类风湿性关节炎中免疫相关基因表达及免疫细胞的双样本孟德尔随机化分析

doi:10.12307/2024.571

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (27): 4312-4318.doi: 10.12307/2024.571

• 组织工程相关大数据分析 Big data analysis in tissue engineering • 上一篇下一篇

类风湿性关节炎中免疫相关基因表达及免疫细胞的双样本孟德尔随机化分析

范以东1，秦刚2，何凯毅2，龚玉芳3，李威材1，吴广涛1

1广西中医药大学，广西壮族自治区南宁市 530222；2广西中医药大学第一附属医院，广西壮族自治区南宁市 530022；3贵港市人民医院，广西壮族自治区贵港市 537199

收稿日期:2023-10-08 接受日期:2023-11-25 出版日期:2024-09-28 发布日期:2024-01-26
通讯作者: 秦刚，博士，主任医师，广西中医药大学第一附属医院，广西壮族自治区南宁市 530022
作者简介:范以东，男，1993年生，河南省辉县市人，汉族，广西中医药大学在读硕士，主要从事骨关节退变与缺血性疾病的防治研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81860793)，项目名称：基于IFITM1/Wnt/β-catenin信号通路调控骨肉瘤细胞恶性增殖探讨抑瘤汤抗骨肉瘤的机制，项目负责人：秦刚；国家自然科学基金(82360939)，项目名称：circ_CDK14激活miR-520a-3p/SUV39H1诱导骨肉瘤细胞铁死亡及抑瘤汤防治机制研究，项目负责人：秦刚；广西自然科学基金(2020GXNSFAA297140)，项目名称：抑瘤汤通过LncRNA MALAT1激活MAPK通路磷酸化抑制骨肉瘤的基础研究，项目负责人：秦刚；广西中医药大学2022年研究生教育创新计划项目(YCSY2022028)，项目名称：枸杞多糖通过miRNA-20a介导的PTEN/PI3K/AKT信号通路诱导骨肉瘤细胞自噬的机制研究，项目负责人：范以东

Expression of immune-related genes in rheumatoid arthritis and a two-sample Mendelian randomization study of immune cells

Fan Yidong1, Qin Gang2, He Kaiyi2, Gong Yufang3, Li Weicai1, Wu Guangtao1

1Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530222, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; 2The First Affiliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; 3The People’s Hospital of Guigang, Guigang 537199, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China

Received:2023-10-08 Accepted:2023-11-25 Online:2024-09-28 Published:2024-01-26
Contact: Qin Gang, MD, Chief physician, The First Affiliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
About author:Fan Yidong, Master candidate, Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530222, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
Supported by:
National Natural Science Foundation of China, Nos. 81860793 and 82360939 (both to QG); Natural Science Foundation of Guangxi Zhuang Autonomous Region, No. 2020GXNSFAA297140 (to QG); Postgraduate Education Innovation Program of Guangxi University of Chinese Medicine in 2022, No. YCSY2022028 (to FYD)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

孟德尔随机化：是一种遵循孟德尔遗传定律的遗传变量分析，该方法能利用单核苷酸多态性作为工具变量来评估暴露因素与临床结局之间的因果关系。
单核细胞：是人体内重要的先天性免疫细胞，能分泌细胞因子、趋化因子和炎症递质等促进炎症反应的进行。

背景：类风湿性关节炎是一种慢性全身性自身免疫疾病，研究其涉及的免疫学特征改变对诊断和治疗具有重要意义。

目的：通过生物信息学方法筛选类风湿性关节炎中免疫相关生物标志物，分析其免疫细胞浸润变化及与免疫细胞的潜在因果关系。
方法：基于GEO与ImmPort数据库，采用差异表达分析筛选类风湿性关节炎中表达上调的免疫相关基因，采用GO与KEGG富集分析探索这些上调基因的潜在作用。采用支持向量机递归特征消除(SVM-RFE)、最小绝对收缩和选择算法(Lasso)筛选类风湿性关节炎中免疫特征基因，独立的数据集进行差异验证，绘制特征基因的受试者工作特征曲线评价诊断性能。采用免疫细胞浸润分析类风湿性关节炎中免疫细胞的差异情况及特征基因与免疫细胞的相关性。最后，进行孟德尔随机化分析，以确定免疫细胞中单核细胞与类风湿性关节炎的因果效应。

结果与结论：①筛选得到了39个在类风湿性关节炎中高表达的差异基因，GO富集分析显示其主要富集在趋化性、细胞因子活性、免疫受体活性等过程，KEGG富集分析显示其在肿瘤坏死因子信号通路、白细胞外周迁移等途径显著富集；②通过Lasso与SVM-RFE两种机器学习算法确定了5个特征基因，分别为CXCL13、SDC1、IGLC1、PLXNC1和SLC29A3，独立的数据集对特征基因验证发现他们同样在类风湿性关节炎样本中高表达，5个特征基因在2个数据集中的AUC值均大于0.8；③免疫细胞浸润发现大多数免疫细胞如单核细胞、自然杀伤细胞等在类风湿性关节炎样本里表现出更高的浸润水平，相关性分析显示5个特征基因与记忆B细胞、不成熟B细胞等呈正相关性，逆方差加权法发现单核细胞与类风湿性关节炎发病风险相关。

https://orcid.org/0009-0000-3044-7311(范以东)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 类风湿性关节炎, 机器学习, 免疫浸润, 全基因组关联研究, 孟德尔随机化

