞动员过程中未见与重组人粒细胞刺激因子相关不良反应，无血栓及心脑血管事件发生；提取过程中2例患者发生低钙抽搐不适，给予静脉缓慢注射10%葡萄糖酸钙10 mL后缓解；移植后患者均未发生发热、过敏、免疫排斥反应。

2.5 典型病例 患者男，16岁，因刀刺伤左上臂致垂腕垂指畸形伴功能障碍4 d入院。入院查体：生命体征平稳。专科情况：左上臂敷料包扎中，无渗血、渗液，打开敷料见左前臂稍肿胀，中段外侧一长约5 cm纵行切口已清创缝合，左侧腕关节下垂，腕关节背伸不能，虎口区痛觉消失，手指背伸不能，左手拇指背伸不能，桡侧外展不能，左侧肩关节活动正常，肘关节伸曲正常，桡动脉搏动正常，肢端血运好。诊断：左上臂桡神经损伤。完善术前相关检查，入院白细胞7.27×10⁹ L^-1，重组人粒细胞刺激因子10 μg/(kg•d)皮下注射，每日监测血常规，动员2 d后白细胞升至26.51×10⁹ L^-1 ，开始采集外周血单个核细胞。臂丛麻醉下行桡神经探查吻合术+自体外周血单个核细胞局部移植术，石膏外固定上肢肘关节于90°屈曲位、伸腕20°-30°、掌指关节伸直位，常规给予抗生素预防感染48 h，2周拆线，石膏外固定4周，改用手功能肢具夜间给予保护，并指导患者康复锻炼。随访观察18个月，腕关节背伸有力，腕关节背伸45°，伸指、伸拇满意，见图2。

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引言

桡神经损伤临床较为常见，损伤后导致垂指、垂腕畸形以及虎口区域感觉缺失，严重影响患者日常生活^[1-2]。目前临床上常用的方法是利用显微外科技术予以端对端无张力神经外膜缝合，若有缺损则选择自体神经桥接、神经套接管桥接等方式修复，术后辅以药物、针灸、理疗、电疗等治疗促进神经纤维生长及肌肉功能恢复，但总的效果不尽人意，神经肌肉功能恢复不理想，且上臂中段桡神经损伤后距离靶器官较远，神经再生速度较慢，神经靶器官萎缩、变性、运动神经肌肉终板退变等原因，影响术后神经远端肌肉功能恢复^[3-5]。近年有关于骨髓间充质干细胞及脂肪干细胞等促进神经损伤后功能恢复并取得一定疗效的报道^[6-7]，但其受限于分离技术纯化难，伦理学等诸多问题。同时也有外周血干细胞用于临床促进周围神经肌肉功能恢复的报道^[8]，通过手术和外周血干细胞移植干预的患者获得较好的感觉及运动功能，但是外周血干细胞含量只占外周血单个核细胞的0.01%-0.1%^[9]，限制其广泛应用。研究证实，外周血单个核细胞具有多能干细胞的特性^[10-15]，并且这些外周血单个核细胞可被体外诱导分化成类神经元细胞、间质细胞、内皮细胞和上皮样细胞等^[16-17]。因此，外周血单个核细胞具有丰富的临床应用价值。已经有学者开展关于单个核细胞的临床前应用研究实验^[18]，但目前很少有关于外周血单个核细胞促进神经生长的临床研究。

作者所在治疗组于2011年4月至2015年9月，共收治上臂高位桡神经完全离断伤12例，均予以显微外科神经外膜间断无张力缝合后局部移植自体外周血单个核细胞治疗，效果满意，现报道如下。

