针刺治疗腹泻型肠易激综合征模型大鼠结肠黏膜差异蛋白质组学分析

doi:10.12307/2024.421

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (26): 4129-4136.doi: 10.12307/2024.421

• 组织构建实验造模 experimental modeling in tissue construction • 上一篇下一篇

针刺治疗腹泻型肠易激综合征模型大鼠结肠黏膜差异蛋白质组学分析

刘婧，梁芳园，李佳，王华

湖北中医药大学针灸骨伤学院，湖北省武汉市 430061

收稿日期:2023-06-25 接受日期:2023-07-27 出版日期:2024-09-18 发布日期:2023-09-28
通讯作者: 李佳，博士后，教授，湖北中医药大学针灸骨伤学院，湖北省武汉市 430061
作者简介:刘婧，女，1990年生，湖北省武汉市人，汉族，2015年华中师范大学毕业，硕士，实验师，主要从事中药及针灸效应基础的研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81804165)，项目负责人：李佳；湖北省自然科学基金面上项目(2023AFB960)，项目负责人：李佳；湖北省教育厅科学研究计划资助项目(Q20202005)，项目负责人：刘婧

Mechanisms of acupuncture in the treatment of irritable bowel syndrome with diarrhea based on proteomics

Liu Jing, Liang Fangyuan, Li Jia, Wang Hua

Acupuncture-moxibustion and Orthopedic College, Hubei University of Chinese Medicine, Wuhan 430061, Hubei Province, China

Received:2023-06-25 Accepted:2023-07-27 Online:2024-09-18 Published:2023-09-28
Contact: Li Jia, MD, Professor, Acupuncture-moxibustion and Orthopedic College, Hubei University of Chinese Medicine, Wuhan 430061, Hubei Province, China
About author:Liu Jing, Master, Experimentalist, Acupuncture-moxibustion and Orthopedic College, Hubei University of Chinese Medicine, Wuhan 430061, Hubei Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81804165 (to LJ); Natural Science Foundation of Hubei Province (General Program), No. 2023AFB960 (to LJ); Hubei Provincial Department of Education Scientific Research Program, No. Q20202005 (to LJ)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

差异蛋白质组学：它是通过寻找各种因素引起的蛋白质表达差异，以解释细胞生理和病理机制。即主要通过比较分析不同状态下或近似物种间蛋白质的表达图谱，实现对体系内代谢调控的动态监测，从而揭示机体对内外界环境变化产生反应的本质规律。
“标本配穴”针刺：湖北中医药大学王华教授创新性地提出标本配穴法，通过以固护正气的腧穴和祛除病邪的腧穴配伍，实现对症状性器官病变进行局部调节(通邪)和机体全身进行整体调节作用(固本)，通过局部效应和整体效应的整合，发挥更好的固本通邪作用。

背景：肠易激综合征作为临床常见的消化功能紊乱性疾病，已成为针灸治疗的优势病种，但其作用机制尚未明确。组学技术的方法学特点与针灸作用多靶点、多层次的特点不谋而合，为揭示针灸治疗疾病的作用原理提供可能。

目的：基于蛋白质组学研究腹泻型肠易激综合征(diarrhea-irritable bowel syndrome，IBS-D)的发病机制及“标本配穴”针刺对其的治疗作用机制。
方法：12只3月龄SPF级SD大鼠随机分为正常组、模型组、“标本配穴”针刺组，后2组采用急性应激与慢性应激相结合的方法制备IBS-D大鼠模型；造模成功后针刺组选取双侧足三里穴、双侧内关穴及关元穴进行针刺治疗，频率为120次/min，每隔4 min行针1 min，留针15 min，每隔6 d休息1 d，共持续28 d。正常对照组和模型组大鼠不给予任何干预。通过检测大鼠腹部回撤反射(AWR)压力阈值评价大鼠内脏敏感性；使用基于高效液相色谱-串联质谱联用平台(LC-MS/MS)的非标记蛋白质组学方法进行大鼠结肠黏膜蛋白质组的测定分析；运用MaxQuant、Perseus软件和DAVID、KOBAS、VENNY、STRING在线分析工具进行蛋白质搜库、差异蛋白搜索及其他生物信息学分析；采用网络可视化软件Cytoscape 3.7.1构建关联网络图。

结果与结论：①IBS-D组与正常组相比有47个差异表达蛋白；差异蛋白功能分析显示，IBS-D的致病机制与能量代谢的异常加剧、结肠运动功能失衡、内脏敏感性的增加等有关；与IBS-D疾病相关的重要靶标蛋白包括：Atp5a1、Atp5c1、Idh3b、Atp2a3、Pdhb、Ppp1ca及Mapk3。②“标本配穴”针刺组与模型组相比较有61个差异表达蛋白，其中针刺逆转了IBS-D 9个差异表达蛋白的上调和9个差异表达蛋白的下调。③生物信息学分析结果表明“标本配穴”针刺对IBS-D的干预效应具有多靶点、多途径、多通路的特点，能够逆转IBS-D对正常能量代谢的损伤，同时能发挥抗氧化应激保护及抗炎的作用而达到缓痛、调节肠道失衡及肠屏障功能的治疗效果；与“标本配穴”针刺干预机制相关的重要靶点为Atp5a1、Atp5c1、Pdhb、Sars、Uqcrc2、Prdx2、Prdx4、Ppp1ca、Manf和Tmsb4x3。④该研究从整体蛋白质表达的角度初步明确了IBS-D致病的分子机制及“标本配穴”针刺对IBS-D的潜在作用机制，为“标本配穴”选穴配伍奠定了基础。