Abstract: BACKGROUND: Rheumatoid arthritis is a chronic systemic autoimmune disease. It is important to study the immunological changes involved in it for diagnosis and treatment.
OBJECTIVE: To identify immune-related biomarkers associated with rheumatoid arthritis utilizing bioinformatics techniques and examine alterations in immune cell infiltration as well as the relationship between immune cells and biomarkers.
METHODS: Differential expression analysis was used to identify the immune-related genes that were up-regulated in rheumatoid arthritis based on the GEO and Immport databases. Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) and gene ontology (GO) enrichment analyses were used to investigate the possible function of these elevated genes. The immunological characteristic genes associated with rheumatoid arthritis were screened using least absolute shrinkage and selection operator (Lasso) and support vector machine recursive feature elimination (SVM-RFE). Independent datasets were used for difference validation, and the diagnostic performance was evaluated by plotting receiver operating characteristic curves for feature genes. Immune cell infiltration was used to analyze the differential profile of immune cells in rheumatoid arthritis and the correlation between the characterized genes and immune cells. In order to ascertain the causal relationship between monocytes and rheumatoid arthritis in immune cells, Mendelian randomization analysis was ultimately employed.
RESULTS AND CONCLUSION: There were 39 upregulated differentially expressed genes in rheumatoid arthritis. The genes were primarily enriched in chemotaxis, cytokine activity, and immune receptor activity, according to GO enrichment analysis, while kEGG enrichment analysis revealed that the genes were considerably enriched in the tumor necrosis factor signaling pathway and peripheral leukocyte migration. Lasso and SVM-RFE identified five feature genes: CXCL13, SDC1, IGLC1, PLXNC1, and SLC29A3. Independent dataset validation of the feature genes found them to be similarly highly expressed in rheumatoid arthritis samples, with area under the curve values greater than 0.8 for all five feature genes in both datasets. Immune cell infiltration indicated that most immune cells, including natural killer cells and monocytes, exhibited increased levels of infiltration in rheumatoid arthritis samples. The correlation analysis revealed a significant positive correlation between memory B cells and immature B cells and these five feature genes. Correlation analysis showed that the five feature genes were positively correlated with memory B cells and immature B cells. The inverse variance weighting method revealed that monocytes were associated with the risk of developing rheumatoid arthritis.

Key words: rheumatoid arthritis, machine learning, immune infiltration, genome-wide association studies, Mendelian randomization

中图分类号:

范以东, 秦刚, 何凯毅, 龚玉芳, 李威材, 吴广涛. 类风湿性关节炎中免疫相关基因表达及免疫细胞的双样本孟德尔随机化分析[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(27): 4312-4318.

Fan Yidong, Qin Gang, He Kaiyi, Gong Yufang, Li Weicai, Wu Guangtao. Expression of immune-related genes in rheumatoid arthritis and a two-sample Mendelian randomization study of immune cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(27): 4312-4318.

图/表（结果） 8

2.1 差异表达免疫相关基因在类风湿性关节炎中的表达从GSE77298的正常样本与类风湿性关节炎样本中共筛选得到432个差异表达基因，其中195个下调、237个上调。将差异表达基因与免疫相关基因取交集，得到了55个差异表达免疫相关基因，包含16个下调基因与39个上调基因，见图1。

2.2 上调差异表达免疫相关基因的富集分析通过Metaspace探索了上调差异表达免疫相关基因在类风湿性关节炎中潜在的生物学作用和相关途径，GO富集分析显示其主要与趋化性、细胞因子活性、免疫受体活性和适应性免疫应答等生物学作用相关；KEGG富集分析显示细胞因子受体相互作用、肿瘤坏死因子信号通路、细胞凋亡及白细胞外周迁移等途径显著富集，见图2。

2.3 类风湿性关节炎中免疫特征基因的筛选对39个上调差异表达免疫相关基因进行Lasso回归与SVM-RFE算法筛选，lasso回归采用函数cv.glmnet()通过10折交叉验证选择最佳λ值，回归模型的类型为binomial(二元离散因变量)，选择L1范数正则化产生稀疏模型便于特征基因筛选，共筛选得到6个特征基因。通过函数svmRFE()创建SVM-RFE算法，10倍交叉验证筛选特征基因，当特征基因数为18时误差最小为0.1。将两种算法取交集共得到5个免疫特征基因：CXCL13、SDC1、IGLC1、PLXNC1和SLC29A3，见图3。

2.4 类风湿性关节炎特征基因的验证及诊断准确性评估 5个特征基因在GSE77298的类风湿性关节炎样本中高表达，他们的受试者工作特征曲线的曲线下面积值均大于0.9。在数据集GSE55457中对5个特征基因进行验证，发现他们同样高表达于类风湿性关节炎组织中，受试者工作特征曲线下面积值均大于0.8，见图4。说明特征基因在预测类风湿性关节炎中具有较好的性能。

