促红细胞生成素抑制急性梗死心肌炎症因子的表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.33.017

中国组织工程研究

• 组织构建与生物活性因子 tissue construction and bioactive factors • 上一篇下一篇

促红细胞生成素抑制急性梗死心肌炎症因子的表达

张新金，江樊莉，李建美

云南省第二人民医院心内科，昆明医科大学第四附属医院心内科，云南省昆明市 650021

收稿日期:2013-05-07 修回日期:2013-05-22 出版日期:2013-08-13 发布日期:2013-08-13
作者简介:张新金☆，男，1979年生，湖北省荆州市人，汉族，博士，硕士生导师，副主任医师，主要从事冠心病介入治疗及心脏重构的基础研究。 zxjgry2004@sina.com
基金资助:
国家自然科学基金资助项目(30960138)；云南省自然科学基金资助项目(2009ZC176M)。

Erythropoietin suppresses myocardial inflammatory cytokine expression in acute myocardial infarction rats

Zhang Xin-jin, Jiang Fan-li, Li Jian-mei

Department of Cardiology, Second People’s Hospital of Yunnan Province, Fourth Affiliated Hospital of Kunming Medical University, Kunming 650021, Yunnan Province, China

Received:2013-05-07 Revised:2013-05-22 Online:2013-08-13 Published:2013-08-13
About author:Zhang Xin-jin☆, M.D., Master’s supervisor, Associate chief physician, Department of Cardiology, Second People’s Hospital of Yunnan Province, Fourth Affiliated Hospital of Kunming Medical University, Kunming 650021, Yunnan Province, China zxjgry2004@sina.com
Supported by:
National Natural Science Foundation of China, No. 30960138*; Natural Science Foundation of Yunnan Province, No. 2009ZC176M*

摘要/Abstract

摘要：

背景：研究表明，炎症细胞因子可影响心肌梗死后的预后，在心脏重构的进程中起重要作用。同时促红细胞生成素的促红细胞生成之外的非造血效应也被广泛证实：促红细胞生成素可通过与靶细胞膜表面的促红细胞生成素受体结合而减少炎症反应，从而减少心肌缺血后的再灌注损伤。
目的：观察重组人促红细胞生成素对大鼠急性心肌梗死后心脏重构中炎症因子表达的影响。
方法：通过结扎左冠状动脉前降支建立SD大鼠急性心肌梗死模型，分为5组，假手术组注射生理盐水，手术对照组造模后注射生理盐水，SB203580组造模后注射p38 MAPK的高选择性阻断剂SB203580，促红细胞生成素组造模后注射促红细胞生成素注射液，促红细胞生成素+SB203580组造模后注射促红细胞生成素+ SB203580混合液，分别在造模前、造模后1 d、1周、2周及4周进行尾静脉采血，酶联免疫吸附法检测血清中白细胞介素1β、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α水平变化。
结果与结论：造模前各组大鼠血清白细胞介素1β、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α检测值差异均无显著性意义(P > 0.05)。假手术组各时段白细胞介素1β、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α检测值差异无显著性意义(P > 0.05)，其余4组不同时段各因子检测值呈现造模后1 d最高，造模后4周回降的趋势(P < 0.05)。造模后手术对照组血清各因子检测值较其他组升高明显，而假手术组血清各因子检测值均低于其他4组(P < 0.05)；使用药物进行干预的3组中，促红细胞生成素+SB203580组各因子检测值较低(P < 0.05)，而促红细胞生成素组与SB203580组各因子检测值差异无显著性意义(P > 0.05)。提示重组人促红细胞生成素抑制了大鼠急性心肌梗死后心脏重构中炎症因子白细胞介素1β、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α的表达，重组人促红细胞生成素抑制炎症因子表达的机制可能与转化生长因子β1-TAK1-p38 MAPK信号路径相关。