https://orcid.org/0009-0008-4541-0712(刘婧)；https://orcid.org/0000-0003-0444-2263(李佳)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 腹泻型肠易激综合征, IBS-D, 标本配穴, 针刺, 蛋白质组学, 生物信息学分析

Abstract: BACKGROUND: As a common clinical digestive disorder, irritable bowel syndrome becomes an advantageous disease of acupuncture treatment. However, the therapeutic mechanisms remain unclear. The methodological characteristics of omics coincide with the multi-target and multi-level characteristics of acupuncture, providing the possibility of revealing the principle of acupuncture in the treatment of the disease.
OBJECTIVE: To investigate the pathogenesis of irritable bowel syndrome with diarrhea (IBS-D) and the effect of acupuncture at the combined points (selected based on etiologies and symptoms) on IBS-D based on proteomics.
METHODS: Twelve 3-month-old male Sprague-Dawley rats were randomly divided into three groups: a control group, an IBS-D model group and an acupuncture group. The IBS-D rat models were prepared using the CAS method. After successful modeling, bilateral Zusanli points, bilateral Neiguan points and Guanyuan points were selected for acupuncture treatment in the acupuncture group, with a frequency of 120 times/minute, 1 minute of acupuncture every 4 minutes, and 15 minutes of needle retention, at an interval of 1 day every 6 days, for 28 days in total. Rats in the normal control group and the model group were not given any intervention. The pressure threshold of rat abdominal retraction reflex was measured to evaluate the visceral hypersensitivity of rats. Proteomics analysis was performed using the liquid chromatography-tandem mass spectrometry -based platform. MaxQuant software, Perseus software and DAVID, KOBAS, VENNY, STRING online tools were used for the bioinformatics analysis of proteomic data. Visualization analysis was done using Cytoscape 3.7.1 software.
RESULTS AND CONCLUSION: There were 47 differentially expressed proteins between the IBS-D model and control groups. Function analysis of differentially expressed proteins revealed that the pathogenic mechanism of IBS-D was associated with abnormal energy metabolism, the imbalance of colon motor function and increased visceral sensitivity. Important proteins related to IBS-D pathogenesis included Atp5a1, Atp5c1, Idh3b, Atp2a3, Pdhb, Ppp1ca and Mapk3. Sixty-one differentially expressed proteins were identified between the acupuncture group and IBS-D model group. Acupuncture at the combined points reversed the up-regulation of nine differentially expressed proteins and the down-regulation of nine differentially expressed proteins. Bioinformatics analysis revealed that acupuncture at the combined points for IBS-D could function via multi-targets and multi-pathways, reverse the damage of energy metabolism caused by IBS-D, and play a role against oxidative stress and inflammation, thereby relieving pain and regulating the imbalance of intestinal function. Important proteins related to acupuncture effects included Atp5a1, Atp5c1, Pdhb, Sars, Uqcrc2, Prdx2, Prdx4, Ppp1ca, Manf and Tmsb4x3. All these findings preliminarily illustrate the potential molecular mechanisms of IBS-D and the effect of acupuncture at the combined points in the treatment of IBS-D at the protein level, which provide a basis for the clinical application of acupuncture at the combined points.

Key words: irritable bowel syndrome with diarrhea, IBS-D, the combined use of points based on etiologies and symptoms, acupuncture, proteomics, bioinformatics analysis

中图分类号:

刘婧, 梁芳园, 李佳, 王华. 针刺治疗腹泻型肠易激综合征模型大鼠结肠黏膜差异蛋白质组学分析[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(26): 4129-4136.

Liu Jing, Liang Fangyuan, Li Jia, Wang Hua. Mechanisms of acupuncture in the treatment of irritable bowel syndrome with diarrhea based on proteomics[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(26): 4129-4136.

图/表（结果） 10

2.1 实验动物数量分析实验过程中3组SD大鼠共12只，均无脱失。
2.2 IBS-D模型大鼠内脏敏感性明显增高 AWR评价结果显示，造模前引起各组大鼠抬腹和拱背的压力阈值差异无显著性意义(P > 0.05)；造模后，与正常大鼠相比较，引起IBS-D大鼠抬腹和拱背的压力阈值均显著降低(P < 0.01)，证明内脏敏感性升高，IBS-D大鼠造模成功，见图1。

