微量营养素与骨坏死的因果关系：来自双向孟德尔随机试验的证据

doi:10.12307/2024.686

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (33): 5308-5314.doi: 10.12307/2024.686

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微量营养素与骨坏死的因果关系：来自双向孟德尔随机试验的证据

李威1，柴金莲2，贾海峰3，李翰政3，孙铁锋4，梁学振3

山东中医药大学，1中医学院，2药学院，3第一临床医学院，山东省济南市 250355；4山东省中医药研究院，山东省济南市 250014

收稿日期:2023-10-17 接受日期:2023-11-25 出版日期:2024-11-28 发布日期:2024-01-30
通讯作者: 梁学振，博士，副教授，硕士生导师，山东中医药大学第一临床医学院，山东省济南市 250355
作者简介:李威，男，2001年生，山东省菏泽市人，汉族，本科在读，主要从事中医学专业的研究。
基金资助:
国家自然科学基金资助项目(82205154)，项目负责人：梁学振；山东省自然科学基金青年项目(ZR2021QH004)，项目负责人：梁学振；山东省医药卫生科技发展计划项目(2019WS577)，项目负责人：梁学振；山东省中医药科技项目(2020Q009)，项目负责人：梁学振；济南市临床医学科技创新计划(202019056)，项目负责人：梁学振

Causal association of micronutrients with osteonecrosis: evidence from a bidirectional Mendelian randomization trial

Li Wei1, Chai Jinlian2, Jia Haifeng3, Li Hanzheng3, Sun Tiefeng4, Liang Xuezhen3

1College of Traditional Chinese Medicine, 2College of Pharmacy, 3First College of Clinical Medicine, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, Shandong Province, China; 4Shandong Provincial Research Institute of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250014, Shandong Province, China

Received:2023-10-17 Accepted:2023-11-25 Online:2024-11-28 Published:2024-01-30
Contact: Liang Xuezhen, MD, Associate professor, Master’s supervisor, First College of Clinical Medicine, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, Shandong Province, China
About author:Li Wei, College of Traditional Chinese Medicine, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, Shandong Province, China
Supported by:
National Natural Science Foundation of China, No. 82205154 (to LXZ); Youth Project of Natural Science Foundation of Shandong Province, No. ZR2021QH004 (to LXZ); Shandong Medical and Health Science and Technology Development Plan Project, No. 2019WS577 (to LXZ); Chinese Medicine Science and Technology Project of Shandong Province, No. 2020Q009 (to LXZ); Jinan Clinical Medical Science and Technology Innovation Plan, No. 202019056 (to LXZ)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

孟德尔随机化：是流行病学研究中评估病因推断的数据分析技巧，它是利用与暴露因素具有强相关的遗传变异作为工具变量，来评估暴露因素与结局之间的因果关系。孟德尔随机化三大假设：①关联性假设：SNP与暴露因素之间是强相关的；②独立性假设：SNP与混杂因素之间是独立的；③排他性假设：SNP只能通过暴露因素对结局产生作用。
骨坏死：是由于血供受损导致的骨的区域性死亡。骨坏死最常由损伤引起，但也可能在没有损伤的情况下发生，典型症状包括疼痛、受累关节活动受限，当下肢受累时可出现跛行，可根据症状、患者的骨坏死风险、X 射线片检查结果和磁共振成像检查结果做出诊断。

背景：骨坏死是临床常见的难治性疾病，有观察性研究表明微量营养元素可能对骨坏死的预后存在一定的促进作用，然而微量营养元素与骨坏死具体的因果关联尚未可知。

目的：利用大规模人群全基因组关联研究(GWAS)的汇总数据，通过孟德尔随机化的方法探究微量营养元素与骨坏死之间的因果关联，为临床诊疗提供帮助。
方法：从IEU OpenGWAS 数据库、GWAS catalog数据库、FinnGen 数据库提取需要的暴露和结局数据(钙、镁、铁、维生素E、胡萝卜素、视黄醇与骨坏死)。对数据进行双向孟德尔随机化分析，以逆方差加权法(inverse-variance weighted)为主要的研究方法，加权中位数法(weighted median)、简单模式法(simple mode)、加权模式方法(weighted mode)和 MR-Egger 回归对结果进行补充；然后通过敏感性分析验证数据的可靠性。