关键词: 组织构建, 组织构建与生物活性因子, 生物活性因子, 促红细胞生成素, SB203580, 丝裂原活化蛋白激酶, 心肌梗死, 炎症因子, 心脏重构, 机制, 信号路径, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Studies have shown that inflammatory cytokines may influence the prognosis after myocardial infarction, and play an important role in the process of cardiac remodeling. The non-hematopoietic effects of erythropoietin have been confirmed: erythropoietin can reduce the inflammatory reaction through bending with the erythropoietin on the surface of target cell membrane, thus decreasing the reperfusion injury after myocardial ischemia.
OBJECTIVE: To observe the effect of recombinant human erythropoietin on the inflammatory factor expression during cardiac remodeling in rats with acute myocardial infarction.
METHODS: Sprague Dawley rat models of acute myocardial infarction were established through the ligation of the left anterior descending coronary artery. The rats were divided into five groups: sham operation group was injected with normal saline; operation control group was injected with normal saline after modeling; SB203580 group was injected with highly selective p38 MAPK inhibitor SB203580 after modeling; erythropoietin group was injected with erythropoietin after modeling; the erythropoietin+SB203580 group was injected with erythropoietin+SB203580 mixed solution after modeling. The tail vein blood samples were collected before modeling, 1 day, 1 week, 2 weeks and 4 weeks after modeling, and then enzyme-linked immunosorbent assay was used to detect the levels of interleukin-1β, interlrukin-6 and tumor necrosis factor-α.
RESULTS AND CONCLUSION: There were no significant differences in the levels of interleukin-1β, interlrukin-6 and tumor necrosis factor-α between groups before modeling (P > 0.05). There were no significant differences in the levels of interleukin-1β, interlrukin-6 and tumor necrosis factor-α between different time points in the sham operation group (P > 0.05), and the levels were highest at 1 day after modeling in the other four groups, and then decreased at 4 weeks after modeling (P < 0.05). After modeling, the level of serum cytokines in the operation control group were higher than those in the other four groups, while level of serum cytokines in the sham operation group was lower than that in the other four groups (P < 0.05); among the three groups intervened with drugs, level of serum cytokines was lower in the erythropoietin+SB203580 group (P < 0.05), while there was no significant difference in the level of serum cytokines between erythropoietin group and SB203580 group (P > 0.05). Recombinant human erythropoietin can inhibit the expressions of inflammatory factors (interleukin-1β, interlrukin-6 and the tumor necrosis factor-α) during cardiac remodeling after rat acute myocardial infarction, and the mechanism of recombinant human erythropoietin for inhibiting the expressions of inflammatory factors may related with the transforming growth factor β1-TAK1-p38 MAPK signal pathway.

Key words: tissue construction, tissue construction and bioactive factors, bioactive factors, erythropoietin, SB203580, mitogen-activated protein kinases, myocardial infarction, inflammatory cytokines, cardiac remodeling, mechanism, signal pathway, National Natural Science Foundation of China

中图分类号:

R318

张新金，江樊莉，李建美. 促红细胞生成素抑制急性梗死心肌炎症因子的表达[J]. 中国组织工程研究, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.33.017.

Zhang Xin-jin, Jiang Fan-li, Li Jian-mei. Erythropoietin suppresses myocardial inflammatory cytokine expression in acute myocardial infarction rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.33.017.

图/表（结果） 6

2.1 实验动物数量分析手术对照组因心律失常死亡1只，造模后第8天因心衰肺部感染死亡1只；促红细胞生成素药物干预组，因心脏破裂大出血死亡1只；SB203580组因动物相互撕咬死亡1只；假手术组和促红细胞生成素+ SB203580药物组无死亡情况，5组共有36只大鼠达实验终点获取血样标本。
2.2 各组大鼠各时段血清白细胞介素1β检测结果见图1。

各组大鼠各时段血清白细胞介素1β检测数据见表1。造模前各组大鼠血清白细胞介素1β检测值差异无显著性意义(P > 0.05)。除假手术组各时段白细胞介素1β检测值差异无显著性意义(P > 0.05)外，其余各组不同时段白细胞介素1β检测值均以造模后1 d最高，造模后4周回降，差异有显著性意义(P < 0.05)。除造模前外，手术对照组的大鼠血清白细胞介素1β检测值高于其他4组，差异有显著性意义(P < 0.05)；假手术组的大鼠血清白细胞介素1β检测值低于其他4组，差异有显著性意义(P < 0.05)；促红细胞生成素+SB203580组的大鼠血清白细胞介素1β检测值低于其他两药物干预组，差异有显著性意义(P < 0.05)；促红细胞生成素组与SB203580组的大鼠血清白细胞介素1β检测值差异无显著性意义(P > 0.05)。

2.3 各组大鼠各时段血清白细胞介素6检测结果各组大鼠各时段血清白细胞介素6检测数据见表2。造模前各组大鼠血清白细胞介素6检测值差异无显著性意义 (P > 0.05)。除假手术组各时段白细胞介素6检测值差异无显著性意义(P > 0.05)外，其余各组不同时段白细胞介素6检测值均以造模后1 d最高，造模后4周回降，差异有显著性意义(P < 0.05)。除造模前外，手术对照组的大鼠血清白细胞介素6检测值高于其他4组，差异有显著性意义(P < 0.05)；假手术组的大鼠血清白细胞介素6检测值低于其他4组，差异有显著性意义(P < 0.05)；促红细胞生成素+SB203580组的大鼠血清白细胞介素6检测值低于其他两药物干预组，差异有显著性意义(P < 0.05)；促红细胞生成素与SB203580组的大鼠血清白细胞介素6检测值差异无显著性意义(P > 0.05)，见图2。