2.5 类风湿性关节炎中的免疫学特征改变根据免疫细胞浸润及其与免疫特征基因的相关性评估类风湿性关节炎的免疫学特征。与健康对照样本相比，28种免疫细胞中单核细胞、自然杀伤细胞、活化B细胞等19种免疫细胞在类风湿性关节炎样本里表现出更高的浸润水平，见图5A。免疫细胞之间的相关性显示他们大多为正相关关系，其中单核细胞与巨噬细胞、肥大细胞等免疫细胞之间有较强相关性，而中性粒细胞、自然杀伤细胞与其他免疫细胞的相关性较弱。记忆B细胞、不成熟B细胞及活化CD8T细胞等免疫细胞与特征基因呈正相关性，未发现负调控关系，见图5B。在免疫检查点中，BTLA、CD48和TIGIT等免疫检查点与特征基因显示出较强正相关关系，见图5C。

2.6 单核细胞与类风湿性关节炎的双样本孟德尔随机化分析对2个单核细胞数据进行筛选，所有单核苷酸多态性均不是弱变量工具。在单核细胞数据ebi-a-GCST90002341中，共获得50个单核苷酸多态性，使用逆方差加权方法显示单核细胞与类风湿性关节炎风险呈正因果关系(95%CI=1.01-1.54，OR=1.25，P=0.036)，其他补充方法未发现显著统计学意义，MR-Egger-intercept分析未检测到潜在的水平多效性(P=0.345)；此外，Cochran’s Q异质性检验中观察到异质性(P=0.000 9)，见图6。

在单核细胞数据ebi-a-GCST90002339中，共获得11个单核苷酸多态性，逆方差加权方法同样显示单核细胞与类风湿性关节炎风险呈正因果关系(95%CI=1.02-1.25，OR=1.13，P=0.023)，其他补充方法未发现显著统计学意义；MR-Egger-intercept分析未检测到潜在的水平多效性(P=0.502)，Cochran’s Q异质性检验中未观察到异质性(P=0.930)，见图7。5种方法的MR分析结果森林图，见图8。