结果与结论：①结果发现，血清铁浓度与骨坏死存在正相关关系，而其他微量营养元素未发现相关，且所有数据都不存在反向因果关系；②敏感性分析结果表明因果关系稳健；③通过孟德尔随机化方法，此次研究提供了血清铁浓度和骨坏死之间存在因果关系的证据；了解微量营养元素与骨坏死的因果关系，有助于临床上对骨坏死的诊疗，具有重要的临床意义。

https://orcid.org/0009-0001-2139-0840 (李威)；https://orcid.org/0000-0001-5649-4212 (梁学振)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：人工关节；骨植入物；脊柱；骨折；内固定；数字化骨科；组织工程

关键词: 骨坏死, 微量营养元素, 孟德尔随机化, 因果关系, 反向因果关系, 全基因组关联研究, 铁死亡, 工具变量

Abstract: BACKGROUND: Osteonecrosis is a common refractory disease in clinical practice, and observational studies have suggested that micronutrients may have a prognostic role in osteonecrosis. However, the specific causal association between micronutrients and osteonecrosis is not known.
OBJECTIVE: To explore the causal association between micronutrients and osteonecrosis by Mendelian randomization using summary data from a large population-based genome-wide association study (GWAS) for clinical diagnosis and treatment.
METHODS: The required exposure and outcome data (calcium, magnesium, iron, vitamin E, carotenoids, retinol & osteonecrosis) were extracted from the IEU OpenGWAS database, GWAS catalog database, and FinnGen database. Data were analyzed by bidirectional Mendelian randomization with inverse-variance weighted as the primary study method, and weighted median method, simple mode method, weighted mode method, and MR-Egger regression to complement the results. The reliability of the data was then verified through sensitivity analyses.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The results found a positive correlation between serum iron concentration and osteonecrosis, while no correlation was found for other micronutrients. There was no reverse causality in all the data. (2) The results of sensitivity analysis showed a robust causality. (3) By Mendelian randomization method, this study provided evidence of causality between serum iron concentration and osteonecrosis, and understanding the causality of micronutrient elements on osteonecrosis can help in the clinical diagnosis and treatment of osteonecrosis, which is of great clinical significance.

Key words: osteonecrosis, micronutrients, Mendelian randomization, causality, reverse causality, genome-wide association study, ferroptosis, instrumental variable

中图分类号:

李威, 柴金莲, 贾海峰, 李翰政, 孙铁锋, 梁学振. 微量营养素与骨坏死的因果关系：来自双向孟德尔随机试验的证据[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(33): 5308-5314.

Li Wei, Chai Jinlian, Jia Haifeng, Li Hanzheng, Sun Tiefeng, Liang Xuezhen. Causal association of micronutrients with osteonecrosis: evidence from a bidirectional Mendelian randomization trial[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(33): 5308-5314.