2.4 各组大鼠各时段血清肿瘤坏死因子α检测结果各组大鼠各时段血清肿瘤坏死因子α检测数据见图3及表3。造模前各组大鼠血清肿瘤坏死因子α检测值差异无显著性意义(P > 0.05)。除假手术组各时段肿瘤坏死因子α检测值差异无显著性意义(P > 0.05)外，其余各组不同时段肿瘤坏死因子α检测值均以造模后1 d最高，造模后4周回降，差异有显著性意义(P < 0.05)。除造模前外，手术对照组的大鼠血清肿瘤坏死因子α检测值高于其他4组，差异有显著性意义(P < 0.05)；假手术组的大鼠血清肿瘤坏死因子α检测值低于其他4组，差异有显著性意义(P < 0.05)；促红细胞生成素+SB203580组的大鼠血清肿瘤坏死因子α检测值低于其他两药物干预组，差异有显著性意义(P < 0.05)；促红细胞生成素与SB203580组的大鼠血清肿瘤坏死因子α检测值差异无显著性意义(P > 0.05)。

综上所述，各组大鼠各时段血清白细胞介素1β、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α的检测结果(表1-3，图1-6)显示出相同的趋势：造模前各组大鼠血清各炎症因子检测值差异无显著性意义(P > 0.05)。除假手术组各时段各炎症因子检测值差异无显著性意义(P > 0.05)外，其余各组不同时段各炎症因子检测值均以造模后1d最高，造模后4周回降，差异有显著性意义(P < 0.05)。除造模前外，手术对照组的大鼠血清各炎症因子检测值高于其他4组，差异有显著性意义(P < 0.05)；假手术组的大鼠血清各炎症因子检测值低于其他4组，差异有显著性意义(P < 0.05)；促红细胞生成素+SB203580组的大鼠血清各炎症因子检测值低于其他两药物干预组，差异有显著性意义(P < 0.05)；促红细胞生成素组与SB203580组的大鼠血清各炎症因子检测值差异无显著性意义 (P > 0.05)。

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引言

心血管疾病对健康的严重危害，加之治疗困难和医疗费用昂贵，给个人、家庭和社会带来沉重的经济负担和精神负担。所以积极防治心血管疾病，是国内卫生工作和保护人民健康任务的重中之重。急性心肌梗死后心脏重构日益成为人们研究的热点，多项研究显示，炎症细胞因子(白细胞介素1β、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α)影响心肌梗死后的不良预后，在心衰的发病和进展中也扮演了重要的角色，它们引起心肌细胞肥大、促进凋亡和纤维化，在心脏重构的进程中起了重要作用^[1-11]。因此，若是能够有效抑制心肌梗死后炎性细胞因子的表达，将改善心肌梗死的预后。

随着近几年基础研究的不断进展，发现促红细胞生成素受体也广泛分布于人类多种组织器官包括肝脏、大脑、子宫、血管内皮细胞、平滑肌细胞、心肌细胞等^[12-13]。促红细胞生成素被认为是一种细胞保护因子，尤其对神经细胞和心肌细胞的保护成为其保护作用的研究热点^[14-15]。同时促红细胞生成素的促红细胞生成之外的非造血效应也被广泛证实：促红细胞生成素与其受体结合后可激活多种细胞信号转导通路从而起到促进血管新生、抑制细胞凋亡、抗炎症反应及抗氧化应激等的作用^[16-20]。

促红细胞生成素通过抑制心肌梗死后炎症因子生成，能够有效抑制心肌梗死后心脏重构的发生。目前有大量的研究表明，抑制p38 MAPK可以明显的降低长期心肌缺血时心肌梗死和死亡的发生，这个作用是通过抑制肿瘤坏死因子а、白细胞介素1和白细胞介素8等炎症细胞因子的产生来减轻缺血对心肌的损伤^[21]。作者前期的研究发现促红细胞生成素能明显抑制体外培养的心肌成纤维细胞在血管紧张素Ⅱ诱导下转化生长因子β1的合成^[22]。结合起来，不难推测促红细胞生成素可能通过抑制转化生长因子β1-TAK1-p38 MAPK信号通路抑制炎症因子的表达，从而对炎症介导的心脏重构具有重要的延缓作用。