2.3 与IBS-D疾病及“标本配穴”针刺效应相关的差异表达蛋白分析将LC-MS/MS液相色谱质谱联用仪所获得的数据通过Maxquant和Perseus软件进行蛋白搜库和差异蛋白筛选。3组样本中共检测出962个蛋白质，使用Persues软件(|Fold Change|> 1.2，P < 0.05)筛选得到不同比较组间的差异表达蛋白。结果显示，模型组与正常对照组相比共有47个差异表达蛋白，其中上调的蛋白有33个，下调的蛋白有14个；针刺组与模型组相比共有61个差异表达蛋白，其中上调的蛋白有42个，下调的蛋白有19个。模型组vs.正常对照组与针刺组vs.模型组差异蛋白的聚类及表达情况见图2。

通过维恩分析探究不同比较组间差异蛋白的重叠关系。结果显示，模型组vs.正常对照组与针刺组vs.模型组有18个共有的差异表达蛋白(调控方向相反)，这18个差异蛋白与“标本配穴”针刺治疗IBS-D的效应机制密切相关。进一步分析显示，针刺可逆转模型组9个差异表达蛋白的上调和9个差异表达蛋白的下调，见图3，表1。其中包括5个与能量代谢相关的蛋白(Atp5a1、Atp5c1、Pdhb、Sars、Uqcrc2)、2个与细胞抗氧化应激保护相关的蛋白(Prdx2、Prdx4)以及与平滑肌功能相关的 3个蛋白(Ppp1ca、Manf、Tmsb4x)。说明针刺对IBS-D的调控效应可能与能量代谢及抗氧化应激保护相关。

2.4 差异表达蛋白GO功能富集分析为了进一步探究IBS-D致病分子机制及“标本配穴”针刺的效应机制，对差异表达蛋白进行了GO功能聚类分析。结果显示，模型组vs.正常对照组中，生物过程主要涉及细胞质翻译、翻译、蛋白折叠、蛋白N-连接糖基化、糖胺代谢过程等；细胞组分主要涉及胞质、黑素小体、细胞外泌体、胞质核糖体、细胞质大核糖体亚单位等；分子功能主要涉及RNA结合、GTP结合、蛋白结合、GTP酶活性、硫氧还蛋白过氧化物酶活性等。针刺组vs.模型组差异蛋白GO聚类中生物过程主要涉及三羧酸循环、细胞应激反应、超氧自由基清除、线粒体ATP合成耦联质子转运、单元投影组装等；细胞组分主要涉及细胞外泌体、胞质、线粒体基质、黏着斑、黑素小体等；分子功能主要涉及RNA结合、GTP结合、蛋白结合、GTP酶活性、硫氧还蛋白活性等。各组生物过程、细胞组分、分子功能3个分支富集显著性排名前10的条目见图4；各组富集显著性排名30的GO组见图5。

2.5 与IBS-D疾病及“标本配穴”针刺效应相关的代谢通路及靶点分析使用David及KOBAS数据库对不同比较组间的差异蛋白进行KEGG代谢通路分析。检索结果显示，模型组vs.正常对照组的差异蛋白总共涉及62条信号通路，富集显著性排名前20的KEGG代谢通路见图6，包括糖尿病性心肌病、心肌细胞肾上腺素信号、心肌收缩、cGMP-PKG、cAMP信号通路、肌动蛋白细胞骨架调节等与平滑肌功能相关的信号通路。利用Cytoscape软件对富集显著性较高的信号通路进行可视化分析，构建“代谢通路-靶点”网络图，见图7。拓扑分析显示，此网络共有61个节点，80条边。度值排名前10位的靶点为：Uqcrc2、Mapk3、Atp2a3、Ppp1ca、Atp5a1、Atp5c1、Gfpt1、Pdhb、Atp6v1e1、Rpl8，其中Ppp1ca与Mapk3的度值最大，参与的代谢通路最多。Ppp1ca为苏氨酸蛋白磷酸酶亚单位，与肌肉收缩及蛋白合成相关，此蛋白在正常组和针刺组表达，在模型组并未检测到。Mapk3参与MAPK信号通路，此通路被证实与内脏敏感性相关。Ppp1ca与Mapk3的表达调控可能与IBS-D的致病机制及“标本配穴”针刺的调控作用相关。

针刺组vs.模型组差异蛋白总共涉及62条信号通路，其中糖尿病性心肌病、柠檬酸循环、化学致癌作用-活性氧、朊病毒病、亨廷顿舞蹈病、氧化磷酸化、肾细胞癌、非酒精性脂肪性肝病、内吞作用、肌萎缩侧索硬化症等为富集度较高的代谢通路。利用Cytoscape软件对富集显著性排名前20的信号通路进行可视化分析，构建“代谢通路-靶点”网络图，见图7。此网络包含47个节点，115条边。度值排名前10位的靶点为：Sdha、Uqcrc2、Ndufs1、Rac1、Atp5a1、Atp5c1、Sod1、Cdc42、Rap1a、Rap1b。
2.6 “标本配穴”针刺对IBS-D的效应机制与能量代谢及抗氧化应激保护相关为了探究差异蛋白之间的相互作用关系，通过STRING数据库和Cytoscape 3.7.1软件构建蛋白-蛋白相互作用网络(protein-protein Interactions，PPI)。模型组vs.正常对照组47个差异蛋白中有39个参与了蛋白互作网络。此网络共有39个节点，80条边，见图8。MCL聚类分析鉴定出11个蛋白簇。其中有1个与能量代谢相关的蛋白簇差异蛋白的数量最多，包含Atp5a1、Atp5c1、Pdhb、Uqcrc2、Atp6v1e1、Atp2a3、Idh3B，此蛋白簇的蛋白表达均发生了下调，见图8。使用Network Analyzer分析工具进行网络拓扑分析，结果显示，度值排名前10位的关键蛋白分别为：Atp5a1、Atp5c1、Canx、Rpl8、Rpl23a、Rpn1、Rps12、Cct4、Rpl19、Idh3b。