图/表（结果） 6

2.1 工具变量首先在探究微量营养素对骨坏死的因果关系时，根据工具变量筛选原则，提取与钙、镁、磷、铁、维生素D、维生素E、胡萝卜素和视黄醇强相关SNP在结局中的信息时分别丢失了3，0，5，0，3，2，0，1个SNP。剔除回文序列后最终得到了34，23，227，19，153，28，28，21个工具变量，其中利用PhenoScanner数据库检索有关的表型，剔除其对应表型与骨坏死具有相关意义的2个SNP(rs1800562，rs116337889)。在探究骨坏死对微量营养素的因果关系时，提取与骨坏死强相关SNP在钙、镁、磷、铁、维生素D、维生素E、胡萝卜素和视黄醇中的信息时分别丢失了9，9，17，9，17，1，1，1个SNP。剔除回文序列后，最终结局为钙、镁、铁、维生素E、胡萝卜素和视黄醇时分别获取了10，10，10，14，14，14个工具变量，磷和维生素D在剔除回文序列后没有足够的SNP进行后续的MR分析。所有SNP均符合工具变量筛选标准。
2.2 微量营养素对骨坏死疾病的影响逆方差加权法分析结果显示，基因预测的钙与骨坏死(OR=0.939，95%CI：0.53-1.664，P=0.828)、镁与骨坏死(OR=1.029，95%CI：0.744-1.422，P=0.864)、磷与骨坏死(OR=0.960，95%CI：0.730-1.263，P=0.772)、维生素D与骨坏死(OR=0.894，95%CI：0.638-1.251，P=0.512)、维生素E与骨坏死(OR=1.005，95%CI：0.575-1.760，P=0.984)、胡萝卜素与骨坏死(OR=1.151，95%CI：0.658-2.011，P=0.622)、视黄醇与骨坏死(OR=0.846，95%CI：0.432-1.656，P=0.626)之间无统计学意义，所以不存在因果关系。而基因预测的铁与骨坏死(OR=1.377，95%CI：1.032-1.837，P=0.030)表明血清铁浓度是骨坏死的危险因素且具有统计学意义，同时应用其他4种分析方法来确认结果的稳健性，其中，该4种方法的分析结果虽无统计学意义，但和逆方差加权法方法分析的方向一致(OR值均> 1)，见图2，3。

2.3 敏感性分析异质性检验结果表明，钙浓度对骨坏死的工具变量存在异质性(P=0.002)，所以采用了逆方差加权法随机效应模型，其他微量营养素均不存在异质性(P > 0.05)。水平多效性检验显示都不存在水平多效性(表2)。MR-Egger分析也未检测到工具变量中存在定向多效性(P > 0.05)，证明因果关系稳健。留一法、漏斗图都表明数据可靠。

.4 骨坏死疾病对微量营养素的影响逆方差加权法分析结果显示，基因预测的骨坏死与钙(OR=0.991，95%CI：0.979-1.003，P=0.153)、骨坏死与镁(OR=1.017，95%CI：0.994-1.040，P=0.144)、骨坏死与铁(OR=1.016，95%CI：0.981-1.052，P=0.387)、骨坏死与维生素E(OR=1.008，95%CI：0.991-1.024，P=0.360)、骨坏死与胡萝卜素(OR=1.003，95%CI：0.991-1.016，P=0.605)、骨坏死与视黄醇(OR=0.999，95%CI：0.987-1.012，P=0.880)之间无统计学意义，所以不存在反向因果关系，见图4，5。

2.5 敏感性分析异质性检验结果表明，骨坏死对维生素E的工具变量存在异质性(P=0.044)，所以采用了逆方差加权法随机效应模型，其他微量营养素均不存在异质性(P > 0.05)。水平多效性检验显示都不存在水平多效性(表3)。MR-Egger分析也未检测到工具变量中存在定向多效性(P > 0.05)，证明因果关系稳健。留一法结果表明不存在某一个SNP对整个数据产生巨大的影响，漏斗图对称性良好，说明结果稳定可靠。