参考文献

[1] WU R, LONG L, ZHOU Q, et al. Identification of hub genes in rheumatoid arthritis through an integrated bioinformatics approach. J Orthop Surg Res. 2021;16(1):1-9.
[2] LIN YJ, ANZAGHE M, SCHÜLKE S. Update on the pathomechanism, diagnosis, and treatment options for rheumatoid arthritis. Cells. 2020;9(4):880.
[3] SMOLEN JS. Insights into the treatment of rheumatoid arthritis: a paradigm in medicine. J Autoimmun. 2020;110:102425.
[4] REN C, LI M, DU W, et al. Comprehensive bioinformatics analysis reveals hub genes and inflammation state of rheumatoid arthritis. Biomed Res Int. 2020;2020:6943103.
[5] JANG S, KWON EJ, LEE JJ. Rheumatoid arthritis: pathogenic roles of diverse immune cells. Int J Mol. 2022;23(2):905.
[6] NEWMAN AM, ALIZADEH AA. High-throughput genomic profiling of tumor-infiltrating leukocytes. Curr Opin Immunol. 2016;41:77-84.
[7] ZUO S, WEI M, WANG S, et al. Pan-cancer analysis of immune cell infiltration identifies a prognostic immune-cell characteristic score (ICCS) in lung adenocarcinoma. Front Immunol. 2020;11:1218.
[8] BOEHM FJ, ZHOU X. Statistical methods for Mendelian randomization in genome-wide association studies: A review. Comput Struct Biotechnol J. 2022;20:2338-2351.
[9] LAMINA C. Mendelian Randomization: Principles and its usage in Lp (a) research. Atherosclerosis. 2022;349:36-41.
[10] XU J, ZHANG S, TIAN Y, et al. Genetic causal association between iron status and osteoarthritis: a two-sample Mendelian randomization. Nutrients. 2022;14(18):3683.
[11] BROEREN MGA, DE VRIES M, BENNINK MB, et al. Disease-regulated gene therapy with anti-inflammatory interleukin-10 under the control of the CXCL10 promoter for the treatment of rheumatoid arthritis. Hum Gene Ther. 2016;27(3):244-254.
[12] NAKAO H, IMAOKA M, HIDA M, et al. Determination of individual factors associated with hallux valgus using SVM-RFE. BMC Musculoskelet Disord. 2023;24(1):534.
[13] LI Y, LU F, YIN Y. Applying logistic LASSO regression for the diagnosis of atypical Crohn’s disease. Sci Rep. 2022;12(1):11340.
[14] WOETZEL D, HUBER R, KUPFER P, et al. Identification of rheumatoid arthritis and osteoarthritis patients by transcriptome-based rule set generation. Arthritis Res Ther. 2014;16:1-22.
[15] ZENG Y, CAO S, CHEN M. Integrated analysis and exploration of potential shared gene signatures between carotid atherosclerosis and periodontitis. BMC Med Genomics. 2022;15(1):1-15.
[16] HU FF, LIU CJ, LIU LL, et al. Expression profile of immune checkpoint genes and their roles in predicting immunotherapy response. Brief Bioinform. 2021;22(3):bbaa176.
[17] ROSZKOWSKI L, CIECHOMSKA M. Tuning monocytes and macrophages for personalized therapy and diagnostic challenge in rheumatoid arthritis. Cells. 2021;10(8):1860.
[18] HENRY A, GORDILLO-MARAÑÓN M, FINAN C, et al. Therapeutic targets for heart failure identified using proteomics and Mendelian randomization. Circulation. 2022;145(16):1205-1217.
[19] LIN L, LUO P, YANG M, et al. Causal relationship between osteoporosis and osteoarthritis: A two-sample Mendelian randomized study. Front Endocrinol (Lausanne). 2022;13:1011246.
[20] SHU MJ, LI JR, ZHU YC, et al. Migraine and ischemic stroke: a Mendelian randomization study. Neurol Ther. 2022;11(1):237-246.
[21] BURGESS S, THOMPSON SG. Interpreting findings from Mendelian randomization using the MR-Egger method. Eur J Epidemiol. 2017;32: 377-389.
[22] GUDERUD K, SUNDE LH, FLÅM ST, et al. Rheumatoid arthritis patients, both newly diagnosed and methotrexate treated, show more DNA methylation differences in CD4+ memory than in CD4+ naïve T cells. Front Immunol. 2020;11:194.