针刺组vs.模型组的61个差异蛋白中有47个蛋白存在相互作用关系。此PPI网络共有47个节点，121条边。MCL聚类分析显示网络包含11个蛋白簇，其中有2个蛋白簇的差异蛋白数量最多，可能与“标本配穴”针刺的干预效应密切相关。第1个蛋白质簇由与能量代谢相关的10个蛋白质组成，包括Aco2、Atp5c1、Uqcrc2、Sdha、Idh3a、Ndufs1、Pdhb、Atp5a1、Mt-nd5和Sars，见图8；此蛋白簇的蛋白均发生了下调，表明“标本配穴”针刺逆转了IBS-D所造成的能量代谢的损伤。第2个蛋白簇由与细胞抗氧化应激保护相关的6个蛋白质组成，包括Grn、Prdx1、Prdx2、Prdx4、Sod1和Txnl1，此蛋白簇的蛋白均发生了上调，可能是针刺干预IBS-D发挥抗氧化应激保护及抗炎的作用的机制之一。网络拓扑分析结果显示，此网络中度值排名前10位的关键蛋白为：Atp5a1、Aco2、Uqcrc2、Sdha、Sod1、Ndufs1、Pdhb、Idh3a、Rpsa和Npm1。

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引言

肠易激综合征(irritable bowel syndrome，IBS)是以腹痛或腹部不适、大便性状和排便习惯的改变为特征的消化道疾病，常伴情绪异常，如烦躁易怒、情绪低落甚至抑郁[1-2]。目前，现代医学对于IBS的治疗主要包括饮食改变、心理疗法、药物治疗等，但IBS的治疗依然面临靶点单一、用药效果个体化差异大、难以实现脑肠同治、不良反应大、易复发等缺点 [3-4]。针灸治疗IBS疗效确切，配穴及组方多样，并且疗效优于常规药物。近年来，IBS已成为针灸治疗的优势病种。研究表明针刺和艾灸可降低IBS患者内脏高敏感性，缓解内脏疼痛，改善排便异常，更是具有安全性高、作用力强、随证变化灵活性高等特点，并且不良反应发生率更小[5-7]。Meta分析证实针刺治疗IBS疗效明显优于西药，且复发率更低[8]。
并且，实验研究发现，“标本配穴”针刺可以改善腹泻型肠易激综合征(diarrhea-irritable bowel syndrome，IBS-D)大鼠一般体征、内脏高敏感性及肠组织形态学[9]，标本配穴针灸还能够同时调节血清、心脏、肠道的亚油酸代谢，参与免疫应答、神经中枢的调节等，从而起到防治IBS的作用[10]。这些研究揭示了“标本配穴”的部分效应机制与理论内涵，但要全面系统地解释其科学机制，还有待进一步研究。系统生物学的发展产生了海量的基因组、转录组、蛋白质组和代谢组等组学数据。组学的方法学特点与针灸研究多靶点、多层次、多指标的特点不谋而合。蛋白质是生理功能的执行者，蛋白质功能的研究可直接阐释疾病的发生和病理变化机制，因此蛋白质组学的研究值得关注。目前，有关从蛋白质组学技术研究针灸治疗IBS的研究较少。课题基于前期针刺对胃肠功能调节的研究成果[8-14]，以急性应激与慢性应激相结合的方法制备IBS-D大鼠模型，以“标本配穴”针刺进行干预，使用基于LC-MS平台的蛋白质组学技术进行结肠黏膜蛋白质组测定。通过差异蛋白组分析寻找与IBS-D疾病相关的蛋白标志物，从整体蛋白表达的层面揭示“标本配穴”针刺对IBS-D的效应机制，为“标本配穴”选穴配伍防治IBS-D提供实验依据，为进一步深化腧穴配伍防治IBS研究提供思路。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验，组间比较进行Student’s t-test(双尾t检验)。
1.2 时间及地点实验于2021年3-10月在湖北中医药大学黄家湖校区实验动物中心及昙华林校区针灸骨伤学院实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 3月龄SPF级雄性SD大鼠12只，购自三峡大学，实验动物生产许可证编号：SCXK2017-0012。所有动物饲养于温度20-25 ℃和湿度为45%-55%较为恒定的动物饲养室，光照时间为每日12 h，动物可自由摄食和饮水。该实验经湖北中医药大学实验动物伦理委员会批准，编号NO.00287332。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。实验动物在麻醉下进行所有的手术，并最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。
1.3.2 材料和试剂针灸针(规格：0.30 mm×13 mm，华佗牌)；PBS试剂(货号G4202-500ML，Servicebio)；RIPA裂解液(批号：P0013B，Beyotime)；PMSF(货号：ST507，Beyotime)；尿素(货号：U0631-500G，Sigma-Aldrich)；甲醇(A452-4，ThermoFisher)；碳酸氢铵(货号：CAEQ-4-013493-4000，CNW)；二硫苏糖醇(货号：D9779-1G，Sigma-Aldrich)；碘乙酰胺(货号：I1149，Sigma-Aldrich)；胰蛋白酶(批号：T7409，Sigma-Aldric)；乙腈(货号：A955-4，ThermoFisher)；甲酸(货号：CAEQ-4-014784-0500，CNW)。
1.3.3 主要仪器台式冷冻离心机(型号：Allegra X-30R，Beckman)；高效液相色谱仪(型号：Ultimate 300，Dionex Corp，Sunnyvale，CA)；质谱仪(型号：Q-Exactive Plus，Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA)。
1.4 实验方法