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引言

骨坏死是一种由于各种原因破坏骨组织正常血液供应的疾病，骨组织死亡导致支撑骨结构塌陷，引起关节疼痛、骨质破坏和功能丧失[1-3]，目前它已成为骨科临床上常见的难治性疾病[4]，其病因包括创伤、使用皮质类固醇[5]、血红蛋白病(镰状细胞性贫血)[6]、脂肪栓塞[7]、酗酒和系统性红斑狼疮等[8-9]。X射线和骨扫描可用于诊断有临床症状的骨坏死[10-11]，尽管磁共振成像是检测早期骨坏死最敏感的诊断方法[12]，但检测早期无症状的骨坏死仍是一项挑战[13]。有证据表明，骨坏死与多种致病途径有关，包括血管内凝血[14]、机械应力[15]、皮质类固醇的使用及原发性细胞死亡[5，16]。骨坏死可发生于任何年龄和性别，但大多数患者年龄在30-59岁之间[17]，如果治疗不及时还可能导致终身残疾[18]。目前还没有足够多的长期随访病例进行保守治疗的报道，也没有证据充分的文章，如系统综述或随机对照试验。因此，当务之急是积极探索骨坏死的病因和发病机制，以促进治疗策略的制定。
微量营养元素是人体内不可或缺的物质，它常常参与人体各种生理功能[19]。至今为止，微量营养元素对骨骼健康的研究正在持续增多，其对骨坏死的影响也逐渐被人们所重视。DE BASTIANI等[20]通过随访接受了饮食矫正和药物治疗方案的单侧特发性股骨头坏死患者，发现这些患者预后更好。除此之外，也有一些研究表明微量营养元素与骨骼的健康有着密切的联系[21-25]。张琳等[25]在激素性股骨头坏死模型大鼠中发现股骨钙、磷、镁、锌元素含量有所变化。除此之外，维生素A、维生素D、维生素K2也均有研究证明和骨骼的健康存在关联[24，26-27]。但是以上大部分是观察性研究或者是针对骨骼的研究，并没有直接研究各种微量营养元素与骨坏死的因果关联。因为研究微量营养元素对骨坏死影响的相关文献太少，所以迫切需要一些研究性文章来探索微量营养元素与骨坏死之间是否存在某些因果关系，为探索骨坏死发病的机制与诊疗提供帮助。
作者采用孟德尔随机化(Mendelian randomization，MR)的方法来研究微量营养元素与骨坏死之间的因果关系。MR是一种检验暴露与结果之间因果关系的统计技术[28-29]，为了评估工具变量与结果之间的关系，它使用与支持3个假设的暴露成分相关的工具变量作为暴露的替代变量[30]。如今常用的观察性研究易受混杂因素的影响，混杂因素指的是除了研究因素以外，其他所有可能会影响结局的因素(包括已知和未知的)，它的存在，无法保证研究结果的真实性与可靠性，无法探究暴露和结局之间直接的因果关联。与观察性研究不同的是，MR因其基于基因水平而不受混杂因素的影响。因此，此次研究采用了双向双样本MR分析方法来探索微量营养素(包括钙、镁、磷、铁、维生素D、维生素E、胡萝卜素和视黄醇)与骨坏死之间的双向因果关系，通过基因层面的分析揭示骨坏死发生和进展的机制，为加强防治措施提供新的依据。中国组织工程研究杂志出版内容重点：人工关节；骨植入物；脊柱；骨折；内固定；数字化骨科；组织工程

材料方法

1.1 设计此次研究遵循了新制定的用于报告MR研究的STROBE-MR声明[31]。采用双向双样本MR法进行研究循环微量营养素浓度对骨坏死的潜在因果效应并进行反向MR研究探究是否存在反向因果关系。MR基于3个关键假设：①工具变量与暴露因素密切相关；②工具变量不应受到已知或未知混杂因素的影响；③工具变量只通过暴露因素影响结局因素[32]。此次研究使用的是公开数据，因此无需获得伦理批准和知情同意。此次研究设计如图1所示。

1.2 时间及地点实验于2023年9-10月在山东中医药大学、山东中医药大学附属医院完成。
1.3 资料研究中使用的汇总数据均来自于已经发表的研究或公开的全基因组关联研究(Genome-Wide Association Studies，GWAS)摘要数据。