[23] KONDO N, KURODA T, KOBAYASHI D. Cytokine networks in the pathogenesis of rheumatoid arthritis. Int J Mol Sci. 2021;22(20):10922.
[24] PAN Z, ZHU T, LIU Y, et al. Role of the CXCL13/CXCR5 axis in autoimmune diseases. Front Immunol. 2022;13:850998.
[25] GREISEN SR, SCHELDE KK, RASMUSSEN TK, et al. CXCL13 predicts disease activity in early rheumatoid arthritis and could be an indicator of the therapeutic ‘window of opportunity’. Arthritis Res Ther. 2014;16(5):1-9.
[26] VAN RAEMDONCK K, UMAR S, PALASIEWICZ K, et al. Interleukin‐34 Reprograms Glycolytic and Osteoclastic Rheumatoid Arthritis Macrophages via Syndecan 1 and Macrophage Colony‐Stimulating Factor Receptor. Arthritis Rheumatol. 2021;73(11):2003-2014.
[27] ALZOUBI O, MEYER A, GONZALEZ TP, et al. Significance of IL-34 and SDC-1 in the pathogenesis of RA cells and preclinical models. Clin Immunol. 2023;251:109635.
[28] NI Z, HUANG C, ZHAO H, et al. PLXNC1: A novel potential immune-related target for stomach adenocarcinoma. Front Cell Dev Biol. 2021;9:662707.
[29] COMEAU MR, JOHNSON R, DUBOSE RF, et al. A poxvirus-encoded semaphorin induces cytokine production from monocytes and binds to a novel cellular semaphorin receptor, VESPR. Immunity. 1998;8(4):473-482.
[30] WALZER T, GALIBERT L, COMEAU MR, et al. Plexin C1 engagement on mouse dendritic cells by viral semaphorin A39R induces actin cytoskeleton rearrangement and inhibits integrin-mediated adhesion and chemokine-induced migration. J Immunol. 2005;174(1):51-59.
[31] NOAVAR S, BEHROOZI S, TATARCHEH T, et al. A novel homozygous frame-shift mutation in the SLC29A3 gene: a new case report and review of literature. BMC Med Gene. 2019;20(1):1-7.
[32] ALANSARI S, ALSALEEM A, ALZAID T, et al. The SLC29A3 variant, neutrophilic dermatosis, and hyperferritinemia imitate systemic juvenile idiopathic arthritis in a Saudi child: a case report. J Rheum Dis. 2023;30(2):133-137.
[33] STEINZ MM, EZDOGLIAN A, KHODADUST F, et al. Folate receptor beta for macrophage imaging in rheumatoid arthritis. Front Immunol. 2022;13: 819163.
[34] YANG S, ZHAO M, JIA S. Macrophage: Key player in the pathogenesis of autoimmune diseases. Front Immunol. 2023;14:1080310.
[35] NING Z, LIU K, XIONG H. Roles of BTLA in immunity and immune disorders. Front Immunol. 2021;12:654960.
[36] YANG B, HUANG Z, FENG W, et al. The Expression of BTLA Was Increased and the Expression of HVEM and LIGHT Were Decreased in the T Cells of Patients with Rheumatoid Arthritis [corrected]. PLoS One. 2016;11(5): e0155345.
[37] KAPELLOS TS, BONAGURO L, GEMÜND I, et al. Human monocyte subsets and phenotypes in major chronic inflammatory diseases. Front Immunol. 2019;10:2035.
[38] PRAJZLEROVÁ K, KRYŠTŮFKOVÁ O, KOMARC M, et al. The dysregulation of monocyte subpopulations in individuals at risk of developing rheumatoid arthritis. Rheumatology. 2021;60(4):1823-1831.
[39] TSUKAMOTO M, SETA N, YOSHIMOTO K, et al. CD14brightCD16+ intermediate monocytes are induced by interleukin-10 and positively correlate with disease activity in rheumatoid arthritis. Arthritis Res Ther. 2017;19(1):1-10.
[40] ZHAO J, GUO S, SCHRODI SJ, et al. Molecular and cellular heterogeneity in rheumatoid arthritis: mechanisms and clinical implications. Front Immunol. 2021;12:790122.
[41] YANG M, WAN X, ZHENG H, et al. No evidence of a genetic causal relationship between ankylosing spondylitis and gut microbiota: A two-sample mendelian randomization study. Nutrients. 2023;15(4):1057.