1.4.1 IBS-D大鼠模型构建所有大鼠适应性饲养1周，根据简单随机排序法分为正常对照组、IBS-D模型组(模型组)、“标本配穴”针刺组(针刺组)，每组4只。正常对照组大鼠正常饲养不给予任何干预，模型组及针刺组大鼠采用CAS法制备IBS-D模型。以急性应激与慢性应激相结合的CAS方法制备IBS-D大鼠模型，参照文献方法将大鼠暴露于7种不同的压力源[15]：①缺水24 h；②食物剥夺24 h；③夹尾巴1 min；④暴露于45 ℃环境5 min；⑤在4 ℃水中游泳3 min；⑥白天和夜晚倒置12 h/12 h；⑦水平振动(120 r/min)45 min。所有应激方案每7 d随机应用，持续3周，其中连续2 d无重复特定的压力源，之后休息1周，在第28天进行急性束缚应激，包裹肩部、上肢前肢和胸廓1 h。

1.4.2 大鼠内脏敏感性评价通过测定大鼠造模前后腹部回撤反射(abdominal withdrawal reflex，AWR)压力阈值，评价各组大鼠肠道的敏感性[16]。首先，用三通管连接血压计、针管及自制指套。然后将大鼠保持清醒放入固定器内，将气囊经大鼠肛门插入并固定，深度约5 cm。待大鼠适应后慢慢打气使肠道扩张，观察血压计计数，记录大鼠抬腹及拱背的疼痛压力阈值(mmHg)，每次进行3次测量取平均值。抬腹腹背部肌肉出现收缩但腹部未抬离地面，AWR评分为2分；拱背腹部肌肉强烈收缩，腹部呈弓形并把腹部、会阴部抬离地面，AWR评分为4分。大鼠的疼痛压力阈值越低，代表内脏敏感性越高。
1.4.3 针刺干预方法在第28天造模完成后，对针刺组大鼠进行针刺治疗。参照《实验针灸学》以及中国针灸学会制定的“大鼠针灸穴位图谱”，选取双侧足三里穴、双侧内关穴及关元穴[17]。针刺使用0.30 mm×13 mm华佗牌毫针直刺，针刺得气后进行手法行针，平补平泻，频率为120次/min，每隔4 min行针1 min，留针15 min，每隔6 d休息1 d，共持续28 d。正常对照组和模型组大鼠不给予任何干预。
1.4.4 蛋白组样品准备干预结束后，所有大鼠禁食12 h，使用异氟烷和氧气混合气体对大鼠进行气体麻醉(异氟烷体积分数为3%)，采用脊椎脱位法处死。在降结肠段取约2 cm长的近端结肠组织，用含有蛋白酶抑制剂的PBS清洗后纵向切开[18]。用锐利的刀片小心刮下黏膜组织，避免肌肉层的污染，使用液氮速冻后将取得的组织保存于-80 ℃冰箱备用。
1.4.5 蛋白质提取及酶解每个样品取20 mg的结肠黏膜组织用于蛋白质提取。用预冷的PBS清洗冻存组织后放入预冷的研钵中，加入液氮迅速研磨至粉末状。向研磨好的组织中加入200 μL裂解缓冲液(1 mL RIPA；10 μL PMSF)，混匀后于室温静置2 min，4 ℃静置10 min，4 ℃、12 000 r/min离心20 min后收集上清液。向100 μL上清液中加入400 μL预冷甲醇，混匀后置于-20 ℃过夜。然后于4 ℃、12 000 r/min离心20 min，收集沉淀。向沉淀中加入120 μL尿素、28 μL水、8 μL 1 mol/L的碳酸氢铵和4 μL 1 mol/L的二硫苏糖醇，混匀后于37 ℃静置2 h，然后加入8 μL 1 mol/L的碘乙酰胺，于室温避光静置1 h。使用胰蛋白酶将蛋白质酶解成肽段。酶解完成后使用C18固相萃取柱对所有蛋白样品进行脱盐。
1.4.6 高效液相色谱-质谱联用分析(LC-MS/MS) 使用Ultimate 3 000高效液相色谱与Q-Exactive Plus质谱进行LC-MS/MS分析。样品进入色谱系统后，以0.2 mL/min的流速通过C18 反相色谱柱(流动相A：5%乙腈，0.1%甲酸；流动相B：95%乙腈，0.1%甲酸)。设定75 min的线性梯度进行洗脱分离：0 min，5% B；3 min，5% B；48 min，50% B；55 min，80% B；60 min，80% B；65 min，5% B；75 min，5% B。采用DDA法分析洗脱的多肽，样品之间采用洗涤柱法，以避免蛋白质滞留在柱中。数据采集采用正极性模式，测量扫描范围为200-2 000 m/z，测量扫描分辨率为70 000，MS/MS光谱分辨率为17 500。强度阈值(定义触发MS2扫描的最小前兆强度)设置为1.6×105。
1.5 主要观察指标
1.5.1 蛋白质鉴定及定量运用MaxQuant软件(1.6.1.0版本)对MS/MS数据进行蛋白质搜索鉴定及非标记定量分析(LQF)[19]。设置参数如下：Precursor mass tolerance：20 ppm；Fragment mass tolerance：0.1 Da；Trypsin/P: up to two missed cleavage；Variable modifications：oxidation (M)，acetylation (protein N-term)；Protein level false-discovery rate (FDR)：1%；LFQ min number of neighbors：3；LFQ average number of neighbors：6。
1.5.2 生物信息学分析运用Perseus软件(1.6.7.0版本)搜索不同比较组间的差异表达蛋白(DEPs)，然后对差异蛋白进行一系列的生物信息学分析。使用DAVID在线分析工具[Nature Protocols 2009; 4(1):44 & Nucleic Acids Res. 2009; 37(1):1.] 将Maxquant软件获取的基因RefSeq ID转化成Gene Symbol；使用VENNY 2.1.0软件(Available from: http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/ index. html)分析各组间差异蛋白的重叠关系；运用DAVID及KOBAS在线分析工具对差异蛋白进行GO功能聚类分析及KEGG代谢通路聚类分析；运用STRING 11.0(http://stringdb.org/)数据库进行蛋白质相互作用分析；使用微生信在线分析工具绘制气泡图及热图；通过Cytoscape 3.7.1软件对生物信息学结果进行可视化分析，网络构建，并使用Network Analyzer分析工具进行网络拓扑分析。
1.6 统计学分析差异表达蛋白的筛选条件设置为|Fold change|≥1.2，P < 0.05。组间差异分析采用Student’s t-test(双尾t检验)，以P < 0.05视为差异有显著性意义。该文章的统计学方法已经湖北中医药大学生物统计学专家审核。