1.3.1 微量营养素数据获取通过搜索PubMed[https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed(2023年9月24日访问)]和中国知网[https://www.cnki.net/(2023年9月24日访问)]，查找已发表的与骨病有关的微量营养素的观察性研究或荟萃分析。初步目录包括15种微量营养素：钙、镁、锌、磷、铁、铜、锰、氟、硼、维生素A、维生素E、维生素D、维生素K2、视黄醇、胡萝卜素。进一步搜索了GWAS目录[https://www.ebi.ac.uk/gwas(访问日期：2023年9月24日)]和PubMed，查找欧洲人群中已发表的有关循环微量营养素浓度的全基因组关联研究。随后，锌、铜、锰、氟、硼、维生素A和维生素K2被排除在外，因为GWAS没有显著结果或缺乏相关研究。最后，此次研究纳入了8项包括钙、镁、磷、铁、维生素D、维生素E、胡萝卜素和视黄醇与微量营养素有关的GWAS数据(表1)。

1.3.2 骨坏死数据获取骨坏死数据的获取，权衡了样本量、发表年限、单核苷酸多态性[single nucleotide polymorphism，SNP)数量、种族，最后选取了芬兰数据库(https://www.finngen.fi/en(2023年9月24日访问)]中的骨坏死数据。该数据集包含1 385例病例与358 014名对照，共359 399名欧洲受试者(表1)。

1.4 方法
1.4.1 工具变量为了筛选出符合图1中3个MR核心假设的合格工具变量，采用了一系列质量控制方法。选择与暴露因素密切相关的全基因组显著性阈值为P < 5×10-8的SNP。遗憾的是，当按照P < 5×10-8选择数据集时，只有少数SNP被选为工具因子。所以采用了第2个阈值，即选择全基因组显著性阈值P < 1×10-5的SNP，并将其选为工具变量，以寻找暴露与结局之间更多的潜在因果关系[33-34]。然后，筛选并剔除了与混杂因素和结果相关且R2 > 0.001的SNP，以避免10 000 kB范围内的连锁不平衡，在PhenScannerV2数据库(http://www.phenoscanner.medschl.cam.ac.uk/，2023年9月26日访问)中分析了与所选SNP相关的潜在混杂因素，为了满足孟德尔随机化排它性假设，重点排除了其相应表型与结果具有相关意义或可能引起结果发生改变的SNP。此外，F统计量等于[(n-k-1)/k)×R2/(1-R2)]，其中R2代表遗传工具解释的暴露方差，K代表遗传变异的数量，N代表样本量。R2计算如下2×β2×EAF×(1-EAF)/2×β2×EAF×(1-EAF)+se2×2×N×EAF(1-EAF)。EAF代表效应等位基因频率。考虑到阈值相对宽松，对每个SNP计算F统计量以验证其强度，并估计样本重叠效应和弱工具偏差，F > 10被认为足以减轻潜在偏差的影响[35]。F统计量小于10的工具变量被认为是弱工具变量，将被排除在MR分析之外。
最后，通过IEU OpenGWAS数据库、GWAS catalog数据库或FinnGen数据库提取结果信息，并从结果中获得满足假设的非代理SNP之间的关系。合并暴露数据集和结果数据集，其中包含上述工具变量与结果和暴露之间的关系，并删除回文序列。最后剩下的SNP是暴露的最终工具变量。
1.4.2 MR分析在此次双向双样本MR研究中，采取5种MR分析方法，包括逆方差加权法(inverse-variance weighted)、加权中位数法(weighted median)、简单模式法(simple mode)、加权模式方法(weighted mode)和MR-Egger回归来验证微量营养素与骨坏死之间的双向因果关联，以逆方差加权法为金标准并对结果进行可视化分析[36]。
1.5 主要观察指标 ①基因预测的微量营养素与骨坏死是否存在因果关联；②基因预测的骨坏死与微量营养元素是否存在因果关联。
1.6 统计学分析使用mr_heterogeneity软件包对符合完全假设的SNP进行Cochran’s Q检验，以评估单个遗传变异之间的异质性[37]。如果Cochran’s Q检验的P < 0.05，则结果具有异质性，代表暴露与结局之间的关系受到不同年龄和性别的影响，MR的最终结果参考逆方差加权法随机效应模型作为金标准；否则，使用逆方差加权法固定效应模型作为金标准。还使用了孟德尔随机多效应检验Egger-截距法和MR-PRESSO检验来检查水平MR是否违反了孟德尔随机假设。对于水平多效性的Egger-intercept方法，其临界值是估计遗传变异是否通过暴露以外的途径显著影响结果，P < 0.05代表存在水平多效性，即所选工具变量通过暴露以外的途径显著影响结果，这违反了图1中的假设2和3，P > 0.05表示暴露不会通过暴露以外的途径对结果变量产生显著影响。作为一种敏感性分析，留一法(Leave-one-out sensitivity test)检验推断了最终SNP中是否有一个是离群值。通过观察漏斗图的对称性来检查结果是否稳定。然后，通过MR-PRESSO方法确定异常值，并评估异常值对结果的影响。
双向双样本MR分析使用R软件(4.1.2版，R Foundation for Statistical Computing)和 “TwoSampleMR”R软件包(0.5.6版)以及“MRPRESSO”R软件包(1.0.0版)进行。文章统计学方法已经山东中医药大学附属医院生物统计学专家审核。