引言

类风湿性关节炎是一种与慢性炎症相关的自身免疫性疾病，随着疾病的发展会出现滑膜组织过度增殖和进行性关节破坏、畸形，甚至导致残疾与死亡[1]。类风湿性关节炎的女性发病率约为男性的2倍[2]。类风湿性关节炎早期可在血清中检测到多种自身抗体，包括类风湿因子和抗瓜氨酸蛋白抗体[3]。尽管自身抗体的血清学检测是类风湿性关节炎诊断和治疗的关键指标，但仍有约25%的患者血清检测为阴性，这有可能会影响疾病的诊断和治疗[4]。类风湿性关节炎的潜在发病机制复杂，与遗传、环境和免疫等因素关系密切，其中免疫因素在整个发病过程占据至关重要的作用[5]。随着转录组学和高通量测序的发展和广泛应用，生物信息学可用于鉴定许多疾病潜在的生物标志物，这为人们探索类风湿性关节炎中免疫相关生物标志物及其相关机制提供了可能，此外其也是量化各种疾病中免疫细胞浸润的方法[6]。单样本基因集富集分析(single sample gene set enrichment analysis，ssGSEA)是基因集富集分析方法的扩展，ssGSEA对每个样本的基因表达数据和对应基因集进行比较，以此来估计该基因集在样本中的相对富集程度[7]。将基因集设定为免疫细胞相关基因集，使人们能够计算类风湿性关节炎中各种免疫细胞的相对丰度，更好地研究类风湿性关节炎与免疫细胞的相关性。
孟德尔随机化(mendelian randomization，MR)是一种遵循孟德尔遗传定律的遗传变量分析，通过利用单核苷酸多态性作为工具变量来推断暴露因素与临床相关结局之间的因果关系[8]。MR利用了等位基因在减数分裂时的随机性，在分析基因与结局的因果关联时能够减少混杂因素带来的偏差[9]；此外，由于遗传变异发生在疾病之前且具有不可改变性，这使得MR能够避免因果关系的反向干扰[10]。
研究从公共数据库中下载并筛选出了5个在类风湿性关节炎中高表达的免疫相关特征基因，通过独立的类风湿性关节炎数据集进行差异验证；采用ssGSEA进行免疫细胞浸润评估不同免疫细胞类型的相对丰度，进一步将5个免疫特征基因与免疫细胞进行相关性分析；最后，通过GWAS数据库下载了2个单核细胞数据，通过MR分析其与类风湿性关节炎的潜在因果关系。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计机器学习筛选类风湿性关节中的免疫相关基因，独立的外部数据集进行验证。采用ssGSEA进行免疫细胞浸润分析。单核细胞与类风湿性关节炎因果关联的双样本MR分析。
1.2 时间及地点数据分析于2023年9-10月在广西中医药大学分子实验室完成。
1.3 资料
数据来源：从GEO数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中以“Rheumatoid Arthritis”为关键字进行搜索，设置物种为“Homo sapiens”，数据类型为“微阵列”或“高通量测序”，纳入标准：①微阵列或高通量测序检测类风湿性关节炎和健康对照样本的mRNA；②包含10个以上的类风湿性关节炎与健康对照样本数据集；③样本组织来源为关节滑膜组织。纳入GSE77298进行分析[11]，平台为GPL570，包含7个正常关节滑膜和16个类风湿性关节炎关节滑膜。2 660个免疫相关基因从Immport数据库(https://www.immport.org/home)获得。
1.4 方法
1.4.1 数据预处理与差异基因的筛选从GEO数据库下载相应数据的基因表达矩阵和注释文件，利用Perl软件将探针ID转换为基因符号。当有多个探针映射到同一基因符号时选择它们的平均值作为基因表达量。使用“limma”包对GSE77298进行差异分析，按校验 P < 0.05(adj.P.value < 0.05)、表达变化倍数的绝对值> 1(|log2FC| > 1)筛选差异表达基因。将类风湿性关节炎差异基因与免疫基因取交集得到类风湿性关节炎中差异表达的免疫相关基因，采用“pheatmap”包进行热图可视化。
1.4.2 上调差异表达免疫相关基因的GO与KEGG富集分析由于类风湿性关节炎与体内过激的免疫系统有密切关系，对上调相关差异表达的免疫相关基因进行了富集分析，探索其可能涉及的生物学功能与途径。使用Metascape(http://metascape.org)对获得的上调差异表达免疫相关基因进行京都基因和基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)和基因本体(gene ontology，GO)富集分析，以富集基因数≥3、P < 0.01、富集因子> 1.5作为显著富集的筛选条件。
1.4.3 机器学习筛选类风湿性关节炎免疫特征基因支持向量机递归特征消除(support vector machine recursive feature elimination，SVM-RFE)与最小绝对收缩和选择算法(least absolute shrinkage and selection operator，Lasso)来筛选显著的特征基因。SVM-RFE是一种广泛用于分类和回归的监督机器学习，使用RFE算法从数据中选择最佳基因，避免过拟合[12]。LASSO 通过一种降维方法实现，使用正则化来提高预测精度，在拟合广义线性模型的同时进行变量筛选和复杂性调整[13]。
1.4.4 类风湿性关节炎免疫特征基因的验证及诊断准确性评估按照先前的纳入标准，从GEO数据库中下载了另一个数据集GSE55457来进行特征基因的差异水平验证[14]，此数据包含10例正常样本、13例类风湿性关节炎样本及10例骨关节炎样本，平台为GPL96。删除其中的骨关节炎样本，采用“limma”包提取特征基因表达量并进行验证。受试者工作特征曲线和曲线下面积用于估计特征基因的诊断效果。
1.4.5 免疫浸润分析 ssGSEA评分用于确定数据集中每个样本中的免疫浸润水平，该水平是依据免疫细胞特异性标记基因的表达来计算的，将基因表达谱转换为免疫基因集富集评分来量化28种免疫细胞的浸润水平。28种免疫细胞的标记基因是从先前发表的1篇文章中获得的[15]，运用ssGSEA算法计算正常和类风湿性关节炎样本中免疫细胞的浸润丰度，筛选两组之间差异免疫细胞。随后对免疫细胞之间及特征基因与免疫细胞的相关性进行分析，绘制相关性矩阵。此外，还从相关文献中获取了免疫检查点相关基因[16]，计算并可视化免疫检查点基因与特征基因的相关性。
1.4.6 类风湿性关节炎与单核细胞的双样本MR分析此数据来源于公共数据库GWAS(https://gwas.mrcieu.ac.uk/)。使用双样本MR探索单核细胞与类风湿性关节炎之间的潜在因果关系。研究发现，在类风湿性关节炎中单核细胞作为免疫系统中非常重要的细胞，他们产生的细胞因子会增加炎症并导致软骨和骨骼的破坏[17]，所以此次研究选择了2个单核细胞数据与类风湿性关节炎进行双样本MR研究，数据编号及相关信息见表1。采用R包“TwoSampleMR”进行MR分析，所选的工具变量单核苷酸多态性需满足以下3个假设[18]：①相关性假设：遗传工具变量与暴露相关；②独立性假设：遗传工具变量与混杂因素无关；③无多效性假设：遗传工具变量仅通过影响暴露因素的来影响结果。按P < 5×10-8挑选与暴露因素强相关的单核苷酸多态性作为工具变量，这些工具变量以R2 < 0.001和kb=10 000去除连锁不平衡效应，F统计量> 10认为工具变量没有弱变量偏倚[19]。