讨论

IBS作为临床常见的消化功能紊乱性疾病，已成为针刺治疗的优势病种。根据RomaⅣ标准，按照腹痛、腹泻、腹胀及排便习惯、性状改变等主要症状的不同，临床上将IBS分为腹泻型(IBS-D)、便秘型(IBS-C)和腹泻便秘交替型(IBS-M)。IBS-D的主要大便模式为多于25%的稀便和少于25%的硬便。IBS-D是肠易激综合征中最常见的亚型，影响了约40%的患者 [20-21]。现代医学认为IBS的发生与脑-肠轴异常、肠道动力不足、精神心理应激、免疫和内分泌紊乱等多因素有关，其中精神心理是非常重要的因素[22]。中医中IBS-D的临床表现类似于“肠郁”。《中国临床诊疗术语》中将“肠郁”定义为：“因情志不舒，气机阻滞，使肠道运化失常，以腹痛、腹泻或便秘为常见表现的郁病类疾病”，认为心神失养、肝郁、脾胃虚弱、肺失宣降及阳虚都是重要病机。由此可见，IBS-D病机关键是心神失调、气机紊乱、肠腑失司，其病位在大肠和小肠，与表里脏腑心和肺密切相关。古代针灸治疗肠病的记载颇多，《扁鹊神应针灸玉龙经》：“内关：肠鸣冷痛……”。《针灸大成》：“腹内疼痛：内关，足三里，中脘”以及“伤寒不解胸膛，疟疾内关独当”。《玉龙歌》：“腹中气块痛难当，穴法宜向内关防”。《针灸甲乙经》：“奔豚寒气入小腹……后泄不止，关元主之”。《医宗金鉴》提出关元穴主治“诸虚肾积，老人泄泻”。《普济方》：“治腹泻不止，穴关元。”由此可见，除治疗肠腑病证穴位外，内关和关元也是古代应用较多的穴位。
“标本配穴”针刺法是一种以固护人体先天之本和后天之本为主，疏通经脉、祛除病邪的腧穴配伍方法，主张在治疗疾病时辨证灵活选用标穴(阿是穴或随证取穴)，直捣病灶，直驱病邪，通调经络，调节脏腑气血；再配伍具有固护先天元气和固护后天脾胃之气的本穴(强壮穴)。“标本配穴”腧穴配伍方法在选穴配穴中注重对元气与胃气即先天与后天之气的固护，起到防病治病的作用[23]。足三里为常用保健要穴，不仅具有健脾和胃、补益气血、固护后天的作用，还可运化水湿、疏导肠腑气机，集补泻于一穴之中；内关穴为心包经的络穴及八脉交会穴，通阴维脉，且心包经其循行“历络三焦”，阴维主一身之里，相合于胃、心、胸部，调节情志失和、气机阻滞相关病证，具有宽胸理气、宣通三焦的功效；关元穴也是保健要穴之一，为小肠的募穴，关藏元气，可培本益元、调理肠腑，兼顾补泻之功。三穴合用，既能固护正气以增强机体抗邪能力，又可疏导经气以调理脏腑功能，同时兼顾调养心神以舒畅情志，符合现代整体医学治病理念。以往实验研究证明，IBS-D模型大鼠会造成内脏敏高感性及大便模式的改变，而“标本配穴”针刺对IBS-D大鼠内脏敏感性、粪便含水量、粪便性状、精神状态等方面均有较好的调节作用 [8-9，11]。但如何系统整体研究有待进一步挖掘，其对机体相关脏腑功能的调节作用是否有一定的规律和途径？这正是此次研究拟探讨的关键科学问题。
中医讲究以整体观念去分析和治疗疾病，针灸作用的途径和靶点都是多样的。因此，采用单因素分析方法和检测技术并不适合中医学整体治疗的特点。系统生物学的发展产生了基因组、转录组、蛋白组、代谢组等组学技术，可成为研究中医“复杂科学”的强大工具，为揭示中医治疗疾病的作用原理等问题提供可能[24]。蛋白质是生理功能的执行者，是生命现象的直接体现者，对蛋白质结构和功能的研究将直接阐明生命在生理或病理条件下的变化机制。蛋白质组学其本质上指的是在大规模水平上研究蛋白质的特征，由此获得蛋白质水平上的关于疾病发生、细胞代谢等过程的整体而全面的认识，与中医的整体观不谋而合。