讨论

此次MR研究旨在探索循环微量营养元素浓度对骨坏死的发病是否存在关联，并对方向因果关系进行探究。结果表明钙、镁、磷、维生素D、维生素E、胡萝卜素和视黄醇浓度与骨坏死之间不存在因果关系，血清铁浓度的升高会增加骨坏死的发病概率，与骨坏死呈正相关，这一结果的敏感性分析和多重比较校正都是可靠的。
骨坏死的发病机制至今仍不明确，目前细胞凋亡是其主要的发病机制之一。有研究发现，无论皮质类固醇或酒精等病因因素如何，股骨头坏死期间骨细胞和成骨细胞凋亡的发生率都会显著增加。凋亡的诱导集中在坏死区域周围，坏死区周围修复组织中凋亡的增加可能是导致股骨头塌陷的一个重要因素[38]。近年来，铁死亡(ferroptosis)在股骨头坏死中的研究不断被提出，不同于细胞凋亡，铁死亡作为一种新型细胞死亡方式，它是一种铁依赖性的，由于抗氧化系统失衡、氧化损伤引起的以脂质过氧化为特征的新型细胞程序性死亡方式[39-40]，细胞死亡过程中常伴随着大量的铁离子浓度的升高累积，铁超载是其显著的表现之一。但是至今为止，关于血清铁浓度的升高对骨坏死发病的影响仍然没有相关临床研究。LI等[41]在一项动物实验中发现铁超载会促进破骨细胞的分化和骨吸收活性，从而削弱骨的承载能力。铁过量会降低Runx2及其下游靶标(即骨钙素和碱性磷酸酶)在人成骨细胞中的表达，最终导致成骨细胞的细胞外基质矿化受损[42]，还会通过限制铁调节基因(HHIPL-2)的表达来降低成骨细胞的活性[43-45]。目前成骨细胞和破骨细胞的凋亡被认为是股骨头坏死发病机制的一个可能性[46]。但由于目前铁浓度对骨坏死关系的直接研究较少，作者通过MR分析直接研究血清铁浓度对骨坏死的因果关联，发现血清铁浓度是骨坏死的一个危险因素且不存在反向因果关系，作者推测这可能与铁浓度过高会引起破骨细胞和成骨细胞的活性降低有关。
除此之外，作者也发现之前的一些研究与此次研究结果有不一致的地方。KURIBAYASHI等[22]在一项动物实验中发现维生素E可预防类固醇引起的兔子骨坏死，MIKAMI等[47]也得出了同样的结论。但是MR结果显示维生素E与骨坏死不存在因果关系，也不存在反向因果关系。黎牧帆等[48]在探究维生素E对大鼠股骨头坏死的影响时发现，维生素E可能是通过减少线粒体依赖性骨细胞凋亡来延缓早期激素性股骨头缺血性坏死的进展。作者推测，结果不同的原因可能与人类和动物之间存在本质的差异，通过动物实验得到的数据有一定的局限性，有些药物或治疗方法能够在动物体内成功，但在人体内无效结果[49-50]。
有关钙、磷对骨坏死影响得研究很少，其中张海荣等[51]曾在一项128名潜水员减压性骨坏死病例分析研究中发现，患者的血清磷较正常人高、血清钙与常人无明显差异。此次实验结果表明血清磷与血清钙对骨坏死均无因果关系且不存在反向因果关系。由于相关研究较少，作者推测可能与病例研究样本数量过少有关。
