免疫学家Janeway提出的模式识别理论理论将天然免疫所针对的主要靶分子信号称作病原相关的分子模式(pathogen-associated molecular pattern,PAMP);相对应的识别受体称为模式识别受体
[6]。PAMP主要是指广泛存在于病原体细胞表面的分子标志,为病原微生物所特有,而宿主细胞不产生,因此它是宿主天然免疫细胞泛特异性识别的分子基础。模式识别受体可对PAMP进行特异性识别,引发的信号传导能导致炎症递质的释放,在天然免疫防御中起重要作用
[11]。TLRs对PAMP进行特异性识别后激活不同的下游信号转导链,导致炎症递质的释放,在天然免疫防御中起重要作用,并最终激活获得性免疫系统。因此有人认为TLRs控制着由天然免疫向获得性免疫的转变。每个TLRs相关的信号通路不是完全相同的,这导致了各自不同生物学功能的发挥。不同TLRs还可以在一定程度上特异性地识别并区分不同类型的病原体。TLR4和TLR9是所有TLRs家族亚类的代表性受体,TLR4存在于细胞表面,而TLR9则主要位于细胞内器,即内质网内,但文献显示一样通过表面标记和破膜的方法进行其表达分析
[9]。最近大量研究表明,在病原体的入侵及天然免疫经TLRs受体激活而进一步诱发的炎性反应中,TLR4起到了主导作用,而在细菌由于革兰阴性菌和革兰阳性菌其细胞壁表面的TLRs识别配体不同,其相应的TLRs也不同,在革兰阴性菌中,其LPS受体为TLR4其主要激活途径已经被证实。本实验主要探讨假体置入后TLR4,9在外周血白细胞中的蛋白表达差异情况及其在人工关节置换后感染诊断中的可能作用。
有文献报道,感染、类风湿性关节炎、风湿性心脏病、免疫相关性肾炎、心肌梗死、多发性骨髓瘤等疾病可能影响人白细胞对TLRs表达[12],本实验已经在入选标准中有所体现,同时结果发现两组患者的白细胞介素、血细胞沉积率、C-反应蛋白等指标均在正常范围内,手术前后变化均不明显,这表明两组患者均可排除感染、风湿、类风湿等的状况,已排除这些情况对TLRs的表达的影响。
流式细胞术结果发现TLR4和TLR9蛋白均主要表达于外周血单核细胞,而在外周血淋巴细胞和中性粒细胞的表达率较低;这与文献所述一致。TLR4、TLR9在实验组和对照组患者术后外周血单核细胞阳性表达率稍低于术前,但差异均无显著性意义;对两组手术前后改变进行ANOVA方差分析结果提示,在无临床感染证据的情况下,手术本身的应激、局部损伤和假体的置入均不明显影响患者在两个时间点的TLR4和TLR9的表达水平,但假体的置入导致了患者外周血单核细胞对TLR9的表达发生了一个较大的波动变化,这一波动表现为关节置换组患者的手术前后TLR9表达水平下降幅度大于关节镜组患者。这一变化可以通过2002年Matzinger[13]提出免疫识别的“危险模式”理论进行解释。
“危险模式”理论认为免疫系统只是识别“危险信号”而不是“非己信号”。危险信号既可由非己的病原体产生(如脂多糖、肤聚糖等),也可由机体自身产生。危险信号由其受体(如TLR)识别,从而引起针对异体或自体抗原的免疫反应。关节腔内的滑膜细胞在人工关节置换后发生感染前是以正常细胞的形式生长,不会发出危险信号以活化活化蛋白C。所以对免疫系统而言,关节周围的滑膜组织无法表现出危险性,真正表现出危险性的应该是置入假体或感染后生成的生物被膜。机体免疫力正常时,多数浮游菌被杀死,少数残存细菌黏附到材料表面之后调整基因表达,在生长繁殖的同时分泌大量胞外黏质物,将多个细菌粘连到一起形成生物被膜。细菌多以休眠状态藏匿于生物被膜中,当有特定触发因素时即从休眠或静止状态转变为致病菌,感染反复发作,迁延难愈[14]。因此,假体的置入导致了机体比正常情况下更易于感染,表现在TLRs上,是其表达比正常情况要少,从而其天然免疫和获得性免疫能力下降。
ISSN 1673-8225 CN 21-1539/R CODEN: ZLKHAH
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关节置换后感染的形成机制目前尚不清楚,但是假体的置入导致局部免疫抑制是植入物发生感染的重要原因之一。假体的存在下调了机体对TLRs的表达,减弱了机体的固有免疫系统,机体更易于感染。缺乏生物相容性的假体在置入体内后被视为异物,激活免疫系统。研究表明,置入假体周围组织会聚集白细胞、淋巴细胞和吞噬细胞等,发生不同程度的炎症反应
[15]。细胞免疫反应的刺激导致超氧化离子和细胞因子介导的组织损伤,同时也启动细胞因子的级联反应,最终在假体周围形成一个不与正常组织相容的、自我永久化的、免疫功能缺陷的纤维炎症区。该区以炎症细胞的反复浸润、活性氧中间产物的生成、巨噬细胞的耗竭及相邻组织的损伤为特点,是导致植入物感染的重要原因
[16]。可以理解为,假体置入后如果患者的TLRs大幅下降,说明有可能生成了这样一个纤维炎症区,该患者就成为了假体感染的高危人群。
人工关节置换后感染是关节置换后的一种灾难性并发症。传统的细菌培养仍然是诊断人工关节感染的金标准,但是细菌种类、数量和培养方法往往会影响培养的成功率,得到假阴性结果,若经验性的抗生素治疗又无效时,治疗将变得十分棘手。如何准确及时诊断人工关节后感染,制定正确的治疗方案,是摆在每位关节外科医生面前的巨大挑战。本实验从临床水平发现TLR9在假体置入后表达波动较大,为临床上早期诊断和通过免疫疗法治疗假体感染提供了初步的理论依据,即通过检测TLRs的阳性表达率,从而早期诊断感染,以及增强TLRs介导的固有免疫反应在假体感染的保守治疗中可能具有重要意义。
本实验的不足之处主要是样本例数少,未能收集感染患者病例检测TLRs的表达,也未能从分子水平上检测患者的TLRs表达。下一步的研究应有目的地积累关节置换后感染患者的标本,从大宗病例数的TLRs在外周血的阳性表达率着手分析,以制定出可达到高敏感性和特异性的诊断假体感染的TLRs的阳性表达率标准,从而有助于从一个崭新的角度解释假体感染的发病机制并为诊治提供更全面的理论依据。