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材料方法

1.1 设计 回顾性病例分析。
1.2 时间及地点 自2011年4月至2015年9月在遵义医学院附属医院细胞工程实验室及整形外科手术室共同完成。
1.3 对象 自2011年4月至2015年9月共收治上臂中段桡神经离断伤12例，男7例，女5例；年龄15-56岁，平均29岁。其中2例仅少许外膜相连。致伤原因：刀伤8例，玻璃割伤4例。合并损伤：均伴有不同程度肌肉裂伤。受伤距手术时间4-9 d，平均6 d。
诊断标准：经询问病史、临床症状、体征明确诊断周围神经损伤。
纳入标准：①明确诊断高位桡神经损伤并愿意采用神经修复局部自体外周血单个核细胞移植者；②患者对治疗均知情同意，并签署知情同意书，且试验方案经医院伦理委员会批准。
排除标准：①通过病史及查体仅有轻度神经损伤表现，肌力≥ 4级；②术中探查仅有神经挫伤并无神经离断或离断断面不足断面面积1/4。
所有患者均术前动员外周血单个核细胞，手术当天采集外周血单个核细胞悬液，术中采用显微外科技术间断无张力缝合神经外膜，局部应用自体外周血单个核细胞移植治疗。
1.4 方法
1.4.1 外周血单个核细胞动员患者急诊清创后或者入院后第1天开始给予重组人粒细胞刺激因子(北京四环生药业)，10 μg/(kg•d)皮下注射^[19]，每日监测血常规，待外周血白细胞增至(20-30)×10⁹ L^-¹行外周血单个核细胞采集。
1.4.2 外周血单个核细胞的采集与鉴定 手术当日采用费森尤斯COM.TEC 型血细胞分离机autoMNC程序采集患者外周血单个核细胞，采用autoMNC程序，共计4个循环，采集外周血单个核细胞悬液15 mL。参照文献[20]所述，利用CD45⁺细胞表面分子作为外周血单个核细胞表面标志，取部分采集细胞悬液进行流式细胞术鉴定，得到12例患者CD45⁺外周血单个核细胞采集百分比为(87.58±9.67)%。
1.4.3 外周血单个核细胞移植 臂丛麻醉，仰卧位，患肢外展，常规消毒铺巾，探查并分离高位桡神经，显露桡神经断端，修剪已经严重挫伤失活的组织至可见神经乳头，显微镜下应用9-0无损伤线吻合神经外膜，应用5 mL外周血单个核细胞悬液浸泡的医用凝胶海绵置于桡神经吻合口周围，周围肌肉内多点注射剩余单个核细胞细胞悬液，每点0.5 mL，缝合深筋膜，逐层关闭手术切口，消毒后无菌敷料覆盖包扎，石膏外固定上肢肘关节屈曲90°位、伸腕20°-30°、掌指关节伸直位。
1.4.4 移植后处理 术后预防性使用抗生素48 h，术后2周伤口愈合拆线后出院，石膏外固定4周，改用手功能肢具夜间给予保护，指导患者逐渐加强功能锻炼。
1.4.5 术后随访神经肌肉功能评价指标 功能及肌力评价参照中华医学会手外科学会“上肢周围神经功能评定试用标准”进行评分^[21]，优：13-16分，良：9-12分，可：5-8分，差：≤ 4分，见表1。

1.5 主要观察指标 伸腕角度，伸指、伸拇肌力。

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讨论

高位桡神经损伤后将严重影响患者伸腕、伸拇和伸指功能^[22]，相应感觉支配区域感觉丧失，致残率高，严重影响患者生活质量。目前，对于周围神经损伤主要依赖于显微外科技术，能直接缝合的采用精确的端对端神经外膜无张力缝合^[23]，术后予以神经营养药物、针灸、理疗、经皮电刺激、早期进行康复锻炼等，最大限度恢复神经的连续性及其支配功能。虽周围神经的再生能力比中枢神经强^[24]，但是周围神经损伤后需经过2周休克期后以1 mm/d的缓慢速度开始生长^[25]，对于高位桡神经损伤，距离靶器官较远，神经长入远端的靶器官需要更长时间，长期的去神经化导致神经干、神经内膜管及靶器官萎缩，运动终板变性、蜕变，神经元-神经-靶器官之间的联系中断，影响神经再生及靶器官功能恢复。显然目前神经再生已经发展到瓶颈阶段，再精细的手术治疗也很难完全恢复神经肌肉功能^[26]。

近年来再生医学逐渐出现在大家的视野，具有旺盛增殖能力的干细胞已经被应用于多个领域，干细胞可以分泌多种神经营养因子以及分化成为神经细胞，促进神经修复及再生，帮助恢复靶器官功能，是一种治疗周围神经损伤的新手段。目前已有脂肪间充质干细胞、神经干细胞、肌源性干细胞、诱导多能干细胞、骨髓间充质干细胞、羊水间充质干细胞及脐血间充质干细胞等应用于周围神经损伤的相关报道^[27-29]。因存在伦理学、难取材、免疫原性、干细胞难以控制及致瘤性等原因限制其临床应用^[30]。Raheja等^[31]应用骨髓源性单个核细胞修复坐骨神经损伤取得较好的效果，但是骨髓源性单个核细胞获取过程复杂以及带有有创性。外周血单个核细胞是存在于外周血中具有单个核的细胞的总称，其中含有诸多干细胞：造血干细胞、血管内皮祖细胞、间充质干细胞、淋巴细胞和单核细胞等，有强大的自我增殖能力，在微环境以及特定条件下可以向心肌细胞^[32]、神经细胞^[33]、血管内皮细胞等分化^[34]，且取材方便、损伤小恢复快、不涉及到伦理问题、无免疫排斥反应，其作为修复周围神经损伤的种子细胞有应用价值。课题组前期进行动物实验，发现外周血单个核细胞移植到坐骨神经离断伤模型大鼠后能够减轻肌肉萎缩，同时促进神经纤维及髓鞘再生进而促进后肢运动功能恢复^[35]。

