近年来,应用组织工程学的方法修复关节软骨缺损展示了令人鼓舞的前景。间充质干细胞已成为组织工程软骨构建过程中最常用的种子细胞
[4]。其中BMSCs取材方便、创伤小且易于从骨髓中分离纯化和体外扩增,不像滑膜、脂肪等来源的间充质干细胞那样原代培养时需要酶消化预处理,且在三维高密度培养时,只有BMSCs的软骨分化潜能得到明显提高。因此,BMSCs被认为是用于软骨组织工程学研究最为理想的种子细胞
[5-6]。
BMSCs的分离培养是定向分化实验研究的基础。目前用于分离BMSCs的方法主要有贴壁筛选法、密度梯度离心法和流式细胞仪分离法[7]。实验通过全骨髓培养+贴壁筛选法分离BMSCs,这样,分离培养中出现的杂质血细胞在两三周内随换液被除去。霍建忠等[8]发现BMSCs原代和第1,2代细胞性状不纯,可能混杂有其他类细胞,而第6代以后BMSCs的成软骨能力降低,因此最适宜的软骨组织工程种子细胞应为第3~5代BMSCs。因此,实验采用生长状态良好的第4代细胞进行实验。另有学者采用微团培养方式来重现胚胎发育过程中的软骨前体状态,但近来实验发现在微团培养时由于通透性降低,细胞团块中心营养供应障碍,细胞增殖反而受限,因此不能满足较大软骨组织的构建[9]。与之相比,本实验采用单层培养模式则不存在上述问题,诱导后的细胞增殖能力较强,能够获得较大数量的软骨细胞,满足大量构建软骨组织工程的需要。
诸多实验表明,许多细胞因子对体外培养的BMSCs有着强大的诱导分化能力,其中尤以转化生长因子超家族成员效能最强。转化生长因子β是一族多肽类生长因子,胚胎形成期诱导原始的BMSCs分化形成软骨组织[10]。转化生长因子β异构体β2和β3比β1可更加快速有效地促进BMSCs向软骨方向分化[11]。实验以转化生长因子β3诱导组作为阳性对照,诱导后细胞甲苯胺蓝染色阳性,着色深且均匀,Ⅱ型胶原免疫组化染色21 d时较7 d时明显加深,RT-PCR结果表明Ⅱ型胶原mRNA高表达,由此显示了其对BMSCs良好的诱导分化能力。
然而,BMSCs经体外诱导分化构建的软骨细胞移植物一旦脱离严格控制的体外培养环境进入关节腔内,能否适应关节腔内的理化成分,国内外仍无文献报道,尚需进一步研究。
关节内透明质酸主要由软骨细胞和滑膜B细胞分泌,是关节滑液和软骨基质的重要成分[12]。具有较强的亲水性和高度黏弹性,此特性随透明质酸分子量及浓度的不同而变化[13]。透明质酸、体液、纤维连接素、Ⅰ型胶原等基质成分构成了胚胎时期BMSCs最初的细胞外环境。以往学者们对透明质酸的研究主要集中于支架材料的构建上[14]。Johnstone等[15]联合应用透明质酸和明胶制作了一种坚固而有高孔率的基质材料,可以观察到BMSCs在其内的软骨细胞分化。而游离的透明质酸本身对BMSCs存在什么样的影响却仍鲜为人知。
实验应用外源性透明质酸模拟关节腔内的理化环境,对分离培养的兔BMSCs进行诱导分化,诱导培养7,14,21 d后,取标本进行甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组化染色及RT-PCR,结果证实诱导后的BMSCs分泌软骨细胞特征性的细胞外基质:Ⅱ型胶原和蛋白聚糖,提示BMSCs已分化为软骨细胞,且实验组中Ⅱ型胶原含量远高于阴性对照组。阴性对照组也出现极少量阳性细胞,可能与血清中未知生长因子作用以及较高细胞密度接种利于BMSCs向软骨细胞方向分化有关。
结果显示,游离的透明质酸本身也可以诱导BMSCs向成软骨方向分化,且21 d时软骨细胞的特异性基质Ⅱ型胶原较7 d时表达明显提高,但在3个时间点,外源性透明质酸的诱导分化能力均不如转化生长因子β3强。但透明质酸的特性是随透明质酸分子量及浓度的不同而变化的。Maleski等
[16]的实验也曾一度认为透明质酸对软骨的形成是与其相对分子量和浓度相关,因此,不同浓度、不同分子量的透明质酸对体外培养的BMSCs有何影响仍需进一步研究。