实验旨在通过大鼠在体心脏模拟临床急性心肌梗死病理生理变化，使用重组人促红细胞生成素干预各处理组，通过酶联免疫吸附法检测的方法观察炎症细胞因子白细胞介素1β、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α的变化，并初步探讨其作用机制。

材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：于2011年6月至2012年1月在云南省畜牧兽医科学院完成。

材料：

实验动物：成年雄性SD大鼠40只，体质量250- 300 g，由昆明医科大学实验动物中心提供，许可证号：SCXKC滇2011-0004。

实验过程中对动物的处置符合2009年《Ethical issues in animal experimentation》相关动物伦理学标准的条例。

促红细胞生成素抑制急性心肌梗死大鼠炎症因子表达实验的主要试剂及仪器：

方法：

急性心肌梗死动物模型制备：参照Olivetti等^[23]的手术方式，结扎冠状动脉左前降支制作急性心肌梗死模型。禁食禁饮8 h，备皮后给于3%戊巴比妥钠30 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠。固定于操作台，接心电图机及多导电生理记录仪经口气管插管后接小动物呼吸机，机械辅助通气，频率72次/min，潮气量36 mL/kg，呼吸比1∶1。胸部备皮，消毒，沿胸骨左缘0.5 cm切开皮肤，分离皮下组织，剪断肋骨，打开胸腔，暴露心脏；剪开心包，暴露动脉圆锥与左心耳根部间的左冠状静脉，以其作为标志，找到左前降支，在距其起始部3-5 mm处用6-0带线缝合针穿过少许心肌及血管并永久结扎，立即见心尖发白，心电图显示ST段抬高，提示造模成功，并负压关闭胸腔，逐层缝合肌肉皮肤，分笼饲养。

实验动物分组及给药：40只实验SD大鼠适应性喂养3 d后，按随机数字表法分为5组，每组8只，造模后1 h及以后每周2次皮下注射各处理药物，共4周，详细药物处理分组如下：①假手术组：仅开胸，穿线不结扎，皮下注射 0.5 mL生理盐水。②手术对照组：建立急性心肌梗死模型，皮下注射0.5 mL 生理盐水。③SB203580组：建立急性心肌梗死模型，皮下注射 0.02 mg/kg p38 MAPK的高选择性阻断剂SB203580(SB203580溶于0.5 mL二甲基亚砜)。④促红细胞生成素组：建立急性心肌梗死模型，皮下注射促红细胞生成素注射液(3 000 U/kg溶于0.5 mL生理盐水)。⑤促红细胞生成素+SB203580组：建立急性心肌梗死模型，皮下注射混合液(0.02 mg/kg SB203580溶于0.5 mL二甲基亚砜+促红细胞生成素 3 000 U/kg溶于0.5 mL生理盐水)。

收集标本：5组大鼠分别在造模前、造模后1 d、1周、2周、4周，尾静脉采血0.5 mL血及时离心收集血清于 -70 ℃保存。

酶联免疫吸附法检测炎症细胞因子白细胞介素1β、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α表达的变化：充分混匀各监测试剂；标准孔分别加入相应稀释浓度的标准品，各组各时段血清标本使用标本稀释液1∶1稀释后加入反应孔(标记清楚)，分别向各孔加入生物素标记的抗体，震荡后37 ℃孵育1 h；洗版；每孔加入亲和链酶素-HRP，混匀后37 ℃孵育30 min；洗版；每孔加入等量底物A、B液，振荡混匀，37 ℃温育10 min；加入终止液后于波长450 nm的酶标仪上读取各孔的吸光度(A)值；根据A值及标准品浓度得到标准曲线，代入标准曲线计算得到各炎症因子的样品浓度。

主要观察指标：在大鼠造模前、造模后1 d、1周、2周、4周检测血清白细胞介素1β、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α表达变化。

统计学分析：统计学处理者为陈晓光。所有数据均以x(_)±s表示，统计方法采用方差分析，组间比较采用LSD法，所有统计计算由SPSS 13.0软件完成，P < 0.05表示差异有显著性意义。

讨论

急性心肌梗死后神经内分泌异常激活，不仅引起水、钠潴留和收缩外周血管引起心脏负荷增加，而且对心肌细胞有直接的毒性作用引起心肌细胞肥大、凋亡，胚胎基因和蛋白的再表达，刺激心肌间质纤维化引起细胞外基质的变化引起心脏重脏构，进一步改变心脏结构及恶化心功能，又进一步激活神经内分泌因子形成恶性循环促进疾病的进展最后导致心力衰竭，研究表明炎症因子在其中扮演重要角色^[24-25]。故可推测抑制急性心肌梗死后炎症因子表达，是改善或逆转心脏重构、保护心功能的重要环节。