自开展外周血单个核细胞局部移植促进高位桡神经损伤以来，尚未发现相关毒副作用以及免疫排斥反应，所有患者术后均获随访，运动、感觉功能恢复取得满意效果。张钰等^[35]研究发现，外周血单个核细胞移植于大鼠坐骨神经损伤后，睫状神经营养因子、胶质源性神经生长因子、脑源性神经营养因子水平明显升高，提示可能与外周血单个核细胞移植到局部微环境后，分泌的各种细胞因子及内源性神经营养因子，能支持轴突生长，促进许旺细胞增殖迁移，并且在微环境的诱导下向神经细胞分化，促进轴突生长以及髓鞘形成，促进局部血管形成，进一步提供优良的修复环境有关，有待进一步研究证实。叶华隆等^[36]提到周围再生微环境和局部瘢痕黏连尤为重要，神经断端吻合不良、缝线、异物反应是造成瘢痕重要原因，瘢痕导致神经外膜与周围结缔组织黏连严重影响周围神经功能恢复。手术采用显微镜下端对端无张力间断缝合方式修复，神经断端周围明胶海绵包裹，明胶海绵可以承载约5 mL细胞悬液，将更多细胞包裹在断端周围，减轻与周围组织黏连，有效防止卡压等影响神经功能恢复。

注意事项：①在整个术前骨髓动员过程中均需要注意检测血常规，避免因粒细胞刺激因子动员所致高粒细胞血症而发生血栓形成及心脑血管意外等相关并发症，必要时可予以低分子肝素钙抗凝治疗；②在血细胞分离机的采集过程中，严密关注患者生命体征及心慌、胸闷等不良反应，抗凝剂枸橼酸盐会不断的进入人体，过量将导致中毒症状；在不影响采集效率的情况下可以适当减低抗凝剂枸橼酸葡萄糖的用量和比例；部分患者会出现抽搐不适，采集过程中预先静脉给予10%葡萄糖酸钙10 mL来避免抽搐情况发生；③外周血单个核细胞的提取需要耗费一定时间，需协调好手术以及细胞提取时间，争取在提取后1 h内完成注射，以免细胞离体时间过长影响细胞活性；④神经吻合需要在显微镜下根据神经干断面的形态、束的大小、神经滋养血管的位置等综合判断^[2]，尽可能做到精准的端对端无张力神经外膜缝合，避免神经缝合口张力过大造成神经拉长变细，神经生长通道变窄，再生神经轴束通过缝合口困难^[37]。

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自体外周血单个核细胞治疗高位桡神经离断伤

Efficacy of autologous peripheral blood mononuclear cells in treatment of high radial nerve injury

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[1]	帅芝琴, 陈家蒙, 刘滔滔, 胡安玲, 李利生, 余丽梅, 徐尚福. 干细胞及其来源外泌体防治血管再狭窄的研究现状与问题[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(1): 138-144.
[2]	李仲康, 郑嘉华, 田彦鹏, 黄向华. 间充质干细胞治疗卵巢早衰的最新进展及机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(1): 145-152.
[3]	王书韵, 谢君辉, 余学锋. 间充质干细胞治疗糖尿病肾病的作用与机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(1): 153-158.
[4]	林苗远, 李豫皖, 刘毅, 陈贝, 张莉. 组织工程皮肤的研究热点及应用价值[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(1): 159-166.
[5]	宋慧芳, 谈佳音, 康毅, 李斌, 毕志斐, 龙女, 夏仲年, 郭蕊. 低氧预处理增强老年人骨髓间充质干细胞条件培养基对H9C2细胞氧化应激损伤的保护作用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(1): 1-6.
[6]	郭秋霞, 王吉刚. 淋巴瘤患者外周血造血干细胞动员采集过程中相关因素对首次采集结果的影响[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(1): 7-11.
[7]	梅运运, 张建军, 王东. 高压氧联合NgR基因沉默骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠脊髓损伤[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(1): 12-19.
[8]	谢兴奇, 胡伟, 屠冠军. 骨髓间充质干细胞来源外泌体与硫酸软骨素酶ABC联合治疗大鼠脊髓损伤[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(1): 20-26.
[9]	张学磊, 罗干, 于圣会, 顾祖超, 彭旭, 何学令, 刘艳, 张晓梅. 脱细胞神经联合骨髓间充质干细胞及富血小板凝胶治疗股神经损伤[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(1): 27-32.
[10]	赵来赫, 夏冰, 马腾, 高楗勃, 李胜友, 高雪, 郑毅, 胡广文, 罗卓荆, 黄景辉. 骨髓间充质干细胞诱导为类许旺细胞的细胞外基质促进周围神经损伤后轴突再生[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(1): 33-39.
[11]	麦丽萍, 何国东, 陈少贤, 朱杰宁, 侯兴华, 张梦珍, 李晓红. 乙醛脱氢酶3B1在人骨髓间充质干细胞自然衰老过程中的表达[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(1): 40-44.
[12]	杨腾云, 李彦林, 刘德健, 王国梁, 郑竹君. 转化生长因子β3诱导外周血源性间充质干细胞成软骨分化的量效关系[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(1): 45-51.
[13]	孟德峰, 李长仔, 吴春涛. LINC02532靶向miR-145影响胰腺癌干细胞的增殖、迁移、侵袭和凋亡[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(1): 52-58.
[14]	黄涛, 程志坚, 贾志强, 赵晓光, 王磊, 翟文静, 周永新. miR-146a调控脂肪间充质干细胞成骨分化的机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(1): 70-75.
[15]	刘璐, 杨宇明, 商艾晨, 刘翠, 孙策, 王静. CD44⁺膀胱癌干细胞中角蛋白6B的表达和调控[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(1): 76-83.