胡萝卜素、视黄醇、镁和维生素D对骨坏死的直接研究几乎没有，其中裴凌鹏等[52]的研究发现β胡萝卜素可以改善H2O2对成骨细胞损伤的影响。UV等[53]研究发现视黄醇的释放可以支持成骨细胞(骨形成)增殖增加(20±1)%，并具有适当的细胞黏附和丝足延伸，当视黄醇存在时，破骨细胞形态坏死和撕裂，增殖减少(6±1)%。而骨坏死的发病机制可能与成骨细胞和破骨细胞的凋亡有关，但是此次实验结果表明胡萝卜素与视黄醇和骨坏死之间不存在双向因果关系，这可能是由于胡萝卜素数据是包含α、β等亚族的总数据，没有对亚族进行单个分析。维生素D能够刺激肠道吸收钙，对维系骨骼健康十分重要[54]；镁能刺激成骨细胞和磷酸酶群中参与骨骼形成过程的酶的活性缺镁会直接影响骨密度[55]。这些营养元素对骨骼健康都有重要的作用，但是此次研究结果与这些作用相悖，这可能与各营养元素浓度升高在对骨坏死发生作用时，产生其他的机制影响骨坏死的发病。这也与骨坏死至今的发病机制尚不清楚有一定的关联[10]。
高浓度铁可能通过铁死亡的方式来加重骨坏死的发病，虽然部分研究发现钙、镁、磷、维生素D、维生素E、胡萝卜素和视黄醇对骨坏死具有保护作用，但是大多数为观察性研究和动物实验，无法得出直接的因果关系。
MR研究的主要优势是从基因层面探究微量营养素对骨坏死的影响，不受混杂因素的影响，克服了传统实验的缺点，如混杂因素的影响、反向因果关系等。但是此次研究也同样存在一定的局限性。首先，筛选工具变量时按照P < 1×10-5阈值进行筛选，这是因为微量营养元素和骨坏死的全基因组关联研究数据问题，无法采用更低的阈值，这可能会存在一些不可避免的混杂因素，但是也会为研究提供足够的SNP进行分析。其次，研究中使用的GWAS摘要数据中的大多数参与者都是欧洲血统，考虑到人口分层的问题，这可能会使估计值出现部分偏差，是否适用于其他人种还需要进一步的临床研究。除此之外，胡萝卜素、维生素等有很多亚族，没有对其亚族进行MR分析，因为没有对应的数据。最后，要得出临床结论，还需要进行全面的临床试验进行验证，因此，需要更全面的GWAS数据库和进一步的分析方法或实验验证来明确各个微量营养元素与骨坏死的关联及影响机制。
结论：综上所述，基于MR分析结果发现血清铁浓度是骨坏死的危险因素，钙、镁、磷、维生素D、维生素E、胡萝卜素和视黄醇与骨坏死不存在因果关系且没有反向因果关系。后续还需要进行临床试验，来进一步探索或验证各种微量营养元素与骨坏死之间的关联和影响机制。通过此次研究了解微量营养元素对骨坏死的因果关系，有助于今后对骨坏死的诊疗，所以有必要对这些微量营养元素在骨坏死中发挥因果作用的详细机制进行研究。中国组织工程研究杂志出版内容重点：人工关节；骨植入物；脊柱；骨折；内固定；数字化骨科；组织工程

微量营养素与骨坏死的因果关系：来自双向孟德尔随机试验的证据

Causal association of micronutrients with osteonecrosis: evidence from a bidirectional Mendelian randomization trial

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