因此，与蛋白质组学研究方法相结合，比较分析生物体整体蛋白质水平的变化，可以较全面系统地揭示针灸疗法的科学内涵。目前已有一些课题组运用基于质谱的技术开展IBS机制的研究。Goo研究团队[25]运用液相色谱-串联质谱的方法对不同分组的IBS患者进行了尿液蛋白质组分析，结果发现与正常对照组相比，高疼痛组患者的尿液中发生了凝胶溶素蛋白的过表达，IBS各组患者尿液中均出现了三叶因子的过表达。PATEL 团队[26]运用质谱技术对22例患有IBS儿童的呼吸样本进行蛋白质组测定，并与55位健康儿童的样本作为对照进行比对分析，结果显示有4种分子标志发生了过表达，分别是：二甲基硫醚、正辛烯、甲基已烷和苯。李依洁团队[27]发现， IBS-D模型大鼠的肠组织及海马组织与正常大鼠相比均存在与调节肠道黏膜与菌群环境、动力、炎症、免疫和神经等相关的蛋白质表达异常。
蛋白组数据分析结果显示，不同组大鼠结肠黏膜整体蛋白表达情况具有显著差异。IBS-D组与正常组相比有47个差异表达蛋白。通过STRING数据库构建差异蛋白PPI网络分析差异蛋白间的相互作用关系，并筛选出了网络中最关键的10个节点(Atp5a1、Atp5c1、Canx、Rpl8、Rpl23a、Rpn1、Rps12、Cct4、Rpl19、Idh3b)。MCL聚类分析显示有一个与能量代谢相关的蛋白簇(Atp5a1、Atp5c1、Pdhb、Uqcrc2、Atp6v1e1、Atp2a3、Idh3b)包含数量最多的差异蛋白，这个蛋白簇中的所有蛋白的表达均发生了上调，表明IBS-D的发生可能增加能量消耗或加剧分解代谢，造成能量代谢的异常，见图8。其中Idh3b和Atp2a3是镁离子依赖酶，催化ATP水解以及钙离子的转运，参与和肌肉兴奋/收缩相关的集钙，并且能相互作用；Atp5a1和Atp5c1是ATP合成酶亚单位，在存在跨膜质子梯度的情况下能催化ADP合成ATP，还可为Idh3b的催化反应供能；Pdhb可连接糖酵解与三羧酸循环途径，还可与Atp5a1及Atp5c1相互作用。IBS的发生与胃肠动力的异常有关；结肠运动功能紊乱、结肠平滑肌收缩异常都是IBS的重要特征。既往研究显示IBS-D患者存在结肠肌肉收缩频率增加、结肠传导加速以及肠道运动功能的改变[28-30]。IBS-D模型组中Idh3b与Atp2a3表达的上调可造成钙离子失衡而导致的肌肉收缩的异常，这也可能是IBS-D患者结肠运动功能失衡的机制之一。差异蛋白KEGG代谢通路聚类分析结果显示IBS-D涉及cGMP-PKG、cAMP信号通路、心肌收缩、肌动蛋白细胞骨架调节等多条代谢通路的改变。对关键代谢通路-靶标网络进行拓扑分析，结果显示，Ppp1ca与Mapk3为参与代谢通路数量最多的蛋白。Ppp1ca属于苏氨酸蛋白磷酸酶亚单位，与细胞分裂、糖原代谢调控、肌肉收缩及蛋白合成密切相关，此蛋白在正常组和针刺组表达，在模型组并未检测到，说明Ppp1ca的表达调控可能与IBS-D的致病机制及“标本配穴”针刺的调控作用相关。Mapk3参与MAPK信号通路，此通路被证实与内脏敏感性的调控相关。结肠上皮细胞NMDAR(天冬氨酸受体)的活化会引起下游MAPK-ERK信号途径的激活，MAPK-ERK及Akt信号通路的激活会导致大鼠扣带前回5-羟色胺受体的下调，而导致压力应激性内脏敏感性的形成，造成IBS患者的内脏敏感性增加[31]。因此，Mapk3蛋白的表达异常可能与IBS-D的致病机制相关。