促红细胞生成素是一种能刺激骨髓造血的唾液糖蛋白类激素，主要由肾皮质和髓质交界处的球旁细胞合成。1985年人们利用基因重组技术成功合成重组人促红细胞生成素，用于治疗各种类型的贫血。促红细胞生成素受体也被证实在人体内的非造血组织有广泛的表达，包括肝脏、大脑、子宫、血管内皮细胞、平滑肌细胞、心肌细胞等。促红细胞生成素可通过与靶细胞膜表面的促红细胞生成素受体结合而减少炎症反应，从而减少心肌缺血后的再灌注损伤^[26]。在神经元中，促红细胞生成素可抑制炎症细胞因子和活性氧族从而发挥抗炎症和抗氧化剂的作用^[27-29]。Villa等^[30]报道促红细胞生成素能显著减少脑梗死区内的致炎因子，γ-干扰素、肿瘤坏死因子α、白细胞介素6等的释放，减轻炎性细胞如星形细胞及小胶质细胞的浸润。在大鼠缺血再灌模型中，心肌缺血再灌注前24 h快速滴注重组人促红细胞生成素可以显著减少中性粒细胞浸润, 减弱由于缺血再灌注引起的核因子κB和转录因子活化蛋白1的活性,并减少肿瘤坏死因子α、白细胞介素6及细胞间黏附分子1的产生，进而降低炎性反应，其机制可能与促红细胞生成素诱导的核因子κB激活后的负反馈有关^[31-32]。Liu等^[33]研究发现在心衰大鼠促红细胞生成素干预组具有减少炎症细胞因子的释放和抗氧化损伤的作用，可以显著减少氧化的DNA损伤标志物8-OhdG，减少炎症因子白细胞介素1、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α和转化生长因子β1的表达。作者的实验结果也显示，结扎大鼠前降支制作急性心肌梗死模型后，重组人促红细胞生成素干预能够抑制炎症因子白细胞介素1、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α的表达。结果与国内外研究结果一致。但目前对于促红细胞生成素抑制炎症反应的信号转导机制尚不十分明确。Liu等^[33]的实验中也发现心衰大鼠促红细胞生成素受体表达上调，同时在促红细胞生成素干预组促红细胞生成素受体的下游靶信号Stat3，Stat5，Akt显著激活，在体外实验中发现应用银胶菊内酯抑制Jak/Stat信号通路后可以完全阻断成纤维细胞促红细胞生成素介导的减少炎症细胞因子的产生，可以推测促红细胞生成素通过Jak/Stat信号通路抗炎症反应。

实验通过结扎大鼠前降支制作急性心肌梗死模型后，使用重组人促红细胞生成素干预各处理组大鼠，结果表明，重组人促红细胞生成素能够抑制炎症因子白细胞介素1、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α的表达，结果与国内外研究结果一致。提示促红细胞生成素联用p38 MAPK特异性抑制剂SB203580组抑制炎症因子的作用强于单用促红细胞生成素或SB203580组，而单用促红细胞生成素或SB203580组抑制炎症因子的差异无显著性意义，故促红细胞生成素抑制炎症因子表达作用至少部分地通过p38 MAPK所介导。作者前期的研究发现，促红细胞生成素能明显抑制体外培养的心肌成纤维细胞在血管紧张素Ⅱ诱导下转化生长因子β1的合成^[34]。转化生长因子β1的受体有Ⅰ型和Ⅱ型受体2种，为丝氨酸-色氨酸激酶受体。转化生长因子β1通过其受体的活化转化生长因子β激活的激酶(TAK1)，后者为促分裂原活化蛋白激酶激酶激酶(MAPKKK)超家族成员。TAK1被激活后，激活MKK3/6(MAPKK)和p38 MAPK。目前有大量的研究表明，抑制p38 MAPK可以明显的降低长期心肌缺血时心肌梗死和死亡的发生，这个作用是通过抑制肿瘤坏死因子а、白细胞介素1和白细胞介素8等炎症细胞因子的产生来减轻缺血对心肌的损伤^[35]。这次实验也证实了p38 MAPK抑制剂能抑制炎症因子的表达，与国内外研究相符。结合起来，不难推测促红细胞生成素可能通过抑制转化生长因子β1-TAK1-p38 MAPK信号通路抑制炎症因子的表达，对心脏重构具有重要的延缓作用。

促红细胞生成素抑制急性梗死心肌炎症因子的表达

Erythropoietin suppresses myocardial inflammatory cytokine expression in acute myocardial infarction rats

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