1.5 主要观察指标 ①类风湿性关节炎中免疫相关特征基因的表达及涉及的途径；②在类风湿性关节炎中活跃免疫细胞与免疫特征基因的相关性；③单核细胞与类风湿性关节炎的因果关系。

1.6 统计学分析分析工具为 R 软件 (x64 4.2.1)。T-test筛选类风湿性关节炎差异基因。Lasso 回归、SVM-RFE)算法分别采用“glmnet”和“e1071”包构建。以“TwoSampleMR”包，采用5种不同的方式进行双样本MR分析：以逆方差加权作为主要方法，MR egger、Weighted median、Simple mode、Weighted mode作为补充方法，以 P < 0.05 认为差异有显著性意义。Cochran’s Q检验评估单核细胞单核苷酸多态性对类风湿关节炎结果影响的异质性，若P < 0.05认为单核苷酸多态性之间存在异质性[20]。
MR-Egger-intercept分析进行水平多效性检测，若P > 0.05则认为不存在多效性[21]。文章的统计学方法已经广西中医药大学生物统计学专家审核。

讨论

类风湿性关节炎的特征是滑膜炎症，可侵蚀骨组织和关节软骨，进而影响患者关节活动[1]。由于类风湿性关节炎会对关节进行持续的破坏，所以早期诊断与治疗十分重要，但早期的类风湿性关节炎症状不明显，导致诊断时间延长，给治疗带来很大困难。免疫调节异常是类风湿性关节炎发生发展的重要因素，免疫细胞浸润关节滑膜引起特异性免疫反应，从而导致关节炎的相关症状[22]。因此，研究免疫基因与免疫细胞在类风湿性关节炎中的作用及其与类风湿性关节炎的相关性，寻找新的免疫相关诊断标志物具有重要意义。
此次研究对类风湿性关节炎中上调的39个差异表达免疫相关基因进行了富集分析，发现细胞因子活性与肿瘤坏死因子信号通路显著富集。在类风湿性关节炎中抗瓜氨酸化蛋白抗体的特异性升高，含抗瓜氨酸化蛋白抗体的免疫复合物能激活巨噬细胞并触发肿瘤坏死因子α和白细胞介素6等炎性细胞因子的释放，这种细胞因子介导的途径被认为是类风湿性关节炎发病的核心机制[23]。
通过两种机器学习算法得到了5个免疫相关生物标志物，分别为CXCL13、SDC1、IGLC1、PLXNC1和SLC29A3。CXCL13是一种B细胞趋化因子，可促进B淋巴细胞的迁移和聚集，广泛参与各种免疫应答[24]。一项临床研究发现，类风湿性关节炎患者血清CXCL13表达水平显著高于健康对照组，且CXCL13过表达与类风湿性关节炎的临床严重程度密切相关，提示CXCL13可能是类风湿性关节炎的生物标志物[25]。SDC1是硫酸乙酰肝素蛋白多糖的主要成员之一，作为巨噬细胞集落刺激因子受体的辅助受体能够调节白细胞介素34的生物活性，在类风湿性关节炎中，白细胞介素34与C-反应蛋白、红细胞沉降率、类风湿因子和抗环瓜氨酸肽抗体具有较强相关性[26]。有研究表明，白细胞介素34和SDC1小鼠通过抑制单核细胞浸润以及代谢失活进而抑制炎症巨噬细胞和效应T细胞，靶向白细胞介素34/SDC1信号或其相互连接的代谢物可以有效减轻类风湿性关节炎的关节炎症[27]。PLXNC1编码丛蛋白家族成员，是信号蛋白的跨膜受体，而信号蛋白是调节细胞运动和迁移、轴突引导和免疫反应的一大类分子信号[28]。COMEAU等[29]发现PLXNC1在T细胞、B细胞、单核细胞、树突状细胞及中性粒细胞等具有关键免疫调节功能的实体器官上表达。随后，WALZER等 [30]的实验表明，PLXNC1在体外影响树突状细胞和中性粒细胞的黏附、迁移和吞噬作用。SLC29A3又叫做平衡核苷转运蛋白3(ENT3)，编码核苷转运蛋白，该蛋白存在于细胞内膜中，特别是在溶酶体和线粒体膜中[31]。在SLC29A3中研究最多的疾病是H综合征，但是通过最近的临床研究发现，SLC29A3相关的疾病伴有自身免疫与自身炎症的表现，包括关节挛缩和关节炎，其途径可能与过度活跃的炎症小体相关[32]。有关人类IGLC1的相关研究数据较少，也没有其与类风湿性关节炎的相关报道，此次研究发现其在类风湿性关节炎中高表达且与诸多免疫细胞呈正相关，相关机制仍待后续进一步研究。
免疫细胞浸润发现大多数免疫细胞在类风湿性关节炎组织中较为活跃，其中包括先天性免疫细胞如单核细胞和巨噬细胞等，还有适应性免疫细胞包括各种T淋巴细胞、B淋巴细胞等，免疫细胞分泌各种趋化因子、炎症递质、促炎因子等作用于患者滑膜组织和关节。已有研究发现类风湿性关节炎中巨噬细胞浸润与关节侵蚀程度呈正相关，滑膜组织中的巨噬细胞浸润增加是类风湿性关节炎的早期征兆[33]。巨噬细胞通过促进Th17细胞的产生和分泌包括白细胞介素26在内的细胞因子刺激破骨细胞，从而加速炎症反应；此外，巨噬细胞介导内皮细胞的增殖和趋化性，促进炎症细胞的浸润并产生内皮生长因子，进一步扩大类风湿性关节炎的炎症[34]。此次研究还发现免疫检查点B和T淋巴细胞衰减因子与特征基因之间存在着较强的正相关性。B和T淋巴细胞衰减因子属于CD28超家族成员，能在大多数淋巴细胞中检测到，其通过抑制B细胞和T细胞的活化和增殖来诱导免疫抑制[35]。有研究发现，B和T淋巴细胞衰减因子在类风湿性关节炎患者的T淋巴细胞中表达增加，可能通过促进T淋巴细胞的激活和增殖来引起炎症和自身免疫反应[36]。
此次MR分析表明，单核细胞可能与类风湿性关节炎患病风险存在因果关系。单核细胞来源于骨髓造血干细胞，根据其表面CD14和CD16表达将单核细胞分为3个亚群：经典群(CD14++CD16-)、中间群(CD14++CD16+)和非经典群(CD14+CD16++)[37]。单核细胞亚群变化可作为类风湿性关节炎活动期的生物标志物，随着类风湿性关节炎疾病的进展，单核细胞亚群也出现相应的变化，早期类风湿性关节炎患者中经典群的比例相对较低，中间和非经典群的比例相对较高[38]。TSUKAMOTO等[39]发现单核细胞中间亚群的比例与类风湿性关节炎疾病活动度呈正相关，与经典亚群的患病率呈负相关。与正常单核细胞相比，类风湿性关节炎中的单核细胞表面各种黏附蛋白表达更高，包括纤连蛋白和整合素复合物CD11b，从而促进其黏附和迁移；此外，类风湿性关节炎中的单核细胞在细胞表面表达人可溶性增殖诱导配体(hsAPRIL)，这与疾病活动度显著相关[40]。在此次研究中，随机效应逆方差加权结果是研究的主要基础，虽然每个遗传变异都满足工具变量假设，但逆方差加权采用Meta分析方法，能对暴露对结果的因果关系进行可靠的评估[41]。此次分析发现单核细胞数据ebi-a-GCST90002341存在异质性，但其逆方差加权分析显示其与类风湿性关节炎存在因果关系。此次研究也存在一些缺点，数据来源于东亚和混合人种，未对其他人种进行研究；年龄、性别等混杂因素等环境混杂因素也对MR分析有一定影响；此外由于数据样本量的原因，未对其他差异免疫细胞进行因果分析。
总之，此次研究从免疫基因、免疫细胞及其潜在因果关联三方面对类风湿性关节炎中免疫学特征改变进行了分析，这些研究提高了人们对类风湿性关节炎发生发展的理解。但该研究仍有不足之处：首先，虽然在独立外部数据中验证了特征基因的差异情况，但仍有可能存在假阳性，未来需要加入更多的样本来验证；其次，研究得出的结论需要进一步的生物学实验进行验证。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