“标本配穴”针刺组与模型组相比较有61个差异表达蛋白。维恩分析显示针刺可逆转IBS-D 9个差异表达蛋白的上调和9个差异表达蛋白的下调，其中包括5个与能量代谢相关的蛋白(Atp5a1、Atp5c1、Pdhb、Sars、Uqcrc2)和2个与细胞抗氧化应激保护相关的蛋白(Prdx2、Prdx4)，除此之外，还包括Ppp1ca、Manf和Tmsb4x这 3个重要的功能蛋白。Ppp1ca如上所述与平滑肌的收缩相关。Manf是内质网蛋白，与细胞增值的抑制和内质网压力诱导的细胞死亡相关。研究显示，Manf可缓解内质网压力，减轻内质网压力条件下的细胞毒性，保护心肌细胞免受内质网压力的损害，防止细胞凋亡[32]。Tmsb4x蛋白在细胞骨架的构建上发挥了重要的作用，它可与肌动蛋白结合，抑制肌动蛋白聚合活性，可能与肠道平滑肌功能相关。“标本配穴”针刺组vs.模型组差异蛋白PPI网络聚类分析提示，其中有2个差异蛋白数量最多的蛋白簇与针刺对IBS-D的干预机制密切相关。第一个蛋白簇包含与能量代谢相关的10个差异蛋白。与IBS-D组相比，这些蛋白均发生了下调(见图8)，说明“标本配穴”针刺可在一定程度上逆转IBS-D造成的正常能量代谢的损伤。第二个蛋白簇包含与炎症、伤口修复、细胞抗氧化应激保护相关的6个蛋白质。其中Prdx1，Prdx2 及Prdx4与细胞抗氧化应激保护相关；Sod1可破坏细胞内具有生物系统毒性的自由基，并且可与Prdx1，Prdx2及Prdx4相互作用；Grn是一种颗粒体蛋白，可能参与炎症、伤口修复及组织重建。针灸镇痛是传统中医疗法，针灸治疗急性及慢性疼痛具有较好的临床疗效且无不良反应。研究表明针灸镇痛的机制与细胞抗氧化应激保护相关[33-35]。针刺组中Prdx1、Prdx2、Prdx4、Sod1及Grn表达的上调可能是“标本配穴”针刺干预IBS-D发挥缓痛、调节肠道失衡及肠屏障功能的机制之一。“标本配穴”针刺组vs.IBS差异蛋白PPI网络及关键代谢通路-靶标网络中度值排名前10位的蛋白基本包含于上述两个蛋白簇中。
综上所述，该研究首次运用基于LC-MS平台的蛋白质组学检测技术，从大鼠结肠黏膜整体蛋白质表达的层面探讨针刺治疗腹泻型肠易激综合征的分子机制，寻找IBS-D疾病的蛋白质分子标志。结果发现IBS-D的致病机制与能量代谢的异常加剧、结肠运动功能失衡、内脏敏感性的增加等有关；而“标本配穴”针刺对IBS-D的干预效应具有多靶点、多途径、多通路的特点，能够逆转IBS-D造成的正常能量代谢的损伤，同时能发挥抗氧化应激保护及抗炎的作用，而达到缓痛、调节肠道失衡及肠屏障功能的治疗效果。该研究为“标本配穴”选穴配伍奠定了基础，为进一步深化腧穴配伍防治IBS研究提供思路，为临床应用提供新的实验依据。
不足与展望：该研究从整体蛋白表达的层面初步探讨了“标本配穴”针刺治疗腹泻型肠易激综合征的机制，揭示了其干预效应具有多靶点、多途径、多通路的特点，但其具体机制还有待进一步研究。下一步将在该研究的基础上结合多组学联合分析的方法及分子生物学技术验证开展更全面、深入的探究。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

针刺治疗腹泻型肠易激综合征模型大鼠结肠黏膜差异蛋白质组学分析

Mechanisms of acupuncture in the treatment of irritable bowel syndrome with diarrhea based on proteomics

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