类风湿性关节炎中免疫相关基因表达及免疫细胞的双样本孟德尔随机化分析

Expression of immune-related genes in rheumatoid arthritis and a two-sample Mendelian randomization study of immune cells

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 8

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	余伟杰, 刘爱峰, 陈继鑫, 郭天赐, 贾易臻, 冯汇川, 杨家麟. 机器学习在腰椎间盘突出症诊治中的优势和应用策略[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(9): 1426-1435.
[2]	陈继鑫, 余伟杰, 郭天赐, 周沁心, 牛朴钰, 叶云天, 刘爱峰. 睡眠特征与骨关节炎发病风险：两样本与多变量孟德尔随机化分析[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(32): 5203-5209.
[3]	徐文飞, 明春玉, 段戡, 袁长深, 郭锦荣, 胡琪, 曾超, 梅其杰. WGCNA和机器学习识别骨关节炎铁死亡特征基因及实验验证[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(30): 4909-4914.
[4]	李树栋, 梁学振, 骆帝, 李嘉程, 阎博昭, 李刚. 绝经后骨质疏松症潜在铁死亡及细胞焦亡相关诊断生物标志物[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(28): 4511-4515.
[5]	陈天鑫, 董婷婷, 李妍, 张晟, 张磊. 孟德尔随机化分析血液代谢物与肌少症相关特征的因果关系[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(27): 4288-4292.
[6]	詹群璋, 张钰玲, 韩雨欣, 吕嘉振, 郑晓霞, 曲崇正. 肥胖和骨质疏松之间的关联：一项两样本双向孟德尔随机化分析[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(27): 4319-4324.
[7]	柴金莲, 李树栋, 李威, 杜海涛, 董丽敏, 梁学振, 王平. 肠道菌群与药物相关性骨坏死：两样本双向孟德尔随机化分析[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(27): 4325-4331.
[8]	马玮玮, 熊勇, 陈虹谷, 黄文茁, 黄新, 周晓红. 他汀类药物与骨密度：一项药物靶向孟德尔随机化分析[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(27): 4340-4345.
[9]	武瑞骐, 张璇, 周毅, 孟林, 李宏宇. 两样本孟德尔随机化分析他汀类药物与骨关节炎风险的关系[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(26): 4106-4112.
[10]	彭志华, 潘俊曦, 冯庆辉, 田天照, 张胜, 李安, 蔡迎峰. 两样本孟德尔随机化分析血脂与肌肉减少症的因果关系[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(23): 3699-3703.
[11]	武瑞骐, 周毅, 夏天, 张驰, 杨启培, 张璇, 张亚忠, 崔伟. 类风湿性关节炎与骨质疏松症和骨密度关系的孟德尔随机化分析[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(23): 3715-3721.
[12]	徐文飞, 明春玉, 梅其杰, 袁长深, 郭锦荣, 曾超, 段戡. 机器学习鉴定KDELR3作为骨关节炎缺氧特征基因的实验验证[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(21): 3431-3437.
[13]	谢越, 翟伟峰, 郭际, 贾永伟. 椎间盘退变相关焦亡基因的综合分析[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(21): 3438-3444.
[14]	袁长深, 廖书宁, 李哲, 吴思萍, 陈乐伟, 刘晋邑, 李彦宏, 段戡. 机器学习联合生物信息学鉴定骨关节炎细胞衰老关键基因及验证[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(20): 3196-3202.
[15]	史榴, 梁鹏晨, 常庆, 宋二红. 机器学习在医用金属材料特性研究中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(17): 2766-2773.